李冰　潘秀清　武彥榮　高秀瑞　張敬敬　史宇凡　趙建軍　申書興

摘 要： 為揭示茄子反向溫敏核雄性不育（rTGMS）發(fā)生與糖類代謝的關系，以茄子rTGMS系‘05ms及溫度不敏感系‘S63為試材，對不育期和可育期的葉片及花蕾的可溶性糖含量進行比較，結果表明，‘05ms在不育和可育時期葉片和花蕾中的可溶性糖含量均顯著低于‘S63;進一步對‘05ms花蕾進行轉錄組測序及對其糖類代謝相關途徑進行分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集在3個通路：淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生和氨基糖和核苷酸糖代謝，其中淀粉和蔗糖代謝通路的差異基因最多且大部分在低溫條件表達下調，主要影響了葡萄糖和半乳糖醛酸的合成。此結果初步揭示了茄子反向溫敏雄性不育系中糖類代謝響應溫度變化的特點，為茄子雄性不育雜交育種提供理論依據。

關鍵詞： 茄子;反向溫敏核雄性不育;糖類代謝;基因表達

中圖分類號：S641.1? ? 文獻標志碼：A? ? 文章編號：1673-2871（2020）05-018-06

Abstract： In order to reveal the relationship between the carbohydrate metabolism and the reverse thermosensitive genic male sterility （rTGMS） of eggplant， the rTGMS line ‘05msand the temperature-insensitive line ‘S63were used as experimental materials. The contents of soluble sugar in leaves and floral buds were compared during the anther development stages under low-temperature and high-temperature conditions. The results showed that the soluble sugar content of leaves and floral buds in ‘05mswere significantly lower than those in ‘S63during sterile and fertile periods. To make further study the biochemical mechanism of male sterily in ‘05ms， transcriptome sequencing was completed and the relational approach of carbohydrate metabolism had been analyzed. We found that the differentially expressed genes （DEGs） were enriched in the KEGG pathways ‘starch and sucrose metabolism， ‘glycolysis / gluconeogenesisand ‘amino sugar and nucleotide sugar metabolism. Among the three pathways， the DEGs of ‘starch and sucrose metabolismpathways were most， the expression levels were more lower at low-temperature， and mainly affected the synthesises of glucose and galacturonic acid. The results reveals the characteristics of carbohydrate metabolism response to temperature change in rTGMS lines of eggplant preliminarily， and provided theoretical basis for male sterile hybridization.

Key words：? Eggplant; Reverse thermosensitive genic male sterility; Carbohydrate metabolism; Gene expression

茄子是我國重要蔬菜作物之一，雜種優(yōu)勢明顯，雄性不育系的利用是配制雜交種的重要途徑。光、溫敏雄性不育系在適宜的光/溫條件下可以恢復育性，既是不育系又是保持系，而且配組自由，不受恢、保關系制約，生產程序更為簡單，具有廣闊的發(fā)展前景，闡明其花藥敗育機制對于培育新型優(yōu)良不育系具有重要意義?；ㄋ幇l(fā)育需要營養(yǎng)物質的供應，涉及物質代謝、能量代謝、酶活性的變化以及內源激素含量的差異等生理生化過程，它們之間的協(xié)同作用是花藥正常分化發(fā)育所必需的。遇到不利環(huán)境，植物通常利用寶貴的資源，通過復雜的機制，包括感知、轉導和信號交換等來調節(jié)代謝作用，以保護自己免受損傷[1]。植物在生殖發(fā)育時期對不適宜的溫度環(huán)境極為敏感，絨氈層是最敏感的細胞層[2]。據報道，水稻小孢子發(fā)育時期對高溫脅迫最為敏感，此時絨氈層功能紊亂，花藥開裂較差[3]。也有研究指出，水稻生殖生長階段遇到低溫條件往往導致花藥發(fā)育異常，育性下降和減產明顯[4]。許多學者提出了“物質虧損”理論，即結構物質、營養(yǎng)物質、能量物質的虧損對小孢子發(fā)育產生嚴重影響[5]。糖類是植物體內一類主要的有機物，通常占植株干質量的50%以上。國內外學者對許多作物雄性不育系的生理生化特性進行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)花藥敗育過程中可溶性糖含量均發(fā)生了變化。有研究表明，高溫誘導棉花‘H05中酪蛋白激酶I（GhCKI）的表達，并抑制淀粉合酶活性，在花藥發(fā)育過程中降低葡萄糖水平，最終破壞絨氈層細胞程序性死亡（PCD），導致花藥敗育或不開裂[6]。對茄子核質互作不育系的研究發(fā)現(xiàn)，不育系花蕾中可溶性糖含量高于保持系[7]。但對茄子反向溫敏雄性不育系中可溶性糖含量的研究還未見報道，溫度對不育系花藥發(fā)育過程中糖代謝過程的影響還不清楚。

因此，筆者分別在低溫不育和高溫可育時期對茄子rTGMS系‘05ms葉片和花蕾中的可溶性糖含量進行了測定，并利用RNA-seq法分析了糖代謝通路中差異表達基因的變化規(guī)律，旨在探討茄子rTGMS系‘05ms響應溫度的物質能量代謝特點，豐富茄子雄性不育的理論基礎，加快茄子兩系雜交育種進程。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為河北省農林科學院經濟作物研究所選育的長茄rTGMS系‘05ms和雄性可育系‘S63，其中不育系‘05ms原始株是從‘S63自交系中自然突變而來，在低溫下不育、高溫下可育，臨界溫度為18℃。2016年1月4日于河北省農業(yè)科學院溫室播種，穴盤育苗，3月20日定植，大棚種植，常規(guī)管理。

1.2 方法

1.2.1 可溶性糖含量的測定 分別采集‘S63和‘05ms在春季低溫不育階段和夏季高溫可育階段的減數分裂期、小孢子時期和成熟花粉粒時期這3個花藥發(fā)育時期的花蕾和從頂部向下第3～4片葉，采用硫酸蒽酮法測定可溶性糖含量[8]。

1.2.2 糖類代謝相關基因分析 分別采集‘05ms在ML（春季低溫不育階段，4—6月份）、MH（夏季高溫可育階段，7—9月份）、MZ（秋季低溫不育階段，10—11月份）3個時期處于減數分裂時期的花蕾0.2 g，3次重復，迅速剝去萼片后投入液氮中放-80 ℃冰箱保存待用。RNA提取采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提?。═IANGEN，China）。轉錄組測序由北京諾禾致源生物科技股份有限公司進行并在Illumina HiSeq 4000平臺上完成。通過前期對RNA-seq測序結果進行生物信息學分析，篩選出1 771個基因為可能的低溫不育相關基因，并且KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異表達基因（DEGs）顯著富集到了淀粉和蔗糖代謝通路中[9]。本研究進一步分析糖代謝相關通路中DEGs，并以基因的FPKM值作為表達水平，利用Heatmap軟件包進行層次聚類分析繪制熱圖。

1.2.3 數據分析 采用Microsoft Excel 2007和 SPSS 18.0軟件數據對進行處理和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不育系和可育系可溶性糖含量比較

在花藥發(fā)育時期對不育系和可育系進行比較發(fā)現(xiàn)，在花蕾中，不育階段除減數分裂時期外，‘05ms在小孢子發(fā)育和成熟花粉粒時期可溶性糖含量（w，后同）（21～24 mg·g-1）顯著低于‘S63（27～30 mg·g-1）;可育階段，‘05ms在減數分裂期、小孢子期和成熟花粉粒時期可溶性糖含量（16～19 mg·g-1）均顯著低于‘S63（24～27 mg·g-1）（圖1）。在葉片中，‘05ms中可溶性糖含量在不育階段和可育階段均顯著低于‘S63（圖2）。

2.2 不育系在不育期和可育期糖類相關代謝途徑差異表達基因分析

為了明確前期篩選出的1 771個與低溫不育相關的DEGs的功能，以KEGG注釋結果為參考，進一步統(tǒng)計分析與糖類代謝相關的DEGs，結果顯示（表1）共有85個DEGs與糖類代謝相關，涉及到15條糖類代謝途徑，DEGs數目排名前3位的依次是：淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生、氨基糖和核苷酸糖代謝，表明這3條通路與溫敏雄性不育的關系更為緊密。

2.3 不育系在不育和可育時期淀粉和蔗糖代謝通路差異基因表達分析

對不育系在ML、MH和MZ這3個育性階段的15個淀粉和蔗糖代謝通路中DEGs進行分析，依據RNA-seq測序結果的基因表達量FPKM值進行聚類并用熱圖展示（圖3）。結果發(fā)現(xiàn)DEGs被分為2類，第1類共涉及3個基因，高溫低表達，低溫高表達，只涉及葡萄糖合成通路;第2類共涉及12個基因，高溫高表達，低溫低表達，主要涉及到葡萄糖、果膠和半乳糖醛酸合成通路，麥芽糖合成通路和海藻糖合成通路各涉及1個基因。

在通路中進一步對DEGs進行功能分析，發(fā)現(xiàn)主要影響兩類代謝物的合成途徑（表2）。一類是葡萄糖合成途徑，有7個基因參與，約占總數的46.7%;另一類是半乳糖醛酸和果膠合成途徑，有6個基因參與，占總數的40.0%。其中基因Sme2.5_12729.1_g00004.1隨溫度變化表達水平變化最為劇烈，ML、MH和MZ階段表達量分別為0.46、139.03和0.17，此基因編碼β-葡萄糖苷酶，是一種水解酶，為β-D-葡萄糖生成的最后一步。

對淀粉和蔗糖代謝通路進行研究，發(fā)現(xiàn)UDP-葡萄糖醛酸4-差向異構酶（EC：5.1.3.6）有3個基因（表2），均表現(xiàn)為低溫低表達，高溫高表達;此酶主要影響半乳糖醛酸途徑（圖4），此途徑中6個DEGs在低溫不育條件下表達水平均下調（表2，圖3），果膠合成和水解受阻。

3 討論與結論

糖類是植物體內的主要有機物，對植物的生長發(fā)育、應激反應和產量形成等生命活動均起著重要作用[10]?；ㄋ幇l(fā)育過程中花藥壁細胞會積累一些營養(yǎng)物質（如核酸、蛋白質、碳水化合物和脯氨酸等）以供小孢子發(fā)育，而在不育系花藥或花粉中則相對缺乏[11]?？扇苄蕴呛偷矸凼腔ㄋ幇l(fā)育所需的主要營養(yǎng)物質，而且花藥壁細胞主要為果膠和纖維素。番茄溫敏雄性不育系‘T-4在夜溫為18 ℃的可育條件下，淀粉和糖含量均高于夜溫為12 ℃及24 ℃的不育條件下[11]。對辣椒細胞核雄性不育（GMS）系‘G06-77-2AB及細胞核質互作雄性不育（CMS）系‘C06-77-2A花蕾各發(fā)育時期的可溶性糖含量進行測定，發(fā)現(xiàn)均低于可育系，但在兩種不育系間無規(guī)律可循[12]。但對茄子CMS系可溶性糖、淀粉的研究表明，花蕾發(fā)育時期不育系可溶性糖含量高于保持系，推測可能是由于糖轉運受阻所致[13]。對小麥花藥中可溶性糖含量進行測定，發(fā)現(xiàn)不育系高于可育系，推測蔗糖的水解過程受阻導致糖積累異常，從而引起花藥敗育[14]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，茄子rTGMS系‘05ms在低溫不育和高溫可育階段葉片和花蕾中可溶性糖含量均低于相應可育系‘S63，推測由于營養(yǎng)物質不足導致花藥敗育。綜上所述，不育系中可溶性糖含量高或低均有可能造成雄性不育，但均說明花藥發(fā)育過程中糖代謝發(fā)生了紊亂。

糖類不僅是植物生長發(fā)育的碳源和能量來源，還可作為信號物質調節(jié)相關基因的表達和酶活性[9];同時，還可作為抗氧化物質調節(jié)植物對不良環(huán)境的適應能力[15]。糖代謝途徑在雄性器官發(fā)育中起著至關重要的作用，并保護雄配子體免受各種環(huán)境壓力[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，在花發(fā)育過程中，花藥吸收能力很強，溫度激活高代謝活性，通過消耗大量的糖來支持早期的花粉發(fā)育[18]。此外，葡糖糖是花藥中最重要的糖能量形式，淀粉作為花粉成熟的標志，為花粉萌發(fā)提供了能量儲備。無論是葡萄糖的減少，還是花藥中淀粉的虧缺，都會顯著損害花粉發(fā)育，導致雄性不育[19]。對棉花高溫敏感株系‘H05花藥進行RNA-seq測序，結果顯示DEGs在淀粉和蔗糖代謝通路顯著富集，高溫下可溶性糖含量明顯減少，蔗糖轉化為葡萄糖和果糖的途徑受阻，高溫擾亂了糖類代謝通路[20]。筆者對茄子rTGMS系‘05ms在不同溫度下的花蕾進行RNA-seq測序，對糖類相關代謝途徑進行深入分析，發(fā)現(xiàn)涉及到15條糖類代謝通路，其中差異基因富集最多的為淀粉和蔗糖代謝通路。在此通路中，有3個DEGs屬于β-葡萄糖苷酶（EC： 3.2.1.21），其功能是將纖維素二糖和纖維素寡糖水解成為葡萄糖，在低溫下Sme2.5_00140.1_g00012.1表達水平升高，然而Sme2.5_12729.1_g00004.1和Sme2.5_00021.1_g00012.1的表達水平降低，可見低溫下不育系花蕾中β-葡萄糖苷酶表達紊亂，其中，隨溫度變化最大的基因是Sme2.5_12729.1_g00004.1，高溫時期是低溫時期表達量的幾百倍，低溫不育時期幾乎不表達，推測β-葡萄糖苷酶表達受到強烈抑制，導致小孢子發(fā)育過程中葡萄糖缺乏，營養(yǎng)和能量不足，可能是引起小孢子敗育的重要原因之一。相似的，有研究報道西瓜細胞核不育系花蕾中β-葡萄糖苷酶不表達，可能導致小孢子發(fā)育過程中營養(yǎng)物質不足，最終導致小孢子敗育[21]。筆者還發(fā)現(xiàn)蔗糖轉移酶β-果糖呋喃苷酶（EC： 3.2.1.26），其功能是催化蔗糖分解為葡萄糖和果糖，在低溫下低表達，高溫下高表達。汪月[22]對小麥胞質不育系研究發(fā)現(xiàn)，β-果糖呋喃苷酶在花藥發(fā)育的單核期表達上調，蔗糖分解代謝比較旺盛，可能與絨氈層的降解關系密切;在二核期表達下調，蔗糖分解代謝減弱，可能與絨氈層提前降解完成有關。因此，筆者推測‘05ms低溫不育期β-果糖呋喃苷酶表達下調，僅為高溫時期的20%，不育系中絨氈層延遲降解完成[9]，可能與蔗糖分解代謝受抑制有關。

糖類在調控植物生長發(fā)育、逆境響應和生物防御反應等生理過程中發(fā)揮重要作用。盡管目前對糖代謝在花藥發(fā)育中的研究已經取得了許多進展，但是對于植物體內糖種類的多樣性及其生理功能的復雜而精細的調節(jié)機制來說，許多詳細的信息仍不明確。筆者將進一步研究茄子溫敏不育系在同一生長階段不同溫度下糖類代謝的變化，深入探討糖類調控花藥發(fā)育的機制，為推進茄子雄性不育系利用提供有力支撐。

筆者通過對茄子反向溫敏不育系‘05ms在不育期和可育期的花蕾進行生理指標測定和轉錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)不育系在低溫環(huán)境下可溶性糖含量降低，糖類代謝通路基因變化較多，淀粉和蔗糖代謝途徑基因大部分表達下調，表明糖類代謝對花藥發(fā)育起重要作用。

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