肖金星 王磊 鄭剛

關(guān)鍵詞：黑鯛;硒化多糖;存活率;免疫力;抗氧化性能

硒（Se）已被證明是動(dòng)物必需的微量元素，在機(jī)體的生長、免疫和抗氧化等方面具有重要作用[1-2]。硒在硬骨魚類的新陳代謝中發(fā)揮著重要作用，關(guān)于硬骨魚類的硒需求量已開展了大量研究[3-4]。膳食硒不足可導(dǎo)致魚類攝食率降低、生長緩慢、免疫力降低等，而膳食硒過量會(huì)導(dǎo)致飼料效率降低、抑制生長和生物毒性等[5-7]，因此，適量的膳食硒對(duì)魚類的生長至關(guān)重要。自然界中的硒分為有機(jī)硒和無機(jī)硒2種形式，與無機(jī)硒相比，有機(jī)硒具有較高的抗氧化性、硒保留率、消化率和生物可利用度，而且具有較低的毒性[8-10]。硒化多糖是一種新型的有機(jī)硒，具有較強(qiáng)的抗氧化性能[11-12]。研究表明，多糖經(jīng)過硒化修飾可增強(qiáng)其抗氧化和抗凝血活性[13]。然而，目前關(guān)于硒化多糖作為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物膳食硒源，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力和抗氧化性能影響的研究較少。

黑鯛（Acanthopagrus schlegelii），具有廣溫、廣鹽性、抗逆性強(qiáng)、生長迅速、肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，是人工養(yǎng)殖和沿海增殖放流的優(yōu)良品種，市場前景廣闊[14-15]。黑鯛的養(yǎng)殖模式主要以海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖和海水池塘養(yǎng)殖2種為主，隨著黑鯛養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大、集約化程度不斷提高及海水污染日益嚴(yán)重，黑鯛養(yǎng)殖細(xì)菌性、寄生蟲性、病毒性病害頻發(fā)[16]，給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，而鑒于傳統(tǒng)藥物對(duì)食品安全和環(huán)境的危害，開發(fā)高效的新型安全免疫增強(qiáng)劑成為當(dāng)務(wù)之急。攻毒試驗(yàn)是免疫增強(qiáng)劑效果最直觀的反映方式。本試驗(yàn)研究了硒化多糖對(duì)攻毒試驗(yàn)后黑鯛存活率、免疫力和抗氧化性能的影響，為黑鯛飼料免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 攻毒試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)用黑鯛幼魚由浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗(yàn)場提供，養(yǎng)殖于浙江省海洋水產(chǎn)研究所西軒島試驗(yàn)基地室內(nèi)流水系統(tǒng)中。挑選體質(zhì)健康、大小均勻、初始體質(zhì)量為（13.00±0.20） g的黑鯛幼魚隨機(jī)分為6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25尾，放入容積為310 L（水體260 L）的玻璃纖維缸內(nèi)微流水式飼養(yǎng)8周。海水經(jīng)沉淀、過濾后使用，流速控制在 2 L/min，平均水溫為（27±1） ℃，鹽度26～29 g/L，溶解氧>5.0 mg/L。養(yǎng)殖試驗(yàn)期間，試驗(yàn)黑鯛分別投喂6組飼料（D1～D6），每天投喂2次，投喂時(shí)間分別為08：00和16：00，每次投喂至眼觀飽食狀態(tài)。

黑鯛經(jīng)過8周的飼養(yǎng)試驗(yàn)，每缸隨機(jī)選取10尾，腹腔注射培養(yǎng)24 h的副溶血弧菌液0.2 mL/尾，菌液濃度為5.5×108 CFU/mL，開展為期10 d的攻毒試驗(yàn)，攻毒期間正常飼養(yǎng)。每日記錄各試驗(yàn)組黑鯛死亡率。

1.2 飼料配方

基于筆者所在研究團(tuán)隊(duì)前期黑鯛飼料營養(yǎng)需求研究結(jié)果，配制6組等氮等能飼料（D1～D6）。D1～D6組試驗(yàn)飼料分別添加硒化多糖，使得試驗(yàn)飼料中外源有機(jī)硒的添加量為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、3.0 mg/kg。硒化多糖由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行制備，通過殼寡糖與亞硒酸鈉螯合而成，分子量為50 ku，硒含量的實(shí)測值為 17.7 mg/g。飼料原料粉碎過80目篩，充分均勻混合后，制成直徑為2.5 mm的硬顆粒飼料，采用空調(diào)抽濕、風(fēng)扇干燥72 h，分裝標(biāo)記后置于-20 ℃冰柜中保存?zhèn)溆?。測定試驗(yàn)飼料D1～D6中硒的含量分別為0.34、0.52、0.68、091、1.08、3.06 mg/kg。各組試驗(yàn)飼料配方組成及營養(yǎng)成分值見表1。

1.3 樣品采集及分析測定

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)魚饑餓24 h后，采用MS-222（60 mg/L）麻醉，記錄每缸試驗(yàn)魚數(shù)目，測量體長、體質(zhì)量。所有試驗(yàn)魚尾靜脈取血，置于離心管中，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min 離心15 min，取上層血清，立即用液氮快速冷凍，然后保存于-80 ℃冰箱中，待分析用。

血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活力和MDA含量，采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，用SPSS 16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）后采用Tukeys多重比較檢驗(yàn)，顯著水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒化多糖對(duì)攻毒試驗(yàn)后黑鯛血清免疫力的影響

由圖1可知，在給黑鯛注射副溶血弧菌10 d后，隨著飼料中硒含量的增加，黑鯛血清溶菌酶（LZM）活性呈現(xiàn)升高的趨勢，飼料中硒含量為 3.06 mg/kg 的試驗(yàn)組黑鯛血清LZM活性最高，顯著高于除飼料硒含量為0.91、1.08 mg/kg之外的其他各試驗(yàn)組（P<0.05）。

2.2 硒化多糖對(duì)攻毒試驗(yàn)后黑鯛血清抗氧化性能的影響

由圖2、圖3和圖4可知，在給黑鯛注射副溶血弧菌10 d后，隨著飼料中硒含量的增加，黑鯛血清超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活性均呈現(xiàn)升高趨勢，且均在飼料中硒含量為3.06 mg/kg的試驗(yàn)組達(dá)到最大值，顯著高于飼料中硒含量為0.34、0.52和 0.68 mg/kg 的試驗(yàn)組（P<0.05），但與飼料中硒含量為0.91、1.08 mg/kg的試驗(yàn)組沒有顯著差異（P>0.05）。

由圖5可知，在給黑鯛注射副溶血弧菌10 d后，隨著飼料中硒含量的增加，黑鯛血清丙二醛（MDA）含量呈現(xiàn)降低的趨勢，在飼料中硒含量為3.06 mg/kg的試驗(yàn)組達(dá)到最小值，顯著低于除飼料中硒含量為0.91、1.08 mg/kg之外的各試驗(yàn)組（P<0.05）。

2.3 飼料中添加硒化多糖對(duì)攻毒試驗(yàn)后黑鯛累積死亡率的影響

由圖6可知，在給黑鯛注射副溶血弧菌10 d后，黑鯛的累積死亡率隨著飼料中硒含量的增加呈現(xiàn)降低的趨勢，飼料中硒含量為1.08、3.06 mg/kg的試驗(yàn)組黑鯛的累積死亡率最低，顯著低于除飼料中硒含量為0.91 mg/kg之外的各試驗(yàn)組（P<005）。

3 討論與結(jié)論

3.1 飼料中添加硒化多糖對(duì)攻毒試驗(yàn)后黑鯛免疫力的影響

魚類是特異性免疫和非特異性免疫并存的脊椎動(dòng)物，但與哺乳動(dòng)物相比，魚類特異性免疫機(jī)制還不完善，在抵御病原微生物時(shí)主要依賴非特異性免疫發(fā)揮作用[17]。溶菌酶通過引發(fā)溶菌反應(yīng)和作為調(diào)理素發(fā)揮其抗菌活性[18-19]，是反映動(dòng)物非特異免疫功能的重要生理指標(biāo)。許多研究表明，免疫增強(qiáng)劑可以提高魚類血清溶菌酶的活力，例如陳興發(fā)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以提高羅非魚的血清LZM活力[20]。宋曉玲等將0.1%和1.0% 2種濃度的肽聚糖懸液注射入牙鲆體內(nèi)，測定發(fā)現(xiàn)牙鲆血清溶菌酶活性顯著提高[21]。郭玉娟等研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加250～450 mg/kg的肽聚糖可顯著提高彭澤鯽的血清溶菌酶活力[22]。硒能增強(qiáng)動(dòng)物的體液和細(xì)胞免疫功能[23]，Low等將絲鰭毛足鱸暴露于含硒 05 g/m3 的水體2周后，發(fā)現(xiàn)絲鰭毛足鱸血漿溶菌酶活力升高33.72%[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加硒化多糖可以顯著提高副溶血弧菌感染黑鯛的血清LZM活力，當(dāng)飼料硒含量低于0.91 mg/kg時(shí)，黑鯛的血清LZM活力隨著飼料硒含量的增加顯著升高（P<0.05），當(dāng)飼料硒含量高于0.91 mg/kg時(shí)，黑鯛的血清LZM活力不再顯著升高（P>0.05）。這可能是因?yàn)轱暳衔蛔銜r(shí)，補(bǔ)充膳食硒能夠提高黑鯛血清LZM活力，而膳食硒滿足黑鯛需求后，繼續(xù)補(bǔ)充膳食硒對(duì)黑鯛血清LZM活力沒有顯著影響。研究結(jié)果表明，硒化多糖能夠提高副溶血弧菌感染后黑鯛的免疫力，以增強(qiáng)其對(duì)副溶血弧菌感染的抵抗力。以免疫力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，黑鯛對(duì)飼料中硒的最適需求量為0.91 mg/kg。

3.2 飼料中添加硒化多糖對(duì)攻毒試驗(yàn)后黑鯛抗氧化性能的影響

血清中SOD、CAT和GPx活性以及MDA含量是反映血清抗氧化能力的重要指標(biāo)[25-27]。SOD可以催化超氧陰離子形成H2O2和O2[28]，隨后H2O2在GPx和CAT的作用下分解生成水和氧氣[29-30]。GPx、SOD和CAT被認(rèn)為是細(xì)胞防御功能的第1道防線，GPx和SOD活性以及兩者之間的平衡對(duì)于抵抗氧化損傷具有重要的保護(hù)作用[31]。硒是GPx的重要組成部分[32]，GPx的活性與機(jī)體硒含量密切相關(guān)，在異育銀鯽[33]、鯉魚[34]，飼料中添加硒能顯著增加魚體GPx活力，且GPx活力與硒添加量呈正相關(guān)關(guān)系。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，通常被作為檢測氧化損傷的重要指標(biāo)[35]。Burhan等研究發(fā)現(xiàn)，適量添加亞硒酸鈉能使虹鱒血清MDA含量降低[36]。本研究中，隨著飼料中硒化多糖添加量的增加，當(dāng)飼料硒含量低于0.91 mg/kg時(shí)，黑鯛幼魚血清SOD、CAT和GPx的活性與飼料硒含量呈現(xiàn)正相關(guān)（P<0.05），血清中MDA含量與飼料硒含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（P<0.05），而當(dāng)飼料硒含量高于091 mg/kg時(shí)，黑鯛幼魚血清SOD、CAT、GPx的活性及MDA含量不再顯著變化（P>0.05），表明飼料中添加硒化多糖可以顯著提高副溶血弧菌感染黑鯛的血清抗氧化性能，且血清抗氧化能力與硒的添加量呈現(xiàn)正相關(guān)。以抗氧化性能為評(píng)價(jià)指標(biāo)，黑鯛對(duì)飼料中硒的最適需求量為0.91 mg/kg。

3.3 飼料中添加硒化多糖對(duì)攻毒試驗(yàn)后黑鯛累積死亡率的影響

攻毒試驗(yàn)是免疫增強(qiáng)劑效果最直觀的反映方式。硒可以影響水生動(dòng)物的疾病抵抗力，硒缺乏會(huì)降低動(dòng)物的免疫功能，攝食缺硒飼料可使其疾病抵抗力降低，適當(dāng)補(bǔ)充外源硒可以增強(qiáng)它們的免疫功能，從而增強(qiáng)其疾病抵抗力[37]。Wang等研究表明，斑點(diǎn)叉尾的抗病力與飼料硒水平密切相關(guān)，0.20 mg/kg 的硒代蛋氨酸和0.40 mg/kg的酵母硒可顯著提高斑點(diǎn)叉尾經(jīng)愛德華氏菌攻毒后的存活率[38]。華雪銘等報(bào)道，添加劑酵母硒的含量與嗜水氣單胞菌對(duì)異育銀鯽的LC50密切相關(guān)，隨著添加劑酵母硒含量的升高，LC50升高，即異育銀鯽對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗力增強(qiáng)[39]。本研究中，在給黑鯛注射副溶血弧菌，經(jīng)過10 d的攻毒試驗(yàn)后，飼料中添加硒化多糖可以顯著降低黑鯛的累積死亡率，當(dāng)飼料硒含量低于0.91 mg/kg時(shí)，黑鯛的累積死亡率隨著飼料硒含量的增加顯著降低（P<0.05），當(dāng)飼料硒含量高于0.91 mg/kg時(shí)，黑鯛的累積死亡率不再顯著降低（P>0.05）。研究表明，硒化多糖可以提高黑鯛對(duì)副溶血弧菌感染的抵抗能力，提高養(yǎng)殖存活率，這可能是硒化多糖通過提高副溶血弧菌感染黑鯛的血清免疫力和抗氧化性能實(shí)現(xiàn)的。以副溶血弧菌感染后黑鯛的存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，黑鯛對(duì)飼料中硒的最適需求量為0.91 mg/kg。

綜上所述，飼料中添加硒化多糖可以提高副溶血弧菌感染黑鯛的免疫力和抗氧化性能，提升黑鯛對(duì)副溶血弧菌感染的抵抗能力，降低黑鯛感染副溶血弧菌后的死亡率，提升黑鯛養(yǎng)殖存活率。以副溶血弧菌感染后黑鯛的免疫力、抗氧化性能和存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，黑鯛對(duì)飼料中硒的最適需求量均為091 mg/kg。

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