楊鑫 樊吳靜 李麗淑 何虎翼 唐洲萍

摘要：[目的]從土壤微生態(tài)角度研究不同覆蓋栽培模式對冬作馬鈴薯根際土壤真菌多樣性的影響，旨在為廣西冬作馬鈴薯生產(chǎn)探索最佳栽培模式。[方法]采用I lluminaMiseq高通量測序技術(shù)對馬鈴薯在黑地膜覆蓋栽培、稻草覆蓋栽培和常規(guī)栽培（對照）3種處理條件下的馬鈴薯全生育期根際土壤真菌群落進行多樣性分析。[結(jié)果]黑地膜覆蓋栽培的根際土壤真菌多樣性指數(shù)最高，其中黑地膜覆蓋栽培Simpson指數(shù)與稻草覆蓋栽培差異達顯著水平（P<0.05）;不同處理優(yōu)勢菌株種類和相對豐度隨著馬鈴薯生育進程呈現(xiàn)不同變化規(guī)律，子囊菌門均為最優(yōu)勢真菌門，其中黑地膜覆蓋栽培子囊菌門相對豐度最高，3種栽培模式的優(yōu)勢菌屬分別為頭束霉屬、田頭菇屬、被孢霉屬;在馬鈴薯生長后期，黑地膜覆蓋栽培處理的根際土壤中被孢霉菌、頭束霉屬、粉紅粘帚霉屬、枝頂孢屬的相對豐度比常規(guī)栽培處理的高，稻草覆蓋栽培處理鐮孢菌相對豐度較其他兩個處理的更低。[結(jié)論]黑地膜覆蓋栽培處理的根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性比稻草覆蓋栽培和常規(guī)栽培處理更加優(yōu)化和豐富，有利于土壤中有機質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化和有益微生物的生長繁殖，可為馬鈴薯生長發(fā)育提供充足的養(yǎng)分條件和穩(wěn)定的根際微生態(tài)環(huán)境;稻草覆蓋栽培可以緩解鐮孢菌引起的馬鈴薯土傳病害。

關(guān)鍵詞：高通量測序;根際土壤;真菌多樣性;黑地膜覆蓋;馬鈴薯

中圖分類號：$532文獻標志碼：A 文章編號：1008-0384（2020）02-0192-08

0 引言

（研究意義）真菌是土壤中一類重要的微生物，具有降解有機質(zhì)、驅(qū)動養(yǎng)分循環(huán)、促進植物生長、參與植物病蟲害生物防治等功能，是評價土壤質(zhì)量的生物指標。因此，研究根際土壤真菌多樣性對馬鈴薯土傳病害防控和土壤微環(huán)境改良具有重要意義。（前人研究進展）根際土壤真菌的多樣性在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡和土壤質(zhì)量方面起到了重要的作用，根際土壤是直接受植物根系及其分泌物影響的土壤區(qū)域，是土壤微生物與植物相互作用的重要場所，植物通過根系活動影響根際土壤的養(yǎng)分含量和土壤理化性狀，并改變根際微生物群落組成和多樣性。同時，根際土壤微生物多樣性和優(yōu)勢菌屬的變化，也會在一定程度上反映出土壤肥力和質(zhì)量的變化趨勢。傳統(tǒng)的土壤真菌研究方法，如平板培養(yǎng)法可以得到少部分的可培養(yǎng)真菌，但無法獲得其真菌群落結(jié)構(gòu)組成和功能等信息。高通量測序作為第二代測序技術(shù)，具有操作簡單、成本低、結(jié)果可信度高等優(yōu)勢，能夠一次并行地對幾百萬條，甚至上千萬條的DNA序列分別進行測序，有助于準確分析環(huán)境中微生物的組成和分布，能夠深入了解微生物群落組分在科、屬和OTU（Operational/axonomicUnits，指分類研究的個體，真菌分類中一般是指菌株）水平上的變化。徐雪雪等采用I lluminaMiseq方法，對不同溝壟覆膜種植模式下馬鈴薯連作的根際土壤真菌多樣性進行研究，認為采用全膜壟播種植處理的土壤真菌多樣性最高，半膜壟播種植對鐮孢菌引起的馬鈴薯病害有一定的防治作用。張國青等基于真菌ITSl高通量測序，證明環(huán)保肥料增效劑可明顯改善土壤真菌的種群結(jié)構(gòu)。姜曉芳通過高通量測序方法對全生育期馬鈴薯根際土壤微生物群落多樣性進行研究，結(jié)果表明：稻草包芯栽培模式可不同程度改變土壤的細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，提高土壤細菌群落多樣性，降低土壤真菌多樣性，在馬鈴薯生育關(guān)鍵期可通過提高土壤抑菌性真菌豐度來抑制某些病原菌的增長。（本研究切入點）目前，采用高通量測序分析技術(shù)對南方冬作區(qū)馬鈴薯不同覆蓋栽培模式下微生物多樣性的研究鮮有報道。（擬解決的關(guān)鍵問題）揭示不同覆蓋栽培模式下冬作馬鈴薯根際土壤真菌物種多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，探討在不同栽培模式下馬鈴薯全生育期根際土壤真菌多樣性的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1試驗地概況

試驗在廣西農(nóng)業(yè)科學院武鳴里建科研基地內(nèi)進行。該地區(qū)海拔117m，年均降水量1233.4mm，年平均氣溫21.9℃，無霜期360d.試驗地前茬作物為玉米，土壤為磚紅壤，0～20cm土層的基本理化性質(zhì)：pH值5.1，含速效氮120mg·kg^-1、速效磷39mg·kg^-1、速效鉀106mg·kg^-1、有機質(zhì)30.4g·kg^-1。

1.2 試驗設(shè)計

供試馬鈴薯品種為華薯l號，由華中農(nóng)業(yè)大學提供，一級原種。田間試驗采用單因素隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)3個處理，分別為：處理A，黑地膜覆蓋;處理B，稻草覆蓋;處理C（CK），無覆蓋的常規(guī)栽培，作為對照。各處理3次重復(fù)，共9個小區(qū)，小區(qū)面積24m²（每小區(qū)4行）。馬鈴薯采用單壟雙行種植，株距25cm.于2018年11月24日種植，2019年3月成熟收獲。

1.3 樣品采集

分別在馬鈴薯苗期（12月24日）、塊莖形成期（1月24日）、塊莖膨大期（2月9日）、淀粉積累期（2月24日）、塊莖成熟期（3月24日）采集土樣。采用五點取樣法在每個小區(qū)每隔4株間取樣，5個點的土樣混合均勻后為該小區(qū)的土樣。取樣時將馬鈴薯整株挖出，注意不傷到根系，輕輕抖落根系上較大土塊，用消毒過的毛刷刷下根系表面（約2～3mm）的土作為根際土壤樣品，土樣封裝到無菌封口袋中，用冰盒帶回實驗室置于-80℃冰箱保存，用于土壤微生物DNA提取及后續(xù)測定。

1.4根際土壤總DNA提取及測序

將采集的土壤樣品送到北京百邁克生物科技有限公司進行IlluminaMisep 2500高通量測序。利用前向引物ITSIF（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和反向引物ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對真菌ITSl區(qū)進行PCR擴增，PCR反應(yīng)采用20uL體系。PCR擴增條件為1×（5min、95℃）;35×（1min、95℃，1min、50℃，1min、72℃）;1×（7min、72℃）;4℃保存。

1.5數(shù)據(jù)分析與處理

根據(jù)PE Reads之間的Overlap關(guān)系，將測序得到的雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列Tags，同時對Reads的質(zhì)量和拼接效果進行質(zhì)控過濾。主要步驟：（1）使用FLASHvl2.7軟件，通過Overlap對每個樣品的Reads進行拼接，得到的拼接序列即原始Tags數(shù)據(jù)。（2）使用TrimmomaticV0.33軟件，對拼接得到的Raw Tags進行過濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)。（3）使用UCHIMEv4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）。信息分析內(nèi)容：劃分OTU，進行多樣性及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估及OTU聚類分析

對15個樣品ITS2區(qū)測序的原始數(shù)據(jù)進行PEReads拼接，Tags過濾和去嵌合體后，共得到1032153條有效序列，平均每個樣品有68810條有效序列，其中：處理A平均有效序列73157條、處理B平均有效序列73453條、處理C平均有效序列73021條，每條序列平均長度249bp、有效率達91.4%，具體見表1.

圖1是相似度為0.97條件下各土壤樣品的稀釋曲線，利用稀釋曲線可了解樣本間的物種多樣性和豐富程度，以及樣本取樣深度情況。圖1的橫坐標為樣本中隨機抽取的測序條數(shù)，縱坐標為該測序條數(shù)聚類得到的OTU數(shù)量，每條曲線代表表1的1個樣品，隨著測序條數(shù)的加大，曲線趨于平緩，表示此環(huán)境中的物種并不會隨著測序數(shù)量的增加而顯著增多，所有樣本文庫的測序深度指數(shù)在99.92%～99.97%。說明取樣合理，環(huán)境中真菌群落結(jié)構(gòu)的置信度高，能夠真實反映土壤樣本的真菌群落。

2.2 不同栽培模式冬作馬鈴薯根際土壤真菌群落多樣性分析

通過多樣性分析可以反映單個樣品物種多樣性和物種豐度，常用衡量指標有：ACE、Chaol、Shannon和Simpson，ACE和Chaol為物種豐富度指數(shù)，Shannon和Simpson為物種多樣性指數(shù)。ACE和Chaol指數(shù)越大，說明物種數(shù)量越多;Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品的物種多樣性越高。由表2看出，各處理的根際土壤真菌豐富度指數(shù)ACE排序為：處理C>處理B>處理A，豐富度指數(shù)Chao1排序為：處理C>處理A>處理B，3個處理之間的豐富度指數(shù)Chaol差異均達顯著水平;多樣性指數(shù)Simpson排序為：處理B>處理C>處理A，多樣性指數(shù)Shannon排序為：處理A>處理C>處理B，其中處理A與處理B的Simpson指數(shù)差異達顯著水平。由此可知，處理C馬鈴薯根際真菌豐富度最高，處理A馬鈴薯根際土壤真菌多樣性指數(shù)最高。

不同栽培模式處理的馬鈴薯全生育期根際真菌多樣性變化規(guī)律不同，處理A真菌多樣性指數(shù)Shannon表現(xiàn)為隨著生育進程呈先降低后升高再降低的趨勢，而處理B和處理C均表現(xiàn)為呈先升高后降低再升高最后又降低的趨勢。處理A₃多樣性指數(shù)Simpson與處理B₃差異達顯著水平，說明黑地膜覆蓋栽培比稻草覆蓋栽培可提高馬鈴薯塊莖膨大期根際土壤的真菌多樣性;與對照處理（C₃、C₄）相比，處理A（A₃、A₄）顯著提高了馬鈴薯塊莖膨大期到淀粉積累期真菌群落的物種豐富度指數(shù);與處理B（B₄、B₅）相比，處理A（A₄、A₅）提高了馬鈴薯淀粉積累期到成熟期真菌群落的物種豐富度指數(shù)，但差異不顯著。

2.3 不同栽培模式冬作馬鈴薯根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

由圖2可知，在門分類水平上不同處理間真菌群落結(jié)構(gòu)相似，主要有子囊菌門（Ascomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、絲足蟲類（Cercozoa），以及其他未分類真菌（Fungi-unclassified），其中：子囊菌門是優(yōu)勢菌門，處理A占比最高（76%），處理C占比69%，處理B占比58%;次優(yōu)勢菌門為被孢菌門，處理C占比最高（16%），處理A、處理B占比均為11%。擔子菌門比例以處理B最高（20%），而且處理A和處理C擔子菌門比例均為3%;處理B的絲足蟲類相對豐度比其他處理高，屬于特異菌門。

通過對馬鈴薯不同生育期門分類水平真菌群落結(jié)構(gòu)相對豐度的分析結(jié)果可知，處理A和處理C的子囊菌門相對豐度隨著馬鈴薯生育期推進變化不大，處理B的子囊菌門變化較明顯。處理A₃子囊菌門在塊莖膨大期相對豐度分別比處理B₃、處理C₃提高95%、38%，處理A真子囊菌門在淀粉積累期相對豐度比處理B，提高147%，處理A₁擔子菌門在苗期相對豐度分別比處理B₁、處理C₁提高50%、89%，處理A₅擔子菌門在塊莖成熟期相對豐度分別比處理B₅、處理C₅提高67%、40%，處理A₄擔子菌門相對豐度在淀粉積累期分別比處理B₄、處理C₄提高33%、300%。

由圖3可知，不同覆蓋栽培模式在屬分類水平上主要有被孢霉屬Mortierella、小不整球殼菌Plectosphaerella、頭束霉屬Cephalotrichum、假裸囊菌屬Pseudogymnoascus、粉紅粘帚霉屬Clonosmchys、田頭菇屬Agrocybe，所占比例均在4%～16%范圍。此外，還有鐮孢菌屬Fusarium、赤霉菌薯Gibberella、Mariannaea、毛殼菌屬Chaetomium所占比例較低，均在1%～3%之間。通過真菌群落豐度比例可知，處理A的優(yōu)勢屬為：頭束霉屬（相對豐度13%），次優(yōu)勢屬依次為被孢霉屬（相對豐度12%）、小不整球殼菌（相對豐度10%）、假裸囊菌屬（相對豐度6%）、粉紅粘帚霉屬（相對豐度5%）、鐮孢菌屬（相對豐度3%）;處理B優(yōu)勢屬為：田頭菇屬（相對豐度15%），其他菌屬依次為小不整球殼菌（相對豐度12%）、被孢霉屬（相對豐度11%）、頭束霉屬（相對豐度6%）、假裸囊菌屬（相對豐度6%）;對照處理C優(yōu)勢屬為：被孢霉屬（相對豐度16%），次優(yōu)勢屬依次為小不整球殼菌（相對豐度10%）、假裸囊菌屬（相對豐度7%）、頭束霉屬（相對豐度4%）。由此可見，不同栽培模式根際土壤真菌群落優(yōu)勢菌株種類和豐度存在較大差異，處理A和處理B的物種多樣性比處理C（對照）豐富。