文亦芾 韓蓉蓉 單貴蓮 史亮濤 羅富成 趙小雪 曾黎瓊

摘? 要：研究柱花草在低磷條件下生長的分子機理和反應(yīng)機制。采用cDNA-SRAP分子標(biāo)記技術(shù)分離柱花草莖和葉在低磷脅迫下相關(guān)基因的差異表達片段，并對其進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，8對引物組合共擴增出差異片段195條，其中抑制型表達片段56條，誘導(dǎo)型表達片段92條，上調(diào)表達型差異片段36條，下調(diào)表達型片段11條，大小均在50～1000 bp之間。二次擴增后將特異性條帶回收后進行測序，通過BLAST比對，共比對出14條差異片段的同源序列，其中8個差異表達的核苷酸序列與已知功能基因（JCVI-FLLj-1K4未知mRNA、NBS-LRR型抗病蛋白、ATP合成酶、醛固酮還原酶、葉綠體RF2）有較高同源性，5個序列與假定基因或預(yù)測基因（UPF0051蛋白、蛋白酶啟動子、SCEI結(jié)合酶、吲哚-3-丙酮酸鹽單氧酶）同源性較高。本研究為篩選柱花草響應(yīng)低磷脅迫的差異基因提供參考。

關(guān)鍵詞：柱花草;磷脅迫;同源性;cDNA-SRAP;差異表達

中圖分類號：S541? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

Analysis of Differentially Expressed Genes in Low Phosphorus Stress of Stylosanthes Guianensis

WEN Yifu1， HAN Rongrong2， SHAN Guilian1， SHI Liangtao3， LUO Fucheng1， ZHAO Xiaoxue1，

ZENG Liqiong4

1. College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China; 2. College of Animal Science and Technology， Southwest University / College Herbivore Engineering Center of Chongqing， Chongqing 400715， China; 3. Research Institute of Tropical Eco-agriculture Sciences， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Yuanmou， Yunnan 651300， China; 4. Biotechnology and Germplasm Resources Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan? 650223， China

Abstract： The cDNA-SRAP molecular marker technique was used to isolate the differentially expressed genes of the stems and leaves of Stylosanthes under low phosphorus stress， and bioinformatics analysis was carried out to study the molecular mechanism and reaction mechanism of Stylosanthes growing under low phosphorus condition. A total of 195 differential fragments were amplified from 8 pairs of primer combinations. Among them， there were 56 inhibitory expression fragments， 92 inducible expression fragments， 36 upregulated expression fragments and 11 down-regulated expression fragments， and the sizes ranged from 50 to 1000 bp. After the second amplification， the specific bands were recovered and sequenced. Through blast alignment， the homologous sequences of 14 different fragments were compared， and the 8 differentially expressed nucleotide sequences had high homology with known functional genes （JCVI-FLLj-1K4 unknown mRNA， NBS-LRR type disease resistance protein， ATP synthase， aldosterone reductase， chloroplast RF2）， five sequences were highly homologous to the putative or predicted genes （UPF0051 protein， protease promoter， SCEI binding enzyme， indole-3-pyruvate monooxygenase）. This study has laid a foundation for screening differential genes in response to low phosphorus stress.

Keywords： Stylosanthes; phosphorus deficiency; homolog; cDNA-SRAP; differential expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.017

磷是植物生長發(fā)育的必需元素，參與植物體內(nèi)能量代謝、酶促反應(yīng)、糖分代謝、光合作用等生理生化反應(yīng)[1]。土壤中的磷由于強烈固定作用而難以移動，植物吸收的磷主要來自其根系所接觸到的土壤和離根表較近的土體，土壤中磷肥利用效率低，因此磷素供應(yīng)水平成為牧草生產(chǎn)中的主要限制因子之一[2]。在長期缺磷脅迫下，植物進化形成了一系列適應(yīng)缺磷土壤的形態(tài)、生理生化及分子機制[3]。

柱花草（Stylosanthes guianensis）多年生豆科植物，是世界上熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的放牧和刈割兼用型豆科牧草[4]，可以在低磷的酸性紅壤區(qū)生長，并具有較高產(chǎn)草量。柱花草對磷利用效率較高，屬于磷高效基因型植物[5]，在低磷條件下，磷高效基因型柱花草比磷低效基因型柱花草品種地上生物量高2～4倍，表現(xiàn)出既耐低磷又具有高產(chǎn)潛力的優(yōu)良基因型性狀[6]。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）即相關(guān)序列擴增多態(tài)性，是美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li等[7]于2001年在研究蕓薹屬（Brassica）植物中開發(fā)的一種檢測新型分子標(biāo)記技術(shù)，操作簡便、重復(fù)性好，近年來被廣泛應(yīng)用于植物遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析[8]、分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面。近年來，分子生物技術(shù)發(fā)展迅速，在柱花草的相關(guān)研究中也得到了廣泛的應(yīng)用。目前，有ISSR（inter-simple sequence repeats）[9]、RAPD（random amplified polymorphic DNA）[10-11]、AFLP（amplified fragment length polymorphisms）[12]、微衛(wèi)星標(biāo)記[13]等方面的研究報道。SRAP可應(yīng)用于cDNA研究[14]，現(xiàn)已應(yīng)用于耐低磷差異基因的分離[15]、不同生長階段的差異基因表達[16]、接種真菌后植物的差異表達等方面[17]。但cDNA-SRAP技術(shù)在柱花草差異表達基因分析方面的應(yīng)用鮮有報道。本研究利用前期試驗中優(yōu)化后的柱花草cDNA-SRAP反應(yīng)體系[18]， 以‘熱研5號為材料，利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，研究其在低磷脅迫下的基因差異表達，旨在為下一步開展柱花草耐低磷脅迫分子機制方面的研究提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

‘熱研5號柱花草由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所提供，本研究采用水培法，人工氣候箱育苗（光照14 h，通氣10 h，溫度為25～ 28 ℃），用正常磷濃度（2 mmol/L）的1/2 Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)柱花草至3～5葉，改用低磷濃度（20 μmol/L）的1/2 Hoagland營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在低磷脅迫0、1、3、7 d時取莖、葉，液氮速凍后于?80 ℃保存。

1.2? 方法

1.2.1? 柱花草RNA的提取和cDNA第一鏈的合成? 采用Trizol法提取柱花草莖的RNA，用天根RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取柱花草葉總RNA，DNase I消化總DNA，利用超微紫外分光光度計測定RNA濃度，用1%濃度的瓊脂糖電泳分析其純度;用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈。嚴格按照說明書進行操作。

1.2.2? 柱花草cDNA-SRAP擴增? 本研究用的引物（表1）參照張偉麗等[8]研究中的引物。優(yōu)化后的柱花草cDNA-SRAP反應(yīng)體系為[18]：總反應(yīng)體系為20 μL，模板用量200 ng，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，引物濃度為0.4 μmol/L，dNTP濃度為0.25 mmol/L，Taq酶用量為1 U。

cDNA-SRAP PCR反應(yīng)擴增體系為：94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，33 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，5個循環(huán);94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后4 ℃保存，擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.3? 差異片段的回收和二次PCR、克隆、測序? 先檢測后篩選出具有差異表達的片段，用75%乙醇反復(fù)擦洗膠板上含有目的基因條帶的凝膠（去除膠表面的雜質(zhì)），使其吸水變軟，然后將差異片段從聚丙烯酰胺凝膠上切膠回收，加30 μL ddH2O，室溫溶解24 h（讓膠中的核酸溶解到ddH2O中）后取10 μL作為模板再次PCR，所用引物和程序與最初反應(yīng)相同。用1%瓊脂糖凝膠檢測產(chǎn)物是否與原片斷大小相同，回收大小相同的目的條帶。

將回收的差異片段連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選。挑取陽性克隆PCR檢測后，送交上海生工進行測序。

1.2.4? 測序結(jié)果同源對比分析? 利用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST進行基因相似性比對，分析預(yù)測其功能。

1.2.5? 差異片段的半定量RT-PCR驗證? 為了確保cDNA-SRAP分析結(jié)果的可靠性，以柱花草β-actin基因為內(nèi)參，利用半定量RT-PCR（semi- quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction， SqRT-PCR）對部分差異表達基因進行驗證。以低磷脅迫0、1、3、7 d時的柱花草莖、葉為材料，重新提取總RNA、合成第一鏈后作為模板。利用Primer 5.0設(shè)計差異片段的特異引物（表2）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 柱花草RNA的質(zhì)量和cDNA質(zhì)量

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，由柱花草RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）可知，Trizol法提取柱花草莖的RNA帶型清晰完整。因為柱花草葉片含有多酚多糖等次生代謝物，Trizol試劑提取得到的葉片RNA有雜質(zhì)污染，不能滿足實驗要求，所以用天根RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取柱花草葉片的RNA，提出的RNA電泳結(jié)果顯示有多條帶，但是總體質(zhì)量較好，能滿足后續(xù)試驗要求。

2.2? 柱花草cDNA-SRAP擴增結(jié)果的分析

以合成的cDNA為模板進行SRAP-PCR擴增，由聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果可知（圖2），8對引物組合均能擴出清晰條帶，共擴出差異片段195條，大小均在50～1000 bp之間。

根據(jù)差異片段的有無和強弱將其分為以下幾種（表3）：抑制型表達、誘導(dǎo)表達、上調(diào)表達和下調(diào)表達。其中，誘導(dǎo)表達分為瞬時誘導(dǎo)和特殊誘導(dǎo)，瞬時誘導(dǎo)是指基因在低磷脅迫的某一特定時期開始表達，如低磷脅迫3、5、7 d;特殊誘導(dǎo)則是基因在某幾個時期進行表達，如某些基因在脅迫處理3 d開始表達，在5 d時表達受到抑制，在7 d時基因的表達又被開啟[15]。本研究誘導(dǎo)表達根據(jù)表達時間分為1 d誘導(dǎo)、3 d誘導(dǎo)、7 d誘導(dǎo)和特殊型誘導(dǎo)表達。抑制型表達片段有56條，誘導(dǎo)表達片段有92條，上調(diào)表達型差異片段36條，下調(diào)表達型片段11條。1 d誘導(dǎo)型33條，3 d誘導(dǎo)型23條，7 d誘導(dǎo)型20條，特殊誘導(dǎo)型16條。另外，有些片段在莖跟葉中均有表達，但是在莖葉中的表達量不同，這樣的組織差異型片段有7條，其中葉比莖表達量大的有5條。

柱花草莖與葉的差異表達也有差異。莖中抑制型表達基因片段有38條，占莖總差異表達基因總數(shù)的35.5%;誘導(dǎo)表達基因片段有45條，占總數(shù)的42.1%;上調(diào)表達型和下調(diào)表達型基因片段分別有17和7條，占總數(shù)的15.9%和6.5%。葉中抑制型表達基因片段有18條，占葉總差異表達基因總數(shù)的20.5%;誘導(dǎo)表達基因片段有47條，占總數(shù)的53.4%;上調(diào)表達型和下調(diào)表達型基因片段分別有19和4條，占總數(shù)的21.6%和4.5%。

2.3? 差異片段的二次擴增

選取條帶亮、表達量高的69條差異片段進行回收再擴增，部分PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖3），二次擴增產(chǎn)物只有一條特異條帶，且片段大小與目的片段一致。

2.4? 差異片段的克隆、測序及分析

將回收的二次擴增差異片段連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中。經(jīng)過藍白斑篩選，挑取白斑搖菌培養(yǎng)后，菌液檢測陽性克隆，最終獲得53個有效序列，重復(fù)率為76.8%。在NCBI上進行BLAST比對，共比對出14條差異片段的同源序列，其中9個差異表達的核苷酸序列與已知功能基因有較高同源性，5個序列與假定基因或預(yù)測基因同源性較高，剩余序列未找到同源序列，可能是一些新的柱花草與耐低磷相關(guān)基因，具體功能待進一步研究。8個同源基因的功能分別是JCVI-FLLj-1K4未知mRNA、NBS-LRR型抗病蛋白、醛固酮還原酶、葉綠體RF2、ATP合成酶，4個預(yù)測功能分別是UPF0051蛋白、蛋白酶啟動子、SCEI結(jié)合酶、吲哚-3-丙酮酸鹽單氧酶（表4）。

2.5? 差異片段的半定量RT-PCR驗證

為了確保cDNA-SRAP分析結(jié)果的可靠性，以柱花草β-actin基因為內(nèi)參，半定量RT-PCR方法是探討基因轉(zhuǎn)錄水平的有效手段，可用來檢測基因的表達及其變化情況，并可進行半定量分析，具有費用低、簡捷、靈敏、特異性等優(yōu)點，在特異性引物的引導(dǎo)下，它能夠從低豐度的mRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中擴增出近μg級的cDNA產(chǎn)物[19]，因此，采用該方法來研究差異基因在低磷脅迫下的表達模式。JCVI-FLLj-1K4未知mRNA基因和NBS- LRR型抗病蛋白在不同脅迫時間下呈差異表達，半定量RT-PCR的結(jié)果與cDNA-SRAP反應(yīng)結(jié)果吻合（圖4）。其中JCVI-FLLj-1K4未知mRNA?基因呈特殊誘導(dǎo)表達，NBS-LRR型抗病蛋白是在短時間內(nèi)抑制表達，長時間的低磷脅迫又重新表達。

3? 討論

磷能促進柱花草的生長、植株干物質(zhì)積累和植株對磷和氮量的吸收，適量的磷對柱花草的生長具有一定的促進作用[20]。磷元素也是植物生長發(fā)育中必不可少的營養(yǎng)元素，在植物的產(chǎn)量和種質(zhì)資源保存方面有重要作用。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)cDNA-SRAP技術(shù)應(yīng)用的報道有很多，如在煙草[21]、魔芋[22]、茶樹[23]、甘藍[24]等植物基因表達分析中的應(yīng)用，說明該技術(shù)的有效性，但有關(guān)柱花草耐低磷基因的差異表達相關(guān)應(yīng)用未見報道。本研究采用cDNA-SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，與張偉麗等[8]用SRAP分析柱花草遺傳多樣性所用模板DNA不同，cDNA-SRAP最佳反應(yīng)體系與其有所區(qū)別。本研究用優(yōu)化后cDNA- SRAP反應(yīng)體系對差異表達基因進行分析，可得到較好的效果。

通過cDNA-SRAP分子標(biāo)記技術(shù)分離柱花草響應(yīng)低磷脅迫相關(guān)基因的差異表達片段，得到較多的差異表達片段。差異片段類型參照蘇亮[15]劃分標(biāo)準(zhǔn)進行分類，分為抑制型、誘導(dǎo)型（1 d誘導(dǎo)、3 d誘導(dǎo)、7 d誘導(dǎo)、特殊誘導(dǎo)）、上調(diào)表達型和下調(diào)表達型。抑制型表達基因占總差異片段的28.7%，誘導(dǎo)型表達基因占總差異片段的47.2%，上調(diào)表達型基因占總數(shù)的18.5%，下調(diào)表達型基因較少，僅占5.6%。通過對差異片段的分析篩選出9個柱花草耐低磷相關(guān)基因，分別是JCVI- FLLj-1K4未知mRNA、NBS-LRR型抗病蛋白、ATP合成酶、醛固酮還原酶、葉綠體RF2、UPF0051蛋白、蛋白酶啟動子、SCEI結(jié)合酶、吲哚-3-丙酮酸鹽單氧酶。

ATP合成酶是細胞能量轉(zhuǎn)變過程中的關(guān)鍵酶[25]，葉綠體中ATP合成酶利用光能驅(qū)動跨膜質(zhì)子梯度合成ATP，植物所需的磷素缺少，會引起大量與能量合成有關(guān)的生物分子的減少，ATPase合成量減少，降低光合作用。王彥玲[26]指出在缺磷狀態(tài)下ATP合成酶β亞基在‘鄭58品種中發(fā)生表達下調(diào)，ATP合成酶σ亞基在‘昌7-2品種中發(fā)生表達下調(diào)現(xiàn)象，但在‘鄭單958品種中并沒有出現(xiàn)ATP合成酶的明顯差異性表達，這可能暗示了‘鄭單958適應(yīng)磷脅迫的環(huán)境，同時說明ATP合成酶在磷素不同的情況下會出現(xiàn)差異表達。本研究中ATP合成酶的差異片段與其同源性高達93%。而且，此差異片段在柱花草莖、葉中均有表達，只是在葉中表達量大于莖，屬于組織特異性差異表達片段。

薛瑩瑩等[27]認為NBS-LRR類為植物抗病基因，可能參與抗病信號的傳導(dǎo)，NBS結(jié)構(gòu)域是NBS-LRR基因編碼蛋白中最保守的部分，能夠結(jié)合ATP或GTP，含有8個保守基序，其中P-loop用于結(jié)合ATP或GTP的磷酸，Kinase-2a參與磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)等。其他有關(guān)上述基因的研究未見文章發(fā)表，本課題后期將進一步豐富柱花草耐低磷方面的探索，為研究柱花草耐低磷脅迫響應(yīng)的具體基因片段奠定基礎(chǔ)。

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