章毅，陳侃俊，伍婷，張晗，祁成，孔凡瑞，陳亮，胡肖希，李品宙

·論著·

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖與遷移的影響

章毅*，陳侃俊*，伍婷，張晗，祁成，孔凡瑞，陳亮，胡肖希，李品宙

200051 上海市臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)/上海市干細(xì)胞技術(shù)有限公司/中國(guó)干細(xì)胞集團(tuán)有限公司

探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hucMSCs）對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與遷移的影響及其可能機(jī)制。

采用 II 型膠原酶消化法從新生兒臍帶中分離制備 hucMSCs，用流式細(xì)胞術(shù)鑒定 P3 代 hucMSCs 表面標(biāo)記抗原，用油紅 O 染色、茜素紅 S 染色和 Masson 染色進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞三向分化能力鑒定；以人表皮角質(zhì)細(xì)胞系HaCaT 為研究模型，在 transwell 上室接種 P3 代 hucMSCs進(jìn)行共培養(yǎng)，顯微鏡觀察24、48 和 72 h 時(shí) HaCaT 的細(xì)胞形態(tài)，CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況，劃痕法檢測(cè)細(xì)胞 12 h 和 24 h 遷移率，qRT-PCR 法測(cè)定 HaCaT 細(xì)胞遷移、增殖相關(guān)生長(zhǎng)因子 KGF-2、FGFR-2、TGF-β1，以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 Fibronectin、MMP-1 和 Collagen I mRNA 表達(dá)水平。

hucMSCs 呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，其表面間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志性抗原 CD105、CD90、CD73 陽(yáng)性表達(dá)率分別為 98.35%、99.97% 和 99.94%，不表達(dá) CD45、CD34、CD14 和 CD19，在誘導(dǎo)培養(yǎng) 16 d 后出現(xiàn)明顯的成脂、成骨和成軟骨細(xì)胞特性。hucMSCs 共培養(yǎng) 24、48 和72 h，HaCaT 細(xì)胞存活率較對(duì)照組分別顯著增加了（20.42 ± 3.90）%（= 0.002）、（36.30 ± 8.08）%（= 0.001）和（27.31 ± 10.04）%（= 0.012），與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。劃痕后繼續(xù)培養(yǎng) 12 h，對(duì)照組、共培養(yǎng)組 HaCaT 的空白區(qū)域面積分別為（36354.19 ± 1705.32）μm2、（29497.63 ± 1286.49）μm2（= 0.045），培養(yǎng) 24 h，其空白區(qū)域面積分別減少為（13086.65 ± 1695.85）μm2、（2895.69 ± 224.32）μm2（= 0.014）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，共培養(yǎng)處理 24 h 后 hucMSCs 組 KGF-2、TGF-β1 基因表達(dá)分別上調(diào)為對(duì)照組的 1.24 倍和 1.92 倍；共培養(yǎng) 48 h 后 KGF-2、TGF-β1 和 FGFR-2 分別上調(diào) 2.01 倍、2.26 倍和 1.34 倍，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 Fibronectin 轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)為對(duì)照組的 1.59 倍，MMP-1 降低至對(duì)照組的 0.52 倍。

hucMSCs 能夠顯著促進(jìn) HaCaT 細(xì)胞的增殖與遷移，這可能與 hucMSCs 調(diào)節(jié) HaCaT 增殖、遷移相關(guān)生長(zhǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基因表達(dá)水平有關(guān)，提示 hucMSCs是有潛力的表皮創(chuàng)傷愈合種子細(xì)胞。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞； 創(chuàng)傷愈合； HaCaT； 細(xì)胞遷移

皮膚是人體最大的器官，其中表皮層位于皮膚最外層，不僅擔(dān)負(fù)著機(jī)體屏障功能、吸收功能和感覺功能，也直接反映了個(gè)體皮膚的健康及代謝狀況。角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要細(xì)胞類型，其形態(tài)、大小和排列從基底層到角質(zhì)層隨著細(xì)胞分化與更新而發(fā)生有規(guī)律的變化，具有表皮構(gòu)成、創(chuàng)傷修復(fù)、細(xì)胞角化、細(xì)胞因子分泌和免疫監(jiān)視等功能[1-2]。角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活力下降、遷移不足、角化功能衰退會(huì)導(dǎo)致表皮萎縮變薄、皮膚干燥、皺紋產(chǎn)生和皮膚免疫功能退化，嚴(yán)重影響皮膚健康[3]。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，廣泛存在于骨髓、臍帶、胎盤和脂肪等組織中。MSCs 除了能夠支持造血、防治移植物抗宿主病，還能修復(fù)骨和軟骨、肌腱、心肌、皮膚等組織損傷，被認(rèn)為是組織工程和細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，MSCs 能夠向皮膚創(chuàng)傷部位遷移、調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥水平、誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成與分泌，進(jìn)而修復(fù)皮膚缺損和促進(jìn)創(chuàng)面愈合[4-6]，此外還能促進(jìn)異體移植皮膚存活[7]，改善纖維化[8]、減輕皮膚放射性損傷[9]。然而，目前關(guān)于MSCs 對(duì)人表皮的潛在調(diào)節(jié)作用還鮮有報(bào)道。HaCaT 由人皮膚永生化角質(zhì)形成，擁有正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化特性。本文以 HaCaT 細(xì)胞為模型，探究了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord MSCs，hucMSCs）對(duì) HaCaT 增殖和遷移的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 采集足月產(chǎn)健康新生兒臍帶，經(jīng)產(chǎn)婦或家屬簽署知情同意書后獲得，符合國(guó)家相關(guān)法律和倫理委員會(huì)規(guī)定。成脂、成軟骨、成骨誘導(dǎo)試劑盒為美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品；CCK8 試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品；MSC Phenotyping Kit（CD105-PE、CD90-FITC、CD73-APC、CD14-/ CD19-/CD34-/CD45-PerCP）為德國(guó) Miltenyi Biotec 公司產(chǎn)品；油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；0.4% 臺(tái)盼藍(lán)為美國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品；FBS、DMEM、0.25% Typsin-EDTA、L-谷氨酰胺、0.4 μmol/L transwell 小室為美國(guó) Gibco 公司產(chǎn)品；Trizol 溶液、cDNA合成試劑盒、PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó) Life technologies 公司；基因引物為美國(guó) Invitrogen 公司產(chǎn)品；青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自德國(guó) PAN-biotech 公司。

1.1.2 儀器 Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀和 ST-16R 低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司；stepone plus 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀購(gòu)自美國(guó) Life 公司；1800 系列-190 氣相液氮罐購(gòu)自美國(guó) MVE 公司；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；FACS Calibur 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 hucMSCs 的分離培養(yǎng) 無菌條件下取臍帶華通膠剪碎成約 2 mm3的組織塊，加入 II 型膠原酶 37 ℃恒溫消化 1.5 h，收集濾液室溫2000 r/min離心 10 min，收集細(xì)胞沉淀加入含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基重懸，置于 37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到 85% ~ 90% 時(shí)，用 0.25% 胰酶消化傳代，接種密度為 5 × 104/ml，每 2 天為細(xì)胞全量換液，每 3 ~ 4 天傳代 1 次。

人力資源管理系統(tǒng)之中，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)績(jī)效管理的運(yùn)用，從而提升人力資源管理的質(zhì)量以及效率，促進(jìn)醫(yī)院可以實(shí)現(xiàn)健康以及穩(wěn)定發(fā)展。首先，進(jìn)行績(jī)效考核的過程當(dāng)中，注意考核和崗位實(shí)現(xiàn)有效融合。對(duì)員工考核過程當(dāng)中，醫(yī)院方面應(yīng)當(dāng)對(duì)護(hù)理及醫(yī)生進(jìn)行不同層面考核，考核內(nèi)容、考核指標(biāo)差異化，也需要注意技術(shù)、難度、勞動(dòng)強(qiáng)度、專業(yè)特點(diǎn)、職責(zé)崗位以及風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)等多方面因素，切忌一刀切，實(shí)現(xiàn)全面、綜合性考核。考核過程當(dāng)中應(yīng)當(dāng)避免僵化，實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)化的考核，并且獎(jiǎng)金發(fā)放以及職稱評(píng)聘要有依據(jù)，對(duì)于表現(xiàn)良好員工需要給予一定精神獎(jiǎng)勵(lì)以及物質(zhì)獎(jiǎng)勵(lì)，促使工作積極性得到顯著提高，督促員工不斷提升自我。

1.2.2 hucMSCs 表面抗原檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[10]鑒定方法，取 P3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 hucMSCs，用 PBS 調(diào)整細(xì)胞密度為 5 × 106/ml，取 1 ml 細(xì)胞，分別加入鼠抗人單克隆標(biāo)記抗體CD90-PerCP-Cy5.5、CD105-PE、CD73-APC、CD45-/CD34-/CD14-/CD19- FITC，室溫避光孵育 30 min，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)。

1.2.3 hucMSCs 三向分化檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[10]鑒定方法，取 P3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 hucMSCs 接種于六孔板中，細(xì)胞密度為 5 × 104/ml，2 ml/孔，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到 60% ~ 70% 時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，分別更換為成脂、成軟骨和成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每 3 天換液。誘導(dǎo) 14 d 后，分別用油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液染色，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的成脂、成軟骨、成骨分化情況。

1.2.4 hucMSCs 與 HaCaT transwell 共培養(yǎng) 取 HaCaT 接種于六孔板中，接種密度為 5 × 104/ml，2 ml/孔。在 HaCaT 上方放置 transwell 小室，實(shí)驗(yàn)組 transwell 上室接種 P3 代hucMSCs，細(xì)胞密度為 5 × 104/ml，1 ml/孔，對(duì)照組的 transwell 上室添加等量 DMEM 培養(yǎng)基。每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔。在 37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 24、48 和 72 h，倒置顯微鏡下觀察 HaCaT 的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 HaCaT 增殖檢測(cè) 參照 1.2.4 所述方法，于 24 孔板中接種并培養(yǎng) HaCaT 和hucMSCs。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去 hucMSCs 及小室，每孔加入 200 μl CCK8 工作液，37 ℃孵育 2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 處吸光值。

1.2.6 劃痕法檢測(cè) HaCaT 細(xì)胞遷移 按照 1.2.4 所述方法接種并培養(yǎng) HaCaT 細(xì)胞。36 h后，培養(yǎng)板孔底形成稀疏的單細(xì)胞層，用微量移液管尖在細(xì)胞中央作一個(gè)十字劃痕，得到上、下、左、右四個(gè)無細(xì)胞的空白區(qū)域，并在四個(gè)象限區(qū)域的十字劃痕上分別取點(diǎn)標(biāo)記。用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，去除 HaCaT 細(xì)胞碎片。接著，按 1.2.4 所述方法處理實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，用無血清 DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在 0、12 和 24 h 時(shí)顯微鏡觀察相同位置劃痕區(qū)彌合情況并拍照記錄。遷移率計(jì)算方法為：12 h 或 24 h 所測(cè)劃痕區(qū)域與 0 h 劃痕區(qū)域的空白面積作差，差值除以 0 h 測(cè)空白面積，所得百分比即 12 h 或 24 h 細(xì)胞遷移率。劃痕實(shí)驗(yàn)每組設(shè)平行孔 2 個(gè)，獨(dú)立重復(fù) 3 次實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 qRT-PCR 檢測(cè)基因 mRNA 表達(dá) 按照 1.2.4 所述方法培養(yǎng) HaCaT 和 hucMSCs，連續(xù)培養(yǎng) 24、48 h 后，采用 Trizol 法提取 HaCaT 細(xì)胞總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，–20 ℃保存。采用qRT-PCR 測(cè)定 HaCaT 細(xì)胞纖連蛋白（Fibronectin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、I 型膠原（Collagen I）、人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（KGF-2）、人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2（FGFR-2）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的 mRNA 表達(dá)。PCR 擴(kuò)增條件：50 ℃保持 2 min，95 ℃預(yù)變性 2 min，95 ℃變性 3 s，60 ℃退火 30 s，循環(huán) 40 次，95 ℃延伸 15 s，60 ℃延伸 1 min，95 ℃延伸 15 s。基因引物序列見表 1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hucMSCs 表面抗原鑒定

表 1 qRT-PCR基因引物序列

圖 1 hucMSCs 表面標(biāo)志性抗原流式鑒定結(jié)果（A：總細(xì)胞散點(diǎn)分布；B：活性細(xì)胞；C：陰性對(duì)照；D ~ F：CD105+、CD90+、CD73+ 細(xì)胞比例；G：陽(yáng)性細(xì)胞比例）

Figure 1 Phenotype characterization of hucMSCs through flow cytometry (A: Total cells scatter diagram; B: Alive cells; C: Negative staining; D - F: CD105+, CD90+, CD73+cells ratio; G: Positive cell proportion)

2.2 hucMSCs 三向分化能力鑒定

P3 代 hucMSCs 接種后 12 h 貼壁良好，細(xì)胞呈典型成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，以放射狀或平行狀緊密排列，連續(xù)培養(yǎng) 3 d 左右細(xì)胞密度達(dá)到 85% ~ 90%（圖 2A）。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng) 16 d 后進(jìn)行油紅 O 染色，觀察到大小不等的紅色脂滴，細(xì)胞核呈藍(lán)色，脂滴隨著誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的增加而增大、增多，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)從梭形、多角形向橢球形轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)出脂肪細(xì)胞特點(diǎn)；成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 16 d 后進(jìn)行茜素紅 S 染色，觀察到細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)大量橘色沉淀顆粒和多層結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)，提示細(xì)胞出現(xiàn)鈣化沉積，表現(xiàn)出成骨細(xì)胞特點(diǎn)；成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 16 d 后進(jìn)行 Masson 染色，觀察到細(xì)胞突起收回，趨向扁平圓形生長(zhǎng)，細(xì)胞基質(zhì)和纖維呈藍(lán)紫色，表現(xiàn)出成軟骨細(xì)胞樣特點(diǎn)（圖 2B ~ D）。三向分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究制備的 hucMSCs 具有很好的成脂、成骨和成軟骨分化潛能。

2.3 hucMSCs 共培養(yǎng)對(duì) HaCaT 細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)比 hucMSCs 共培養(yǎng) 24、48 和 72 h 對(duì) HaCaT 細(xì)胞形態(tài)和增殖狀況的影響，結(jié)果顯示培養(yǎng) 24 h 時(shí)，HaCaT 貼壁良好，細(xì)胞形態(tài)與輪廓清晰，共培養(yǎng)組較對(duì)照組細(xì)胞聚集更好、團(tuán)塊更大；48 h 時(shí)，共培養(yǎng)組細(xì)胞已聯(lián)結(jié)成片、間隙大大縮??；72 h時(shí)，共培養(yǎng)組細(xì)胞間隙消失，呈扁平鋪路石狀排列，較對(duì)照組細(xì)胞更緊密（圖 3）。提示與 hucMSCs共培養(yǎng)的 HaCaT 細(xì)胞形態(tài)良好、增殖更快。

2.4 hucMSCs 對(duì) HaCaT 細(xì)胞增殖的影響

將 hucMSCs 處理組與對(duì)照組的450作差，再與對(duì)照組450作比，計(jì)算 HaCaT細(xì)胞存活率的增加比例。結(jié)果顯示（圖 4、表 2），hucMSCs 與 HaCaT 共培養(yǎng) 24、48 和 72 h，HaCaT 細(xì)胞存活率分別顯著增加了 20.42%（< 0.01）、36.30%（< 0.01）和 27.31%（< 0.05），與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果（圖 3）一致。提示 hucMSCs 共培養(yǎng)能夠持續(xù)促進(jìn) HaCaT 細(xì)胞的增殖。

圖 2 hucMSCs 成脂、成骨、成軟骨三向誘導(dǎo)分化結(jié)果（A：正常 hucMSCs 細(xì)胞；B：油紅 O 染色；C：茜素紅 S 染色；D：Masson 染色；× 200）

Figure 2 Adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of hucMSCs (A: Normal hucMSCs morphology; B: Oil red O staining; C: Alizarin red S staining; D: Masson staining; × 200)

圖 3 hucMSCs 共培養(yǎng)對(duì) HaCaT 細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)的影響（× 100）

Figure 3 The effects of hucMSCs co-culture on HaCaT cell growth and morphology (× 100)

圖 4 HaCaT 細(xì)胞 CCK8 增殖檢測(cè)結(jié)果（*P < 0.05，**P < 0.01）

Figure 4 HaCaT cell proliferation assay by CCK8 method (*< 0.05,**< 0.01)

2.5 hucMSCs 對(duì) HaCaT 細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HaCaT 細(xì)胞對(duì)照組和共培養(yǎng)組初始空白區(qū)域面積分別為（44458.37 ± 1838.50）μm2和（42080.05 ± 2895.85）μm2，無顯著差異（> 0.05，圖 5B）；繼續(xù)培養(yǎng) 12 和 24 h，對(duì)照組與 hucMSCs 共培養(yǎng)組細(xì)胞均向劃痕處遷移（圖 5A）。12 h 時(shí)，對(duì)照組和 hucMSCs 處理組的空白區(qū)域面積分別為（36354.19 ± 1705.32）μm2和（29497.63 ± 1286.49）μm2，遷移率分別為18.23% 和 29.90%，差異顯著（< 0.05，圖 5 B）；培養(yǎng)24 h 時(shí)，對(duì)照組空白區(qū)域面積為（13086.65 ±1695.85）μm2，遷移率為 70.56%，共培養(yǎng)組空白區(qū)域面積為（2895.69 ± 224.32）μm2，遷移率為 93.12%，劃痕處幾乎已經(jīng)重新鋪滿細(xì)胞，空白區(qū)域面積差異顯著（< 0.05，圖 5B）。表明 hucMSCs 能夠顯著促進(jìn) HaCaT 細(xì)胞的遷移，加速劃痕空白區(qū)域彌合。

表 2 HaCaT 存活率分析

2.6 hucMSCs 對(duì) HaCaT 細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的影響

本研究進(jìn)一步測(cè)定了 hucMSCs 共培養(yǎng) 24 和 48 h 時(shí) HaCaT 細(xì)胞遷移、黏附相關(guān)細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的 mRNA 表達(dá)水平，初步探究 hucMSCs 的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，hucMSCs 共培養(yǎng) 48 h 顯著提高了 Fibronectin（= 0.013，圖 6A）和 FGFR-2（= 0.011，圖 6E）的基因表達(dá)水平；共培養(yǎng) 24 h、48 h，KGF-2（= 0.033 和= 0.022，圖 6D）和TGF-β1（= 0.023和= 0.033，圖 6F）mRNA 水平都得到顯著提高；共培養(yǎng) 48 h，MMP-1（= 0.020，圖 6B）mRNA 表達(dá)顯著降低；共培養(yǎng) 24 h、48 h，Collagen I（= 0.686 和= 0.315，圖 6C）的基因表達(dá)水平均無顯著變化。這些結(jié)果提示hucMSCs 可能通過上調(diào)促 HaCaT 黏附、遷移及增殖相關(guān)生長(zhǎng)因子表達(dá)，維持細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水平來促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖。

圖 5 hucMSCs 共培養(yǎng)對(duì) HaCaT 細(xì)胞遷移的影響（A：hucMSCs 共培養(yǎng) 12 h、24 h 細(xì)胞向劃痕區(qū)域遷移狀況；B：hucMSCs 共培養(yǎng) 12 和24 h 時(shí)細(xì)胞劃痕區(qū)面積的變化；*P < 0.05）

Figure 5 The effects of hucMSCs on the migration of HaCaT cells determined by scratch method (A: Migration and growth of HaCaT cells after 12 h and 24 h co-culture with hucMSCs; B: The wounded area of HaCaT cells after 12 h and 24 h hucMSCs treatment;*< 0.05)

圖 6 HaCaT 細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（A：纖連蛋白；B：基質(zhì)金屬蛋白酶-1；C：I 型膠原；D：人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2；E：人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2；F：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；nsP > 0.05，*P < 0.05）

Figure 6 The mRNA levels of extracellular matrix and cell growth factors of HaCaT cells determined by qRT-PCR (A: Fibronectin; B: MMP-1; C: Collagen I; D: KGF-2; E: FGFR-2; F: TGF-β1;ns> 0.05,*< 0.05)

3 討論

創(chuàng)傷愈合長(zhǎng)期以來是行外科手術(shù)或燒灼傷后的臨床關(guān)注重點(diǎn)，它與手術(shù)后感染、并發(fā)癥，燒灼傷患者病程長(zhǎng)短、后期瘢痕形成等均有密切關(guān)系。傷口愈合是一個(gè)高度復(fù)雜的過程，涉及多種生化途徑和細(xì)胞活動(dòng)，主要包括炎癥反應(yīng)、上皮再生、纖維增生和血管生成[12]。在愈合的早期階段，表皮中主要的細(xì)胞類型角化形成細(xì)胞被激活，在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的同時(shí)遷移到創(chuàng)傷部位并啟動(dòng)再上皮化和誘導(dǎo)傷口收縮，接著進(jìn)行細(xì)胞增殖以重建復(fù)層上皮，因此，角質(zhì)形成細(xì)胞對(duì)于傷口的最佳閉合至關(guān)重要[13]。Guerid 等[14]在前瞻性隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，用角化細(xì)胞懸浮液處理整形手術(shù)后人前大腿內(nèi)側(cè)皮膚，發(fā)現(xiàn)能夠顯著減輕傷口痛感、縮短愈合時(shí)長(zhǎng)，并指出其可能通過釋放生長(zhǎng)因子或原位增殖來誘導(dǎo)和刺激愈合。Horváth 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白磷酸酶通過不同程度地激活角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和分化，促進(jìn) HaCaT 劃痕傷口修復(fù)，幫助維持皮膚的正常穩(wěn)態(tài)。Shibata 等[2]研究也表明，脂聯(lián)素在 ERK 信號(hào)通路的介導(dǎo)下通過促進(jìn)角化細(xì)胞的增殖和遷移加速皮膚傷口愈合進(jìn)程。這些研究結(jié)果表明，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移與皮膚創(chuàng)傷愈合密切相關(guān)。由于在正常生理狀態(tài)下，角質(zhì)形成細(xì)胞是形成復(fù)層上皮的典型，其在創(chuàng)傷愈合時(shí)的遷移運(yùn)動(dòng)則以側(cè)向爬行為主，因此，我們用基于無血清培養(yǎng)的劃痕實(shí)驗(yàn)?zāi)M探究 hucMSCs 對(duì) 24 h 周期內(nèi) HaCaT 細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示，hucMSCs 共培養(yǎng) 12、24 h 均顯著提高 HaCaT 細(xì)胞的遷移率。CCK8 存活率檢測(cè)結(jié)果也顯示，hucMSCs 非接觸處理 24、48 和72 h 均能顯著提高 HaCaT 細(xì)胞的存活率。這些結(jié)果表明，hucMSCs 能夠有效提高 HaCaT 細(xì)胞的增殖和遷移能力，提示臍帶源 MSCs 能夠潛在地促進(jìn)皮膚傷口愈合。

細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）及其與細(xì)胞間復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞黏附、遷移、生長(zhǎng)等代謝活動(dòng)相關(guān)。ECM 可以影響角質(zhì)形成細(xì)胞活性，并通過膠原酶分泌和整合素受體通路調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，進(jìn)而參與皮膚損傷愈合和組織再生[16]。纖連蛋白是角質(zhì)形成細(xì)胞特異性黏附和遷移的重要底物，以時(shí)間和劑量依賴方式發(fā)揮作用，同時(shí)也是表皮再植和皮膚損傷修復(fù)過程中影響上皮細(xì)胞遷移的關(guān)鍵蛋白[17]。本研究結(jié)果顯示 hucMSCs 在促進(jìn) HaCat 細(xì)胞遷移的同時(shí)，顯著上調(diào)了纖連蛋白的 mRNA 表達(dá)，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，提示纖連蛋白可能是 hucMSCs 影響 HaCaT 細(xì)胞遷移的重要蛋白，與 Clark 等[17]結(jié)果一致。膠原是哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ECM 的重要組成部分和主要結(jié)構(gòu)蛋白，能夠促進(jìn) ECM 的成熟、加強(qiáng)和支持結(jié)締組織，也是皮膚剛性和抗張強(qiáng)度的生物學(xué)基礎(chǔ)。膠原在多種正常生理過程和病理?xiàng)l件下會(huì)被MMPs 降解，包括組織重塑、器官形成、傷口愈合、皮膚老化和炎癥發(fā)生等[18]。MMPs 則主要通過裂解包括膠原蛋白在內(nèi)的 ECM 組分而在組織重塑過程中發(fā)揮重要作用。其中，MMP-1 是裂解 I ~ III 型膠原三重螺旋結(jié)構(gòu)的主要酶。在皮膚炎性反應(yīng)或輻照損傷條件下，細(xì)胞 MMP-1 水平的升高和 I 型前膠原蛋白水平降低，可以引發(fā)結(jié)締組織損傷并加速皮膚老化[19]。本研究結(jié)果顯示，hucMSCs 共培養(yǎng)能夠顯著下調(diào) HaCaT 細(xì)胞 MMP-1 的 mRNA 水平，而I 型膠原蛋白表達(dá)無顯著變化，提示間充質(zhì)干細(xì)胞通過抑制I 型膠原蛋白和纖連蛋白的降解，進(jìn)而促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移活動(dòng)。

可溶性生長(zhǎng)因子及其受體間相互作用也被認(rèn)為是皮膚細(xì)胞增殖、遷移活動(dòng)及傷口愈合各階段的重要調(diào)節(jié)因子，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（transforming growth factor β，TGF-β），角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）及其受體，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）和表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）等[20-21]。TGF-β 是常見的細(xì)胞因子，Grose 等[22]和 O′Leary 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 可以通過上調(diào)特定整合素的表達(dá)促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)，并促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖，最終加速皮膚創(chuàng)傷愈合。與之相一致地，我們發(fā)現(xiàn) hucMSCs 共培養(yǎng) 24 h 和48 h 后 TGF-β1 的 mRNA 表達(dá)分別上調(diào)為對(duì)照組的 1.92 倍和 2.26 倍，呈現(xiàn)時(shí)間依賴效應(yīng)，提示 hucMSCs 促進(jìn) HaCaT 的增殖和遷移可能與 TGF-β 通路的激活有關(guān)。KGF-2 是人體皮下組織細(xì)胞分泌的一種重要生長(zhǎng)因子，能夠特異性結(jié)合上皮細(xì)胞的FGFR-2，再經(jīng)過一系列信號(hào)傳遞過程促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移[24]。在動(dòng)物模型中，KGF-2 能夠顯著促進(jìn)皮膚移植、機(jī)械損傷造成的創(chuàng)面愈合，提高新生皮膚膠原含量，增加皮膚抗張強(qiáng)度和上皮厚度[25-26]。本研究結(jié)果也顯示，hucMSCs 顯著上調(diào) HaCaT 細(xì)胞KGF-2 的 mRNA 表達(dá)并呈時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，在共培養(yǎng)處理 48 h 后其特異性受體FGFR-2 mRNA 水平也顯著上調(diào) 1.34 倍，提示 KGF-2 及其受體參與hucMSCs 對(duì) HaCaT 增殖和遷移的調(diào)節(jié)作用。

近年來，越來越多研究指出，MSCs 在皮膚醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，除了具有降低炎性反應(yīng)[27]、緩解纖維化[8]、減輕瘢痕形成[28]等作用，還被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)皮膚損傷愈合，是有潛力的皮膚創(chuàng)面移植材料。Rashtbar 等[29]研究表明，添加了 MSCs 的綿羊小腸黏膜下層細(xì)胞外基質(zhì)材料與不添加 MSCs 相比，能夠更有效地促進(jìn)大鼠創(chuàng)傷皮膚的上皮形成、傷口收縮和愈合。Pérez-Díaz 等[30]則基于脂肪源 MSCs 開發(fā)了納米級(jí)抗生物膜細(xì)胞敷料，可以有效減少皮膚水分流失、防止細(xì)菌感染和促進(jìn)創(chuàng)傷部位皮膚再生。Martinello 等[31]從外周血中提取 MSCs，用于處理手術(shù)造成的綿羊皮膚傷口，使得傷口邊緣皮膚細(xì)胞增殖更快，加速創(chuàng)傷部位肉芽組織、新生血管、結(jié)構(gòu)蛋白和皮膚附件的形成與成熟，同時(shí)不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，指出 MSCs 對(duì)大型哺乳動(dòng)物表皮和全層皮膚創(chuàng)傷均具有很好的修復(fù)作用。值得一提的是，MSCs 在皮膚上尤其是真皮層的移植植入率低，原位增殖和分化細(xì)胞有限，其對(duì)皮膚的有益作用更可能通過旁分泌作用和產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子來實(shí)現(xiàn)[32-33]。

綜上，我們研究發(fā)現(xiàn) hucMSCs 能夠在非物理接觸情況下有效促進(jìn) HaCaT 的增殖與遷移，這可能與其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞增殖與遷移相關(guān)生長(zhǎng)因子的 mRNA 表達(dá)調(diào)控有關(guān)，包括上調(diào)纖連蛋白、下調(diào) MMP-1 基因表達(dá)，并維持I 型膠原蛋白的 mRNA 水平，同時(shí)，不同程度地上調(diào) TGF-β1、KGF-2 及 FGFR-2 的 mRNA 水平，呈時(shí)間依賴效應(yīng)，這些結(jié)果提示 hucMSCs 是促進(jìn)表皮創(chuàng)傷愈合的有潛力的種子細(xì)胞。接下來，我們將在 3D 皮膚模型及動(dòng)物模型上進(jìn)一步探究 hucMSCs 促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和遷移的作用方式及分子機(jī)制，為開發(fā)基于 hucMSCs 的皮膚傷口愈合敷料提供數(shù)據(jù)支持。

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Effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells on the proliferation and migration of HaCaT cells

ZHANG Yi, CHEN Kan-jun, WU Ting, ZHANG Han, QI Cheng, KONG Fan-rui, CHEN Liang, HU Xiao-xi, LI Pin-zhou

Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co., Ltd./China Stem Cell Group Co., Ltd., Shanghai 200051, China

To investigate the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hucMSCs) on the proliferation and migration of human epidermal keratinocytes and its potential mechanisms.

HucMSCs were isolated from neonatal umbilical cord using type II collagenase digestion method. Flow cytometry was applied to identify the characteristic antigenic markers of P3-generation hucMSCs. Oil red O staining, alizarin red S staining and Masson staining were used to identify the differentiation abilities of hucMSCs. Then, HaCaT keratinocytes and hucMSCs were co-cultured using a transwell membrane. After 24, 48 and 72 h, the cell viability of HaCaT was measured by CCK8 assay and cell morphology was photographed. Moreover, scratch assay was applied to determine the migration of HaCaT cells co-cultured with hucMSCs for 12 h and 24 h. The mRNA expression of growth factors associated with cell migration, proliferation and extracellular matrix proteins were further characterized by qRT-PCR.

P3-generation hucMSCs showed fibroblast-like adherent growth and expression of CD105, CD90 and CD73, while lack of CD45, CD34, CD14 and CD19. After 16 d of induction culture, lipogenic, osteogenic and chondrogenic characteristics were also observed. Consistent with the morphologic observations, the viability of HaCaT cells co-cultured with hucMSCs was significantly increased for (20.42 ± 3.90)% (= 0.002), (36.30 ± 8.08)% (= 0.001) and (27.31 ± 10.04)% (= 0.012) for 24, 48 and 72 h, respectively. Wound scrath assay revealed that hucMSCs significantly promoted the migration of HaCaT after 12 h and 24 h incubation (< 0.05). Furthermore, the mRNA expression of KGF-2 and TGF-β1 in HaCaT were up-regulated by 1.24 and 1.92 folds after 24 h co-culture with hucMSCs, KGF-2, TGF-β1, FGFR-2 and Fibronectin mRNA expression were up-regulated by 2.01, 2.26, 1.34 and 1.59 folds after 48 h co-culture, while MMP-1 was down-regulated by 0.52 folds.

HucMSCs can significantly promote the proliferation and migration of HaCaT cells, which may be related to regulation of keratinocytes proliferation, migration-related growth factors and extracellular matrix proteins mRNA expression in HaCaT. These results suggest that hucMSCs be potential seed cells for epidermal wound healing.

Umbilical cord mesenchymal stem cells; Wound healing; HaCaT; Cell migration

WU Ting, Email: wuting@shanghaicordblood.org

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.007

上海市自然科學(xué)基金（16ZR1429200）；上海市科委研發(fā)平臺(tái)專項(xiàng)（16DZ2293000）；上海張江國(guó)家自主創(chuàng)新示范區(qū)專項(xiàng)發(fā)展資金重大項(xiàng)目（ZJ2017-ZD-010）；上海圍產(chǎn)干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心（18DZ2250800）

伍婷，Email：wuting@shanghaicordblood.org

2019-12-11

*同為第一作者