吳麗群 張延明 趙麗杰

關(guān)鍵詞：TBP;β微管蛋白基因;分子標(biāo)記;遺傳多樣性;種質(zhì)資源親緣關(guān)系

DNA分子標(biāo)記技術(shù)因多態(tài)性高、檢測方法簡單、快速、表達(dá)產(chǎn)物不依賴于植物的發(fā)育階段和環(huán)境因素等優(yōu)點(diǎn)，在作物遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、重要性狀基因定位與克隆、種質(zhì)資源遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育分析、品種指紋圖譜繪制及遺傳純度檢測等方面應(yīng)用廣泛[1-2]。遺傳多樣性是種內(nèi)不同種群之間或一個(gè)種群內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異程度。遺傳多樣性的評估對于研究生物多樣性、種群動(dòng)態(tài)和生態(tài)關(guān)系非常重要，可以為研究物種起源、品種分類、親本選配、品種保護(hù)等提供依據(jù)，是支持新品種開發(fā)和研究，保護(hù)和利用現(xiàn)有種質(zhì)資源的重要基礎(chǔ)[3-5]。

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，基于特定基因家族或基因潛在可變區(qū)域來評估遺傳變異的技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，此方面的研究已在多種植物中報(bào)道過，其中內(nèi)含子長度多態(tài)性（intron length polymorphism，簡稱ILP）是研究特定基因家族內(nèi)含子的有效工具[6-7]。內(nèi)含子為非編碼序列，更容易積累變異，且內(nèi)含子的位置在物種間存在高度保守性[8]。微管蛋白基因家族對維持細(xì)胞的形態(tài)和功能及植物的正常生長發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用，而且廣泛參與調(diào)節(jié)植物的生物和非生物脅迫[9-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，植株的矮化與植物體中微管的減少、變短和分離相關(guān)[12]。侯董亮等研究表明，轉(zhuǎn)錄本號為PCP044487.1的β微管蛋白基因可能與梨矮生性狀形成的分子調(diào)控有關(guān)[13]。張海月等的研究結(jié)果表明，來自蘋果的β微管蛋白基因家族成員之一（轉(zhuǎn)錄本號為MDP0000749824.1）的表達(dá)水平，可能受激素調(diào)控的作用進(jìn)而對莖的伸長生長造成影響等[14]。因此，對β微管蛋白基因家族進(jìn)行研究具有重要意義。

基于微管蛋白多態(tài)性（tubulin-based polymorphism，簡稱TBP）分子標(biāo)記技術(shù)是通對植物β微管蛋白家族基因DNA內(nèi)含子的長度來評估遺傳變異，對于植物物種遺傳多樣性分析和植物分類學(xué)來說是非常有效的[15-18]。通過設(shè)計(jì)在兩側(cè)外顯子上的引物來檢測內(nèi)含子的長度，比引物設(shè)計(jì)在非編碼區(qū)域的分子標(biāo)記，更能直接反映基因內(nèi)的變異，且不受表型影響，操作簡單方便、試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，對廣泛生物的遺傳識別非常有用，具有更廣闊的應(yīng)用前景[19-21]。經(jīng)過近幾年的迅速發(fā)展，TBP分子標(biāo)記已應(yīng)用于多種植物的多個(gè)研究領(lǐng)域，在植物種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析等方面均取得了階段性的進(jìn)展，但未見相關(guān)中文報(bào)道。本研究對TBP標(biāo)記技術(shù)原理及在植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為該標(biāo)記的研究和應(yīng)用提供參考。

1 TBP分子標(biāo)記技術(shù)

1.1 TBP分子標(biāo)記技術(shù)原理

β微管蛋白是微管的主要組成成分之一，與α微管蛋白共同參與細(xì)胞形態(tài)的維持、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等活動(dòng)[22-25]。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物、植物、原生生物和真菌中的β微管蛋白氨基酸序列相似性高達(dá)88%以上[26-28]。目前為止，很多植物的β微管蛋白基因已被克隆或鑒定，例如在擬南芥中有9個(gè)β微管蛋白基因[29]、水稻中有8個(gè)[30]、玉米（Zea mays L.）中有6個(gè)[31]、毛果楊（Populus trichocarpa Torr. & Gray）中有20個(gè)[32]、美洲山楊（Populus tremuloides Michx.）中有20個(gè)[32]、旱柳（Salix matsudana Koidz.）和龍爪柳[S.matsudana var. tortusoa （Vilm.） Rehd.]中均有20個(gè)[26，33]，此外，亞麻（Linum usitatissimum L.）[34]、梨（Pyrus spp.）[28]、蘋果（Malus Mill.）[14]中已有關(guān)于β微管蛋白基因的報(bào)道。植物β微管蛋白基因的組成通常是保守的，有2個(gè)內(nèi)含子位于編碼區(qū)中的固定位置，且2個(gè)內(nèi)含子大小不一致[35]。所有植物β微管蛋白基因組第1個(gè)內(nèi)含子位于ATG密碼子的396個(gè)核苷酸位置，第2個(gè)位于742個(gè)核苷酸位置，其中玉米β微管蛋白基因（TUB1）和水稻β微管蛋白基因（TUB2）是例外，它們只有第1個(gè)內(nèi)含子[18]，不同的β微管蛋白基因的內(nèi)含子的長度是不同的。TBP分子標(biāo)記的原理如圖1所示。

1.2 TBP分子標(biāo)記的特點(diǎn)

傳統(tǒng)的隨機(jī)DNA分子標(biāo)記已被證明是有效且可靠的，但這些標(biāo)記也存在一定的缺點(diǎn)和不足。例如，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）標(biāo)記試驗(yàn)成本高、技術(shù)繁瑣、耗時(shí)較長，對樣本DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較為嚴(yán)格[36];隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）技術(shù)穩(wěn)定性和重復(fù)性不好，試驗(yàn)結(jié)果不夠可靠[37];簡單重復(fù)序列標(biāo)記（simple sequence repeats，簡稱SSR）技術(shù)引物開發(fā)成本高，且只能對重復(fù)序列區(qū)域進(jìn)行染色體定位等[38]。

與目前大多數(shù)分子標(biāo)記的方法相比，TBP分子標(biāo)記技術(shù)有如下特點(diǎn)[18，39]：（1）不需要有關(guān)植物基因組的序列信息;（2）基于β微管蛋白基因DNA序列，提供了一個(gè)幾乎是單個(gè)位點(diǎn)的靶點(diǎn)，而其他植物基因家族的成員往往在基因組中排列緊密;（3）不受進(jìn)化環(huán)境等條件約束;（4）引物具有通用性?；趦?nèi)含子非編碼區(qū)，設(shè)計(jì)引物簡單，可以使用1對通用引物來完成;（5）建立在以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，簡稱PCR）基礎(chǔ)之上，擴(kuò)增產(chǎn)物可用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測，試驗(yàn)過程操作簡單;（6）對DNA的質(zhì)量要求低、用量少、靈敏度高;（7）多態(tài)性豐富;（8）數(shù)據(jù)分析簡便。

1.3 TBP分子標(biāo)記的引物設(shè)計(jì)

植物β微管蛋白基因的第1個(gè)內(nèi)含子的位置是非常保守的，位于所有植物物種ATG密碼子的396個(gè)核苷酸位置。根據(jù)第1個(gè)內(nèi)含子序列的位置來設(shè)計(jì)TBP-F和TBP-R引物擴(kuò)增目的基因片段。目前已篩選并應(yīng)用于試驗(yàn)研究的引物總結(jié)如表1所示。

1.4 PCR反應(yīng)體系

TBP是PCR為基礎(chǔ)，其中PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素[42]。Bardini等通過試驗(yàn)，建立了以20 μL反應(yīng)體系為基礎(chǔ)的PCR檢測方法，發(fā)現(xiàn)最適條件：94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃延伸8 min，并保持在15 ℃，該反應(yīng)體系和條件已成功應(yīng)用于油菜（Brassica napus L.）、咖啡（Coffea Linn.）、亞麻等植物品種[18，39]。Gavazzi等對葡萄屬（Vitis）的植物進(jìn)行TBP分析，得出最佳PCR條件為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 45 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);最終在72 ℃延伸30 min[40]。

1.5 PCR 產(chǎn)物檢測

分子標(biāo)記的檢測主要利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳2種技術(shù)[43]。Bardini等的研究結(jié)果表明，6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測TBP分子標(biāo)記效果最好[18，39]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Gavazzi等研究出基于毛細(xì)管電泳和熒光檢測TBP的技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有試驗(yàn)操作可自動(dòng)化、速度快、分辨率高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)[41]。

2 TBP分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

2.1 遺傳多樣性分析

微衛(wèi)星簡單序列重復(fù)（sinple sequence repeat，簡稱SSR）因多態(tài)性高、數(shù)量豐富、重復(fù)性好、呈共顯性，且廣泛分布于基因組等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性的研究中[44]。

Bardini等利用TBP分子標(biāo)記方法研究了6個(gè)品種油菜的遺傳多樣性，并與SSR方法進(jìn)行比較分析[18]。凝膠電泳結(jié)果表明，2種方法均顯示了品種間和品種內(nèi)的多態(tài)性。通過對6個(gè)品種進(jìn)行266個(gè)指紋分析，主成分分析結(jié)果表明，TBP方法提供了關(guān)于遺傳相似性的信息，類似于使用SSR標(biāo)記獲得的結(jié)果。利用分子方差分析法（analysis of molecular variance，簡稱AMOVA）分析數(shù)據(jù)，驗(yàn)證2種方法在油菜品種間和品種內(nèi)的區(qū)別程度。TBP方法能夠檢測出品種間的方差為66%，品種內(nèi)的方差為34%，這些值與SSR分子標(biāo)記中80%和20%的值相差不大。此外，利用遺傳估算值比較分析2種方法在品種鑒定能力的相似性，得到的相關(guān)值為0.65（P>0001）。Rabokon等利用TBP和SSR分子標(biāo)記比較分析亞麻屬植物的遺傳變異與16個(gè)亞麻品種TBP的結(jié)果表明，樣品中均檢測到大量單一性條帶，多態(tài)信息含量（polymorphism information content，簡稱PIC）為0.48，Nei和Li的相似系數(shù)在大多數(shù)基因型中都在0.25～1.00范圍內(nèi)。SSR分析結(jié)果表明，在16個(gè)樣本中Nei和Li的相似系數(shù)值均在0.0～1.0之間，PIC分別在0.81～0.61之間[39]。以上研究結(jié)果證明，TBP可以成功地應(yīng)用于亞麻品種和基因型的鑒別，并且操作時(shí)間相對較少，不須要處理大量的數(shù)據(jù)。根據(jù)計(jì)算出的PIC，TBP數(shù)據(jù)同SSR分析中得到的數(shù)據(jù)一樣可靠，TBP方法對亞麻基因型的分辨具有較高的效率。Gavazzi等對來自葡萄屬37個(gè)材料進(jìn)行TBP分子標(biāo)記分析，并與6組SSR標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明TBP方法在葡萄屬基因分型領(lǐng)域具有可行性和可靠性[40]。

以上研究結(jié)果均表明，TBP分子標(biāo)記與SSR分子標(biāo)記的分析結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明TBP分子標(biāo)記的可靠性，且TBP分子標(biāo)記更能揭示供試材料的親緣關(guān)系，具有高效性，可以單獨(dú)使用，也可以和其他標(biāo)記方法同時(shí)使用，有利于減小單一標(biāo)記方法使用時(shí)的誤差。

2.2 種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析

近年來，由于各地域相互引種，種質(zhì)交流日益頻繁，不斷出現(xiàn)同物異名或同名異物的現(xiàn)象，這使得對種質(zhì)的鑒定提出了更高的要求。同時(shí)，通過傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)行品種的鑒別和雜種鑒定，其周期較長，而且表型性狀等形態(tài)學(xué)特征容易受到環(huán)境條件的影響[45-46]，因此TBP分子標(biāo)記的應(yīng)用為植物種質(zhì)鑒定研究提供了一種新方法，為豐富種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究提供一條新途徑。

Bardini 等利用TBP分子標(biāo)記對來自于不同國家的二倍體咖啡C. eugenoides 、C. canephora以及四倍體咖啡C. arabica進(jìn)行分析，在四倍體咖啡C. arabica樣本中均擴(kuò)增出4個(gè)TBP條帶，在C.canephora樣本中擴(kuò)增出其中3條，沒擴(kuò)增出的那條在C. eugenoides樣本中擴(kuò)增出來，支持C. eugenoides是C. arabica的祖源的假設(shè)[18]，這與Anthony等通過擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length play morphism，簡稱AFLP）和SSR標(biāo)記所獲得的研究結(jié)果[47]一致。此外，有研究者對5種百脈根（Lotus alpinus、 L. corniculatus、 L. angustissimus、L. tenuis、L. pedunculatus）進(jìn)行TBP分析，其中四倍體L. corniculatus樣本具有較好的多態(tài)性。在L. corniculatus樣本中發(fā)現(xiàn)，與四倍體L. alpinus以及二倍體L. tenuis和L. angustissimus樣本中相似的條帶，而在二倍體和四倍體的 L. pedunculatus 樣本中未發(fā)現(xiàn)，證明L. pedunculatus 不是L. corniculatus的祖先，這與Campos等的研究結(jié)果[48]一致。L. alpinus和L. tenuis的祖先可能是L. corniculatus，這與Roos等的研究結(jié)果[49]一致。此外，二倍體和四倍體的L. pedunculatus TBP條帶沒有差異，證明該四倍體是同源多倍體。相比較于表現(xiàn)出單一獨(dú)特模式的二倍體L. alpinus TBP結(jié)果，四倍體L. alpinus則具有更顯著的變化特征，表明四倍體L. alpinus并非源自二倍體L. alpinus的同源四倍體，更有可能來自2個(gè)二倍體物種之間的雜交。

此外，TBP分子標(biāo)記在大麥、水稻和小麥研究中也有應(yīng)用，但多態(tài)性低。目前，通過引物序列的修改已在菊花屬和木筒篙屬中成功地?cái)U(kuò)增出TBP條帶[18]。

3 問題與展望

TBP作為一種新型的分子標(biāo)記，已成功地應(yīng)用于大范圍的單子葉和雙子葉物種，并同SSR標(biāo)記獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，充分證明了TBP的可靠性。此外，TBP不需要植物基因組更多的信息，試驗(yàn)操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，該方法適合于評估遺傳多樣性和基因組起源。然而，與目前其他DNA分子標(biāo)記的方法相比，TBP分子標(biāo)記具有一定的局限性：（1） TBP方法只能檢測1組有限的標(biāo)記，與SSR或其他方法相比，需要大量試驗(yàn)材料來獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義的系統(tǒng)發(fā)育樹。（2） 對于高自交系栽培作物所獲得的遺傳多樣性水平低，原因可能是這些農(nóng)業(yè)作物的近親繁殖[18]。

筆者認(rèn)為，TBP分子標(biāo)記的利用應(yīng)加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的研究：（1） 大量開發(fā)具有材料特異性的TBP引物。TBP分子標(biāo)記引物的通用性強(qiáng)，但文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)量依然有限，無法滿足研究的需要。（2） 建立并優(yōu)化適合TBP分子標(biāo)記類型的PCR反應(yīng)體系。因?yàn)樵跇?biāo)記分析同一材料時(shí)，PCR最優(yōu)反應(yīng)體系存在差異，而同一標(biāo)記類型應(yīng)用于不同的材料時(shí)，其體系也存在不同[50]。因此，建立優(yōu)化適合特定材料的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，是應(yīng)用TBP分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。（3） 加強(qiáng)TBP分子標(biāo)記在種質(zhì)鑒定與指紋圖譜構(gòu)建的應(yīng)用。TBP作為一種新型分子標(biāo)記在油菜、咖啡、亞麻、葡萄等植物中表現(xiàn)出優(yōu)勢，成功應(yīng)用于品種的鑒別和雜種鑒定，不僅可以實(shí)現(xiàn)品種保護(hù)，而且還可以提高種質(zhì)純度，給生產(chǎn)與研究帶來了便利。雖然TBP分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用尚在起步階段，但相信隨著基因組學(xué)和檢測技術(shù)的發(fā)展，其在遺傳多樣性精確評價(jià)、種質(zhì)資源的評價(jià)與利用、種質(zhì)鑒定與輔助育種等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳則東，江 偉，馬龍彪. 分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)作物品種鑒定上的研究進(jìn)展及未來展望[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（33）：172-176.

[2]Koebner R M D，Powell W，Donini P. Contributions of DNA molecular marker technologies to the genetics and breeding of wheat and barley[J]. Plant Breed，2001，21：181-220.

[3]褚嘉祐，李紹武，張亞平. 努力推動(dòng)中國的遺傳多樣性研究[J]. 遺傳，2012，34（11）：1349-1350.

[4]宋憲亮，孫學(xué)振，張?zhí)煺?，? 棉花遺傳多態(tài)性研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，14（12）：2393-2397.

[5]楊洪升，王 悅，王長寶，等. 植物遺傳多樣性研究方法進(jìn)展[J]. 中國科技信息，2017（15）：47-48.

[6]趙 雪，謝 華，馬榮才. 植物功能基因組研究中出現(xiàn)的新型分子標(biāo)記[J]. 中國生物工程雜志，2007，27（8）：104-110.

[7]Rabokon N，Pirko Y，Demkovych A，et al. Intron length polymorphism of beta tubulin genes as an effective instrument for plant genotyping[J]. Mol Appl Genet（Minsk），2015，19：35-44.

[8]趙向前，吳為人. 水稻ILP標(biāo)記遺傳圖譜的構(gòu)建[J]. 遺傳，2008，30（2）：225-230.

[9]Hardham A R. Microtubules and biotic interactions[J]. The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2013，75（2）：278-289.

[10]Microtubules N P. Signalling and abiotic stress[J]. Plant Journal，2013，75 （2）：309.

[11]Hamada T，Ueda H，Kawase T，et al. Microtubules contribute to tubule elongation and anchoring of endoplasmic reticulum，resulting in high network complexity in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2014，166（4）：1869-1876.

[12]Catterou M，Dubois F，Schaller H，et al. Brassinosteroids microtubules and cell elongation in Arabidopsis thaliana.Ⅱ. Effects of brassinosteroids on microtubules and cell elongation in the bull mutant[J]. Planta，2001，212（5/6）：673-683.

[13]侯董亮，王彩虹，田義柯，等. 梨β-微管蛋白基因及其在矮生型與普通型梨莖尖中的表達(dá)差異[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2016，43（2）：320-328.

[14]張海月，肖玉雄，田義柯，等. 一個(gè)蘋果β-微管蛋白基因及其啟動(dòng)子序列特征分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2018，33（3）：78-85.

[15]Braglia L，Manca A，Mastromauro F，et al. cTBP：a successful intron length polymorphism （ILP）-based genotyping method targeted to well defined experimental needs[J]. Diversity，2010，2（4）：572-585.

[16]Pirko Y V. Studying of genetic diversity different species of plants by analyzing polymorphism of introns of tubulin genes[J]. Industr Bot，2011，11：152-156.

[17]Gianì S，Morello L，Bardini M，et al. Tubulin intron sequences：multi-functional tools[J]. Cell Biology International，2003，27（3）：203-205.

[18]Bardini M，Lee D，Donini P，et al. Tubulin-based polymorphism （TBP）：a new tool，based on functionally relevant sequences，to assess genetic diversity in plant species[J]. Genome，2004，47（2）：281-291..

[19]Wang X S，Zhao X Q，Wu W R. Genome wide investigation of intron length polymorphisms and their potential as molecular markers in rice （Oryza sativa L.）[J]. DNA Research，2005，12（6）：417-427.

[20]Hawkins J D. A survey on intron and exon lengths[J]. Nucleic Acids Research，1988，16：9893-9908.

[21]金谷雷. 植物內(nèi)含子進(jìn)化模式研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2007.

[22]Cleveland D W，Sullivan K F . Molecular biology and genetics of tubulin[J]. Annual Review of Biochemistry，1985，54（1）：331-366.

[23]Paredez A R，Somerville C R，Ehrhardt D W. Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules[J]. Science，2006，312（5779）：1491-1495.

[24]Nick P. Signaling to the microtubular cytoskeleton in plants[J]. Int Rev Cytol，1998，184（8）：33-80.

[25]Rasmussen C G，Wright A J，Miiller S. The role of the cytoskeleton and associated proteins in determination of the plant cell division plane[J]. The Plant Journal for Cell and Molecular Biology，2013，75（2）：258-269.

[26]睢金凱，饒國棟，張建國. 柳樹β微管蛋白基因家族的克隆和序列分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2016，36（5）：902-909.

[27]Harper J F，Mages W. Organization and structure of Volvox β tubulin genes[J]. Molecular and Genetics，1988，213（2/3）：315-324.

[28]Liaud M F，Binkmann H，Cerff R. The β tubulin gene family of pea：primary structures，genomic orgamzation and intron-dependent evolution of genes[J]. Plant Molecular Biology，1992，18（4）：639-651.

[29]Snustad D P，Haos N A，Kopczack S D，et al. The small genome of Arabidopsis contains at least nine expressed β-tubulin genes[J]. Plant Cell，1992，4（5）：549-556.

[30]Giani S，Breviario D. Rice β-tubulin mRNA levels are modulated during flower development and in response to external stimuli[J]. Plant Sci，1996，116：147-157.

[31]Villemur R，Haas N A，Joyce C M，et al. Characterization beta-tubulin genes and their expression during male flower development in maize （Zea mays L.）[J]. Plant Molecular Biology，1994，24（2）：295-315.

[32]Oakley R V，Wang Y S，Ramakrishna W，et al. Differential expansion and expression of α-and β-tobulin gene families in Populus[J]. Plunt Physiology，2007，145（3）：961-973.

[33]Rao G，Zeng Y，He C，et al. Characterization and putative post-translational regulation of α-and β-tubulin gene families in Salix arbutifolia[J]. Scientific Reports，2016，6：19258.

[34]Gavazzi F，Pigna G，Braglia L，et al. Evolutionary characterization and transcript profiling of β-tubulin genes in flax （Linum usitatissimum L.） during plant development[J]. BMC Plant Biology，2017，17（1）：237.

[35]Breviario D，Giani S，Ponzoni T，et al. Plant tubulin intronics[J]. Cell Biol Int，2008，32（5）：571-573.

[36]楊春勇，李海濤，李學(xué)蘭. 栽培沉香遺傳多樣性的ISSR 和AFLP分析比較[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2013，14（3）：553-559.

[37]時(shí)明芝，宋會(huì)興. 植物遺傳多樣性研究方法概述[J]. 世界林業(yè)研究，2005（5）：29-33.

[38]羅 冉，委 林. SSR分子標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，9（1）：137-143.

[39]Rabokon A N，Pirko Y V，Demkovych A Y，et al. Comparative analysis of the efficiency of intron-length polymorphism of β-tubulin genes and microsatellite locifor flax varieties genotyping[J]. Cytology and Genetics，2018，52（1）：1-10.

[40]Gavazzi F，Braglia L，Mastromauro F，et al. The tubulin-based polymorphism method provides a simple and effective alternative to the genomic profiling of grape[J]. PLoS One，2016，11（9）：p.e0163335.

[41]Gavazzi F，Anna P C，Claudia D. Technical improvement of the TBP （tubulin-based polymorphism） method for plant species detection based on capillary electrophoresis[J]. Electrophoresis，2012，33（18）：2840-2851.

[42]鄭景生，呂 蓓. PCR技術(shù)及實(shí)用方法[J]. 分子植物育種，2003，1（3）：381-394.

[43]鄭戈文. 農(nóng)作物種子檢測中常用電泳方法的比較分析[J]. 中國種業(yè)，2018（11）：35-37.

[44]王修業(yè)，李木旺，趙云坡，等. 結(jié)合SSR標(biāo)記和STS標(biāo)記對家蠶無鱗毛翅基因的定位[J]. 遺傳，2010，32（1）：54-58.

[45]王海崗，呂建珍，彭鎖堂. 作物種質(zhì)資源遺傳多樣性的評價(jià)方法[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（11）：26-27.

[46]龍治堅(jiān). 枇杷屬植物的遺傳多樣性分析和指紋圖譜初步構(gòu)建[D]. 重慶：西南大學(xué)，2013：18-20.

[47]Anthony F，Combes M C，Astorga C，et al. The origin of cultivated Coffea arabica L. varieties revealed by AFLP and SSR markers[J]. Theor Appl Genet，2002，104（5）：894-900.

[48]Campos L P，Raelson J V，Grant W F. Genome relationships among Lotus species based on random amplified polymorphic DNA （RAPD）[J]. Theor Appl Genet，1994，88（3/4）：417-422.

[49]Roos M D，Jones W T. The origin of Lotus corniculatus[J]. Theor Appl Genet，1985，71（2）：284-288.

[50]龍治堅(jiān)，范理璋，徐 剛，等. SCoT分子標(biāo)記在植物研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2015，16（2）：336-343.王小蓓，王秀靜，李麗霞. 潮間帶大型海藻小珊瑚藻蛋白質(zhì)提取方法及雙向電泳體系優(yōu)化[J].