李亞嬌 孫國琴 郭九峰

關(guān)鍵詞：草原蘑菇;ITS序列;分子系統(tǒng)發(fā)生學;系統(tǒng)進化樹;分化時間

系統(tǒng)發(fā)生（phylogeny）也稱系統(tǒng)發(fā)育、系統(tǒng)演化，是某一個類群的形成和發(fā)展過程，也就是進化或演化關(guān)系[1-2]。草原蘑菇主要生長在我國內(nèi)蒙古中部草原地區(qū)，在草原上形成蘑菇圈，維持牧草與草原蘑菇共生的生態(tài)體系[3]。目前對草原蘑菇分類的研究一直處于形態(tài)學分類研究階段，運用分子標記對其屬內(nèi)種類進行系統(tǒng)發(fā)生分析的研究還是比較滯后的。國內(nèi)外有大量關(guān)于運用系統(tǒng)發(fā)生學研究食用菌分類的報道[4-6]。武冬梅運用分子系統(tǒng)發(fā)生學探究新疆野生羊肚菌在物種水平上表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性[7]。劉曉亮等通過分子系統(tǒng)發(fā)育學對東北大小興安嶺地區(qū)的紅菇屬進行物種多樣性分析，共鑒定出23個紅菇屬物種，其中有3個種此前從未在我國報道過，分別是果香紅菇、暗紅紅菇和諾爾亞紅菇[8]。目前，利用草原蘑菇內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列進行系統(tǒng)發(fā)生學探究還未見報道，本研究通過18S和ITS 2組通用引物擴增草原蘑菇基因組DNA片段，產(chǎn)物直接測序，結(jié)合BLAST、MEGA 6.0等生物信息學軟件進行序列比對、遺傳參數(shù)計算，以及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹、分子鐘等[9-11]，以期為草原蘑菇的鑒定、進化分類及遺傳育種方面的深入研究提供數(shù)據(jù)參考。

核糖體DNA（rDNA）中既包含保守的編碼區(qū)18S、5.8S和28S，適合種以下水平的研究[12-13]，又包含進化速率較快的非編碼區(qū)，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和2（ITS1和ITS2）以及非轉(zhuǎn)錄區(qū)，承受的進化選擇壓力較小，進化速度較快，適合屬以下水平的研究[14-15]。因此，常選用18S和ITS通用引物作分子標記研究不同分類地位的物種間關(guān)系[16]。這在食用菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育中已有大量應(yīng)用[17]，錢雪婷等基于ITS序列分析秦巴山區(qū)黑木耳菌株的遺傳多樣性，為今后秦巴山區(qū)黑木耳菌株的遺傳多樣性及優(yōu)良品種的遺傳育種奠定了理論基礎(chǔ)[18]。戴淑娟等對采自新加坡的多孔菌基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，該新種屬于變色臥孔菌屬分支的一個明確的支系[19]。劉麗娜等利用ITS序列分析一個子實體菌蓋為酒粉紅色的金針菇新變型，結(jié)果表明，該變型同一子實體具有5種不同的ITS序列，表明金針菇存在豐富的種內(nèi)遺傳多樣性[20]。本研究采用18S和ITS 2組通用引物擴增產(chǎn)物直接測序，對測序結(jié)果進行比對，2組測序結(jié)果互相印證補充，可使結(jié)果更加可靠。

草原蘑菇是內(nèi)蒙古錫林郭勒草原產(chǎn)出的上品山珍，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，是珍稀的食藥用菌[21-22]。草原蘑菇主要品種有白蘑、黑蘑、香杏蘑、雞爪蘑、珍珠蘑等，被譽為“草原明珠”“口蘑之王”等[23]。草原蘑菇以草-牧-菌循環(huán)的獨特生長方式維系著大草原的生態(tài)平衡。近年來，草原氣候干旱、退化日益嚴重，載畜量增加，加之人們過度采食，使這一珍貴的野生草原蘑菇自然生存條件愈加惡化，甚至瀕臨滅絕，其資源保育、馴化及利用研究任務(wù)艱巨，而且目前市場上的草原蘑菇種類混亂，以次充好、胡亂命名等現(xiàn)象時有發(fā)生，令人真?zhèn)坞y辨[24]。本研究從本質(zhì)上對內(nèi)蒙古中部草原地區(qū)草原蘑菇品系進行鑒定，通過形態(tài)學與分子標記相結(jié)合，研究各菌株之間的親緣關(guān)系和分化時間，以期為后續(xù)草原蘑菇的種質(zhì)資源創(chuàng)新和利用、草原蘑菇品種選育和遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

草原白蘑和草原黑蘑采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟白音錫勒草原地區(qū)，草原白蘑編號為草原白蘑74～89號，包含蒙古口蘑、花臉香蘑、青腿子等;草原黑蘑編號為蒙白音1～73號，其中，1～37號為白色鱗片，38～73號為棕色鱗片。

1.2 DNA提取

1.2.1 子實體DNA提取 將供試子實體置于 65 ℃ 烘箱內(nèi)8 h烘干，然后置于微量植物樣品粉碎機內(nèi)粉碎，分裝于離心管內(nèi)，做好標記以備DNA提取。稱取適量子實體粉末用天根試劑盒提取DNA[25]。

1.2.2 菌絲體DNA提取 提取適量菌絲體，置于液氮中研磨后用天根試劑盒提取DNA。

1.3 PCR擴增

18S序列通用引物（18S上和18S下）堿基序列為18S上：GTAGTCATATGCTTGTCTC;18S下：TCCGCAGGTTCACCTACGGA。

ITS序列通用引物（ITS1和ITS4）堿基序列為ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

PCR擴增采用20 μL反應(yīng)體系，包括Mix 10 μL，引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性40 s，45 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán);72 ℃繼續(xù)延伸10 min，4 ℃保存。電泳條件：1.2%瓊脂糖凝膠，電壓為100 V。

用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，檢測合格后送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.4 序列比對、序列的數(shù)據(jù)分析及系統(tǒng)進化分析

將測序結(jié)果在NCBI中進行BLAST比對，根據(jù)比對序列結(jié)果及形態(tài)特征，確定食用菌名稱和相關(guān)菌種信息。選擇羊肚菌為外類群，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用MEGA 6.0軟件進行保守位點、變異位點、簡約信息位點、單一位點、簡并態(tài)密碼子、CpG島、覆蓋率、種內(nèi)種間遺傳距離、分子鐘、鄰接（neighbor-joining method，簡稱NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以自展法（Bootstrap 1 000次重復(fù)）檢驗各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

將采集到的草原蘑菇按照子實體顏色、大小、形狀等特征進行形態(tài)學分類[26]，然后通過ITS序列擴增產(chǎn)物，比較序列間的差異，來建立群體之間的親緣、進化關(guān)系，從而從本質(zhì)上進一步鑒定[27]。

2.1 形態(tài)描述

2.1.1 蒙白音系列 草原黑蘑別稱白鱗蘑菇，屬傘菌目蘑菇科蘑菇屬。蒙白音系列子實體為白色和棕色2類，菌蓋直徑為6～15 cm，半球形至平展，中部鱗片厚而大，龜裂明顯，有時留有菌幕殘片。菌裙初期為白色，漸變?yōu)榉奂t色至黑褐色。菌褶初期為肉色，密，離生，不等長，隨著子實體生長發(fā)育成熟變?yōu)楹稚梁诤稚＞鷮嵭陌咨鼒A柱形，菌柄長5.0～7.5 cm，粗0.7～7.0 cm。孢子呈卵圓形、橢圓形至長橢圓形，孢子印為黑色、表面光滑，孢子大小為（5～10） μm×（4～7） μm。

2.1.2 白蘑系列 蒙古口蘑屬傘菌目口蘑科口蘑屬或白麗傘屬，別稱白蘑、口蘑、珍珠菇、查干蘑等。子實體通體純白色，初期半球形至成熟期菌蓋平展呈傘形，成熟子實體菌蓋直徑為5～17 cm，菌肉厚硬為白色，初期菌蓋邊緣內(nèi)卷;菌褶白色，稠密，彎生，不等長;菌柄粗壯，白色內(nèi)實，長3.5～7.0 cm，粗 1.5～4.6 cm，柄基部稍大。擔孢子呈腎形或橢圓形，孢子印為白色，表面光滑，孢子大小為（4～6） μm×（6～9） μm。

花臉香蘑屬傘菌目口蘑科香蘑屬，別稱白花臉。子實體菌蓋為白色，初期扁半球形至成熟期菌蓋平展邊緣上翹呈斗笠狀，邊緣水漬狀烏白色，成熟子實體菌蓋直徑為4.0～8.0 cm，菌肉較厚白色;菌褶白色，直生或彎生，稍稀，不等長;菌柄中粗，白色，長3.5～7.0 cm，粗0.5～2.0 cm，內(nèi)實，靠近基部常彎生。孢子呈橢圓形至近卵圓形，孢子印為白色，具粗糙麻點，孢子大小為（3～5） μm×（6～10） μm。

青腿子屬傘菌目口蘑科香蘑屬。子實體菌蓋純白色，初期半球形至成熟期菌蓋平展邊緣上翹，成熟子實體菌蓋直徑為10～22 cm。菌肉較厚白色，初期邊緣內(nèi)卷;菌褶白色，稠密，彎生，不等長;菌柄中粗，白色，長3.5～7.0 cm，粗0.8～3.0 cm，內(nèi)實，基部稍大，柄由下向上青色光澤逐漸變深。孢子呈橢圓形至近卵圓形，孢子印為白色，具粗糙麻點，孢子大小為（3～5） μm×（6～10） μm。

2.2 草原蘑菇序列分析

利用MEGA 6.0軟件統(tǒng)計89株草原蘑菇ITS基因序列，保守位點（conserve）數(shù)為275/544，變異位點（variable）數(shù)為268/544，簡約信息位點（parsim-infor）數(shù)為180/544，單一位點（singleton）數(shù)為88/544，簡并位點zore-fold為319/544、tow-fold為62/544、four-fold為40/544，CpG為30/544。89株草原蘑菇ITS序列G+C堿基含量分析結(jié)果見圖1，黑蘑G+C堿基平均含量為42.73%，白蘑G+C堿基平均含量為4114%，G+C的含量明顯低于A+T的含量，白蘑G+C的含量低于黑蘑G+C的含量。

2.3 遺傳距離、親緣關(guān)系及分化時間分析

ITS基因序列遺傳距離計算結(jié)果見表1，屬內(nèi)遺傳距離較小而屬間遺傳距離較大，黑蘑和白蘑種間遺傳距離為0～0.45，其中黑蘑種內(nèi)遺傳距離為0～0.05，白蘑種內(nèi)遺傳距離為0～0.24。說明黑蘑之間進化距離較近，白蘑之間進化種類具有多樣性（其中沒有標出的編號遺傳距離均為0）。

以測得ITS序列為依據(jù)，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，用羊肚菌（KX809733）作為外類群（圖2），并用最大似然估計（maximum likelihood）法驗證分類結(jié)果的準確性，結(jié)果表明，2種方法構(gòu)建的進化樹關(guān)系基本一致，89株草原蘑菇可分為3組，A組為黑蘑，B、C組為白蘑，白蘑遺傳多樣性較豐富，黑蘑則相對較少，34號與1～73號（除34號外）有相對差異外，其他基本相同，與遺傳距離矩陣相符。

利用ITS基因序列，計算草原蘑菇之間的分化時間。結(jié)果（圖3）表明，黑蘑和白蘑的分化時間為11萬年前，其中黑蘑中34號與其他黑蘑分化時間為3萬年前，白蘑中B類群和C類群分化時間為1萬年前。不同屬內(nèi)草原蘑菇分化時間較長，同一屬內(nèi)的草原蘑菇之間分化時間較小。

3 結(jié)論

ITS序列己被廣泛應(yīng)用于食用菌的科、屬級水平類群的親緣關(guān)系系統(tǒng)發(fā)育分析[28-29]。本研究將形態(tài)學分類與ITS序列相結(jié)合，用于內(nèi)蒙古中部地區(qū)的89株草原蘑菇親緣關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)屬內(nèi)遺傳距離較小親緣關(guān)系較近，而屬間遺傳距離較大。通過計算分化時間，白蘑和黑蘑分化于11萬年前，其中34號黑蘑與其他黑蘑分化于3萬年前，白蘑中B組與C組于1萬年前分化。采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，用最大似然估計法驗證分類結(jié)果，最終2種方法構(gòu)建的進化樹關(guān)系基本一致。從構(gòu)建的進化樹可以看出，89株草原蘑菇可分為3組，黑蘑為1組，黑蘑遺傳較穩(wěn)定，白蘑分為2組，白蘑的遺傳多樣性較豐富，很有可能是由于當?shù)氐臍夂驐l件引起的，如干旱、紫外線過強、晝夜溫差過大導致變異。針對草原白蘑的遺傳多樣性狀況，可以認為內(nèi)蒙古中部地區(qū)草原白蘑具有較高的進化潛力和適應(yīng)能力。內(nèi)蒙古屬干旱、半干旱地區(qū)，常年干旱少雨，近些年尤為嚴重，加之濫采濫挖造成野生草原蘑菇瀕臨滅絕，本研究在物種多樣性的研究基礎(chǔ)上結(jié)合ITS片段分析，對野生草原蘑菇的資源保護及如何利用分類結(jié)果進行人工馴化栽培具有指導意義。

草原蘑菇具有一定的遺傳多樣性，當?shù)啬撩穸嘁孕螒B(tài)學來定義其種類，即外觀層面，則造成定義混亂，存在一定的偏差，因此，僅依據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)特征來進行草原蘑菇的分類方法受到了越來越大的挑戰(zhàn)，不能得到分子數(shù)據(jù)的支持。通過基于ITS分子層面測序，發(fā)現(xiàn)至少存在3個屬，具有屬間多態(tài)性，那么若要具體到種間分類將更加混亂，所以還需要新的分子標記方法進行進一步的分類、探索，充分地挖掘草原蘑菇資源。

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