劉琛楠，劉憶霜，肖春玲

·綜述·

天然產(chǎn)物來源的金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑

劉琛楠，劉憶霜，肖春玲

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國(guó)家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室

近年來，隨著包括耐萬(wàn)古霉素腸球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌、耐碳青霉烯銅綠假單胞菌、耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌在內(nèi)的多重耐藥菌的出現(xiàn)和傳播[1-12]，臨床使用的抗生素逐漸對(duì)其失效，使得細(xì)菌耐藥形勢(shì)越發(fā)嚴(yán)峻。并且治療這些耐藥菌感染的抗生素研發(fā)進(jìn)展緩慢，1970 年至今，僅有5 種新類型的抗生素上市，包括 2000 年上市的噁唑烷酮類藥物利奈唑胺（linezolid）[13-14]、2003 年上市的環(huán)脂肽類藥物達(dá)托霉素（daptomycin）[15-16]、2007 年上市的截?cái)鄠?cè)耳類藥物瑞他帕林（retapamulin）[17]、2012 年上市的二芳基喹啉類藥物貝達(dá)喹啉（bedaquiline）[18]和 2014 年上市的迪拉馬尼（delamanid）[19-20]。對(duì)已有抗生素的改造是藥物研發(fā)的另一種常用策略。例如，2018 年上市的 plazomicin[21]是西索米星（sisomicin）[22]的衍生物，在2016 年 12 月其臨床 III 期結(jié)果達(dá)到了 FDA 設(shè)定的，對(duì)復(fù)雜性尿路感染患者臨床試驗(yàn)中非劣效于美羅培南的試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，并且達(dá)到了歐洲藥監(jiān)局 EMA 對(duì)復(fù)雜性尿路感染和急性腎盂腎炎臨床III期試驗(yàn)設(shè)定的優(yōu)效試驗(yàn)終點(diǎn)。與西索米星相比，這類藥物安全性更好，且可避免多種氨基糖苷類抗生素鈍化酶對(duì)其進(jìn)行修飾，但仍無法有效克服耐藥菌已有的耐藥性，plazomicin 對(duì)于部分耐藥菌株的最低抑菌濃度（MIC）> 128 μg/ml。

在新型抗耐藥菌藥物匱乏，且結(jié)構(gòu)改造藥物不能有效克服細(xì)菌已有耐藥性的情況下，對(duì)能使已有抗生素恢復(fù)活性的抗生素增效劑的研究是抗耐藥菌藥物研發(fā)的另一有效途徑，其中最為成功的是 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。已上市的 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑有 3 種——克拉維酸、舒巴坦與他唑巴坦。該類增效劑與 β-內(nèi)酰胺類抗生素的聯(lián)合用藥可以顯著降低它們對(duì)大部分耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌和部分耐藥革蘭氏陰性菌的 MIC[23]。

β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床上廣泛使用的一類抗生素[24]，以化學(xué)結(jié)構(gòu)含有 β-內(nèi)酰胺核為標(biāo)志，包括被稱為“最后一道防線”的碳青霉烯類抗生素[25]，具有毒性低、適應(yīng)證廣的特點(diǎn)。然而，該類抗生素的長(zhǎng)期使用使得其耐藥情況越發(fā)嚴(yán)峻，其中 β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是細(xì)菌對(duì)其耐藥的主要機(jī)制之一。β-內(nèi)酰胺酶可分為以絲氨酸殘基為活性位點(diǎn)的絲氨酸 β-內(nèi)酰胺酶和活性中心存在一個(gè)或兩個(gè)鋅離子的金屬 β-內(nèi)酰胺酶（MBLs）兩種[26]。按照分子結(jié)構(gòu)分類，可將 β-內(nèi)酰胺酶分為 A、B、C、D 4 類，其中 A 類、C 類、D 類為絲氨酸 β-內(nèi)酰胺酶，B 類為金屬 β-內(nèi)酰胺酶，可以細(xì)分為 B1、B2、B3 3 個(gè)子類，B1 類金屬 β-內(nèi)酰胺酶活性部位含有兩個(gè)鋅離子，包括新德里金屬 β-內(nèi)酰胺酶（NDM）、維羅納金屬 β-內(nèi)酰胺酶（VIM）、碳青霉烯酶（IMP）、首爾亞胺培南水解酶（SIM）、圣保羅金屬 β-內(nèi)酰胺酶（SPM）等；B2 類 MBLs 是活性位點(diǎn)含有一個(gè)鋅離子的碳青霉烯酶，如 CphA；B3 類 MBLs 如 L1 等[27]。

引起細(xì)菌耐藥的 β-內(nèi)酰胺酶早期以 A 類 β-內(nèi)酰胺酶為主，故克拉維酸、舒巴坦與他唑巴坦均為絲氨酸 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑[28-31]，有效保證了 β-內(nèi)酰胺類抗生素的藥物活性。但 2008 年出現(xiàn)的新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1（NDM-1）[32]具有對(duì)亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類抗生素的抗性，可水解除氨曲南外的 β-內(nèi)酰胺類抗生素，且克拉維酸等絲氨酸 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑對(duì)其無抑制效果，其出現(xiàn)和廣泛傳播導(dǎo)致了嚴(yán)重的抗生素耐藥，因而急需對(duì) MBLs 抑制劑進(jìn)行研究。

早期研究的金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑以金屬螯合劑為主，但其對(duì)于體內(nèi)含鋅酶如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等有較低選擇性，影響其成藥前景，因而還需研發(fā)具有不同作用機(jī)制的金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。天然產(chǎn)物不僅是藥物的重要來源，更是獲取藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的重要途徑[33]，絲氨酸 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸是從鏈霉菌的發(fā)酵液中分離，舒巴坦與他唑巴坦是基于青霉素的母核 6-氨基青霉烷酸（6-APA）合成的[28-30]，且天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎，能從中獲得具有新機(jī)制的金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，目前天然產(chǎn)物來源的金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑已取得了一些進(jìn)展，按其作用機(jī)制綜述如下。

1 與鋅離子結(jié)合的抑制劑

由曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的天然產(chǎn)物曲霉明 A （aspergillomarasmine A，AMA）[34]是L-天冬氨酸的衍生物，含有 4 個(gè)羧酸基團(tuán)和 3 個(gè)含氮基團(tuán)，可通過螯合鋅離子快速有效抑制 NDM-1 和 VIM-2。AMA 與乙二胺四乙酸（EDTA，一種常見的金屬離子螯合劑）結(jié)構(gòu)相似，但毒性更低，約為其 1/5，其結(jié)構(gòu)如圖 1 所示，NDM-1 的蛋白結(jié)構(gòu)與 AMA-鋅離子復(fù)合物結(jié)構(gòu)如圖 2所示。AMA 對(duì) NDM-1 的 IC50為（4.0 ± 1.0）μmol/L，對(duì) VIM-2 的 IC50為（9.6 ± 2.4）μmol/L，并且 AMA 可恢復(fù)美羅培南對(duì)產(chǎn) NDM-1 或 VIM-2 的大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌的活性。

圖 1 曲霉明 A

圖 2 NDM-1 蛋白與美羅培南的晶體結(jié)構(gòu)（A）與曲霉明 A-鋅離子復(fù)合物結(jié)構(gòu)式（B）

在感染表達(dá) NDM-1 的肺炎克雷伯菌的小鼠中，10 mg/kg 美羅培南與 30 mg/kg 的AMA 聯(lián)合使用，亦有效地恢復(fù)了美羅培南的活性[35]。

在酶與 AMA 的混合液中，將 AMA 通過過濾去除，并添加過量硫酸鋅可恢復(fù)酶的活性，說明其與酶活性中心的鋅離子相互作用；但進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)研究顯示，AMA 與酶的相互作用不僅是簡(jiǎn)單地與鋅離子螯合，推測(cè)可能還有其他作用機(jī)制。Albu等[36]發(fā)現(xiàn)，AMA 在其自身幾乎所有手性中心變化的情況下，對(duì) NDM-1 仍保持了顯著的體外活性，使得對(duì) AMA 進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造更加便捷。目前已有更多學(xué)者對(duì) AMA 的全合成路線進(jìn)行研究[37-39]。

2 與酶保守活性位點(diǎn)殘基相互作用的抑制劑

Liu 等[40]通過酶抑制劑篩選發(fā)現(xiàn)，從木蘭樹皮分離得到的天然產(chǎn)物木蘭醇（圖 3）可抑制 NDM-1 酶的活性，其 IC50值為 6.47 μg/ml。木蘭醇在 32 μg/ml 的濃度下，與美羅培南聯(lián)合使用，可使重組工程菌3（NDM-1）、5（NDM-5）和7（NDM-9）的MIC 降低 4 倍。木蘭醇的動(dòng)物毒性研究表明，與金屬離子螯合劑相比，木蘭醇在小鼠和大鼠體內(nèi)并無臨床毒性征兆，且在 1 g/kg 的給藥劑量下，以比格犬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并無死亡。

圖 3 木蘭醇

木蘭醇-NDM-1 復(fù)合物分子對(duì)接結(jié)果提示，二者的相互作用可能包括范德華力、靜電作用、溶劑化作用等（圖 4），且木蘭醇本身并不影響 NDM-1 的穩(wěn)定性。其分子對(duì)接和點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木蘭醇通過直接結(jié)合在具有 110 ~ 200 個(gè)殘基的 NDM-1 催化口袋上，與 Ser217 形成氫鍵從而阻塞了 NDM-1 與美羅培南的結(jié)合，使 NDM-1 無法水解美羅培南。其中，Val73、Lys211、Leu218、Gly219 和 His250 有極強(qiáng)的結(jié)合能（ΔEtotal≤–2.0 kcal/mol），因此這可能是木蘭醇與 NDM-1 結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。除這 5 個(gè)殘基外，His189、Cys208、Asp212 和 Ser217 的結(jié)合能也較強(qiáng)（ΔEtotal≤–1.0 kcal/mol）。

圖 4 木蘭醇-NDM-1 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

3 既抑制鋅離子結(jié)合又與酶保守活性位點(diǎn)殘基相互作用的抑制劑

3.1 三環(huán)類天然產(chǎn)物

Payne 等[41]在 2002 年發(fā)現(xiàn)了一系列從毛殼菌中得到的三環(huán)天然產(chǎn)物對(duì)金屬 β-內(nèi)酰胺酶II 有抑制活性。其中化合物 SB238569 對(duì) IMP-1 的i 值為 17 μmol/L，對(duì)II的i 值為 79 μmol/L，對(duì)脆弱擬桿菌酶（CfiA）的i 值為3.4 μmol/L，在其以8 μg/ml 濃度與美羅培南聯(lián)用時(shí)，對(duì)含有 CfiA 的臨床分離菌株表現(xiàn)出良好的抗菌協(xié)同作用。

圖 5 SB236050

化合物 SB236050（圖 5）與 CfiA 復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（圖 6）顯示其羧酸基團(tuán)與鋅離子相互結(jié)合，并與 Lys184、Asn193、His162 有相互作用，當(dāng)其處于閉合構(gòu)象時(shí)，與 Trp49 的柔性吲哚環(huán)有相互作用，這可能是其具有 β-內(nèi)酰胺酶抑制活性的原因。

3.2 黃芩苷

黃芩苷（baicalin）是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一，作為食用藥用植物中的生物活性成分，其對(duì) NDM-1 的 IC50值為（3.89 ± 1.1）μmol/L[42]。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷本身具有抗菌活性，其對(duì)產(chǎn) NDM-1 的重組工程菌BL21(DE3)/pET28a-NDM-1 的 MIC ≥ 512 μg/ml；當(dāng)其與氨芐西林聯(lián)用時(shí)，可使氨芐西林的 MIC 由128 μg/ml降至 8 μg/ml；與頭孢呋辛聯(lián)用可使其 MIC 由 64 μg/ml 降低至 4 μg/ml。黃芩苷（圖 7）與 NDM-1 的分子對(duì)接結(jié)果（圖 8）表明黃芩苷中的羧基可能與鋅離子相互作用，且與氨基酸殘基 Glu52、Glu123、Met67、Trp93 和 Phe70 形成氫鍵。

圖 6 三環(huán)類天然產(chǎn)物 SB236050 與 CfiA 酶活性位點(diǎn)結(jié)合的立體視圖（A：復(fù)合物的一般構(gòu)象；B：復(fù)合物的閉合構(gòu)象）

圖 7 黃芩苷

圖 8 黃芩苷-NDM-1分子對(duì)接結(jié)構(gòu)（A：正視圖；B：俯視圖）

圖 9 聚酮類化合物

4 作用機(jī)制研究尚未明確

4.1 聚酮類化合物

Gan 等[43]從中國(guó)新疆土壤分離的菌株sp.I09F 484 的發(fā)酵產(chǎn)物中得到的 2 個(gè)新的聚酮類化合物 1 和 2（圖9），對(duì) NDM-1 有一定的抑制活性，IC50值分別為 94.9 μmol/L 和 87.9 μmol/L。聚酮類化合物 1 和 2 與三環(huán)天然產(chǎn)物具有相同的色酮-5-羧酸骨架。

4.2 Bulgecin A

Bulgecin A（BlgA）[44]是一種硫酸化的 N-乙酰-D-葡萄糖胺（圖 10），通過 β-糖基與 4-羥基-5-羥基甲基丙氨酸環(huán)相連，可抑制從中得到的金屬 β-內(nèi)酰胺酶 BceII，但當(dāng)該酶只有一個(gè)鋅離子時(shí)，BlgA 對(duì)其無抑制作用。通過鋅離子回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)可知，BlgA 的作用機(jī)制可能與酶中的鋅離子有關(guān)，分子對(duì)接結(jié)果表明其可能通過糖基上的硫酸基團(tuán)與鋅離子相互作用。Skalweit 和 Li[45]從菌株發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到BlgA，分離得到的 BlgA 對(duì) L1 有較弱的抑制活性，在體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)產(chǎn) VIM-2 的耐藥菌也有一定的抑制活性。

4.3 茶黃素-3,3'-沒食子酸酯

茶黃素-3,3'-沒食子酸酯（TFDG）（圖 11）被發(fā)現(xiàn)是一種本身沒有抗菌活性的天然產(chǎn)物，但可以抑制金屬 β-內(nèi)酰胺酶的活性，其對(duì) NDM-1 的 IC50值為 8.75 μg/ml；當(dāng)其以 32 μg/ml 與 β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用時(shí)，可使抗生素的 MIC 降低 4 ~ 8 倍；在體外實(shí)驗(yàn)中，TFDG 與 β-內(nèi)酰胺抗生素的組合在小鼠金黃色葡萄球菌肺炎模型中顯示出有效的保護(hù)作用[46]。分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，TFDG 與氨基酸殘基 Gln242 和 Ser369 結(jié)合，可能與其發(fā)揮作用相關(guān)。

4.4 其他

Shi等[47]以 NDM-1 的蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)對(duì)天然產(chǎn)物化合物庫(kù)來源的 2000 余個(gè)化合物進(jìn)行虛擬篩選，篩選出包括甜菊苷、橘皮苷、香葉木苷、巴龍霉素、蕓香甘 5 種化合物具有抑制活性，其 IC50值分別為（214.1 ± 13.37）、（3.348 ± 1.35）、（20.740 ± 1.92）、（20.764 ± 2.21）和（15.53 ± 1.32）μmol/L。

5 結(jié)語(yǔ)

近年來，耐藥菌感染的臨床嚴(yán)峻性以及相關(guān)治療藥物的短缺已成為威脅人民健康的重要因素。β-內(nèi)酰胺類抗生素在抗感染領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，是應(yīng)用最廣泛的抗生素，但廣泛應(yīng)用使其耐藥問題愈發(fā)嚴(yán)重。隨著多種耐藥機(jī)制的出現(xiàn)，已有的 β-內(nèi)酰胺類抗生素在臨床使用中逐漸失去其原有作用，而 β-內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)與廣泛傳播是其耐藥的最主要原因。在具有新化學(xué)實(shí)體的抗生素研發(fā)困難，且結(jié)構(gòu)改造藥物不能有效克服細(xì)菌已有耐藥性的情況下，針對(duì) β-內(nèi)酰胺酶尤其是金屬 β-內(nèi)酰胺酶研制新型的 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑成為抗耐藥藥物研發(fā)的有效途徑。

圖 10 Bulgecin A

圖 11 茶黃素-3,3'-沒食子酸酯

早期研發(fā)的金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑以金屬離子螯合劑為主，如1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）、2-S-(4-氨基苯)-1,4,7 三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）[48]等，作用機(jī)制為與金屬 β-內(nèi)酰胺酶中的鋅離子進(jìn)行螯合，該類抑制劑對(duì)體內(nèi)其他金屬酶的低選擇性和毒性是該類金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑開發(fā)的難點(diǎn)。除此之外，如二苯基四醇、半胱氨酸肽、甲酰氨基甲酸、琥珀酸衍生物等[49-58]非天然產(chǎn)物來源的分子被發(fā)現(xiàn)具有對(duì)金屬 β-內(nèi)酰胺酶的抑制活性，但這些化合物的藥物代謝、毒性、作用機(jī)制等對(duì)這些分子的成藥性存在較大影響。

目前更多的金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑是分子結(jié)構(gòu)中具有與芳香族基團(tuán)結(jié)合的螯合基團(tuán)[59]（如硫醇基團(tuán)[60]、羧酸基團(tuán)[61]等）的化合物。另一可能的研究方向是獲得能模擬高能四面體中間產(chǎn)物的化合物。盡管絲氨酸 β-內(nèi)酰胺酶與金屬 β-內(nèi)酰胺的結(jié)構(gòu)之間差異明顯，但環(huán)硼酸酯類化合物[62]通過模擬 β-內(nèi)酰胺類藥物在被酶水解過程中所產(chǎn)生的四面體中間產(chǎn)物從而發(fā)揮其對(duì)兩類 β-內(nèi)酰胺酶的抑制活性。該類化合物的發(fā)現(xiàn)提示我們通過篩選獲得具有模擬高能四面體中間產(chǎn)物的化合物可能獲得絲氨酸 β-內(nèi)酰胺酶與金屬 β-內(nèi)酰胺酶的雙重抑制劑或金屬 β-內(nèi)酰胺酶的新型抑制劑。天然產(chǎn)物來源分子結(jié)構(gòu)新穎豐富，易從中獲得具有更多不同結(jié)構(gòu)的分子或具有新機(jī)制的金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，故本文綜述了部分天然產(chǎn)物來源的金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，以期對(duì)新型的 MBLs 抑制劑的研發(fā)有所幫助。此外，應(yīng)用虛擬篩選[63]，基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)[64]等技術(shù)對(duì)天然產(chǎn)物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選和基于天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造，也可對(duì)金屬 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研發(fā)提供幫助。

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國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81872913）；863 計(jì)劃生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域青年科學(xué)家專題（2015AA020911）

劉憶霜，Email：yishuang@gmail.com

2019-10-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.014