劉俊宏 邱智東
關(guān)鍵詞:無患子;總皂苷;提取工藝;富集工藝;正交試驗(yàn);酪氨酸酶;黑色素
無患子產(chǎn)于長(zhǎng)江流域以南[1],《本草綱目》《雞肋篇》均有記載,稱為肥珠子、油珠子[2]。無患子果皮皂苷成分主要為三萜及倍半萜類,具有較強(qiáng)的表面活性作用[3-4],含量達(dá)5.33%[5]?!侗静菥V目》中載:洗頭去風(fēng)明目,洗面增白祛斑。在現(xiàn)代中藥及天然藥物化學(xué)研究中認(rèn)為,無患子中活性物質(zhì)可以通過對(duì)酪氨酸酶、氧化酶、多巴色素互變酶的作用,抑制黑色素的產(chǎn)生,從而達(dá)到美白效果。在這其中,酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶,對(duì)酪氨酸酶活性的控制,是美白護(hù)理的關(guān)鍵。近年來雖有報(bào)道無患子提取物對(duì)酪氨酸酶有抑制作用[6-7],但對(duì)無患子總皂苷提取工藝優(yōu)化及對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用鮮有新的報(bào)道,本研究擬通過優(yōu)化無患子總皂苷提取工藝、考察無患子皂苷對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用,來評(píng)價(jià)無患子總皂苷美白護(hù)膚的作用效果,為無患子在美白護(hù)膚化妝品的工業(yè)化生產(chǎn)提供可行性方案。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)儀器與材料
試驗(yàn)儀器:藥物天平(JYT-2,上海醫(yī)用激光儀器廠);電子天平[AL-204,梅特勒-托利多(上海)有限公司];超聲提取器(SY-360,上海寧商超聲儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(WMZK-72,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9035A,上海源長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠);恒溫水浴鍋(HH-S6,天津先權(quán)有限公司);酶標(biāo)儀(SpectraMax PLus-384,美谷分子儀(上海)有限公司)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(R-3001,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。
試驗(yàn)材料:無患子(2018年12月購于海寧市鹽官苗木合作社,產(chǎn)于浙江)由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)董金香教授鑒定;酪氨酸酶(25 000 mg,Sigma公司);DOPA(Sigma公司);磷酸緩沖鹽(北京化工有限公司);熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):110742-201620,中國(guó)藥品生物制品檢定所)。大孔吸附樹脂D101(上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司)。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 無患子總皂苷提取工藝優(yōu)化
1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg,甲醇定容至50 mL,配制成為 0.25 mg/mL 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,待用。分別精確量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL配制好的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于比色皿中,70 ℃下水浴蒸干溶液,將蒸干后各比色皿中分別加入3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液、4.5 mL 60% H2SO4溶液,充分振蕩,搖勻。將得到溶液于60 ℃恒溫水浴中加熱15 min,冷卻后靜置15 min,待測(cè)。以空白溶液為參比,于520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組樣品的吸光度[8-9]。以測(cè)得結(jié)果的吸光度為縱坐標(biāo)和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.1.2 單因素考察
1.2.1.2.1 乙醇濃度考察 稱取無患子果皮30 g,料液比為1 g ∶ 10 mL提取時(shí)間,為30 min條件下,將乙醇濃度設(shè)定為10%、30%、50%、70%、90%,分別進(jìn)行提取1次,旋蒸回收溶劑濃縮并制成干膏,將所得干膏進(jìn)行總皂苷含量比較。
1.2.1.2.2 提取時(shí)間考察 稱取無患子果皮30 g,以10%乙醇為提取溶劑,在35 ℃料液比為 1 g ∶ 10 mL 條件下,將提取時(shí)間設(shè)定為30、60、90、120、150 min,分別提取1次,旋蒸回收溶劑濃縮并制成干膏,將所得干膏進(jìn)行總皂苷含量比較。
1.2.1.2.3 料液比考察 稱取無患子果皮30 g,以10%乙醇為提取溶劑,在35 ℃提取30 min條件下,將料液比(g ∶ mL)設(shè)定為1 ∶ 10、1 ∶ 30、1 ∶ 50、1 ∶ 70、1 ∶ 90,分別提取1次,旋蒸回收溶劑濃縮并制成干膏,將所得干膏進(jìn)行總皂苷含量比較[10-12]。
1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)選擇超聲提取法進(jìn)行無患子總皂苷的提取。按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn),選擇提取溶劑濃度、提取時(shí)間、料液比為考察因素(表1),選擇無患子總皂苷含量為考察指標(biāo)設(shè)計(jì)試驗(yàn)。
1.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn) 按照“1.2.2”節(jié)下所得最優(yōu)提取方案連續(xù)提取3次,通過3次總皂苷得率結(jié)果,考察最優(yōu)方案的穩(wěn)定性。
1.2.4 酪氨酸酶抑制率測(cè)定方法
1.2.4.1 樣品制備 稱量1 000 g無患子果皮粉末,使用所得的最佳工藝提取無患子總皂苷,濃縮提取液,蒸干提取液成干膏,備用。
1.2.4.2 大孔樹脂吸附富集 取3份最優(yōu)方案提取總提取物,每份取10 g,分別定容至50 mL容量瓶中。準(zhǔn)確量取已經(jīng)預(yù)處理的D101大孔樹脂200 mL 3份,濕法裝柱分別標(biāo)號(hào):Y-1(水-D101)、Y-2、Y-3,分別上樣10 g提取物,依次以蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇各3倍體積量依次洗脫。收集洗脫液,揮干溶劑,制成干膏,分別稱質(zhì)量,待用[13]。
1.2.4.3 有機(jī)試劑萃取 取“1.2.4.1”節(jié)下制得總提取物10 g,溶于100 mL蒸餾水中,轉(zhuǎn)入分液漏斗,依次分別加入100 mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(水飽和)萃取,分別收取萃取液及萃取后所得水層,于50 ℃下分別減壓濃縮干燥,制成干膏,稱質(zhì)量后待用。
1.2.4.4 試驗(yàn)溶液配制
1.2.4.4.1 供試品溶液配制 取“1.2.4.2”“1.2.4.3”節(jié)下制得的干膏各5 mg,用磷酸緩沖液分別定容至5、10、25 mL容量瓶中配成1、0.5、0.25 mg/mL 質(zhì)量濃度的溶液待用作為供試品溶液。
1.2.4.4.2 陽性對(duì)照溶液配制 取熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,依照“1.2.4.4.1”節(jié)方法配制成為1、0.5、025 mg/mL的溶液作為陽性對(duì)照待用。
1.2.4.5 檢測(cè)方法 精確吸取不同質(zhì)量濃度試驗(yàn)溶液、分別依次按照表2將試驗(yàn)溶液加入于96孔板中A、B、C、D中,置于酶標(biāo)儀中,并于450 nm處測(cè)吸光度,得出不同樣品溶液的抑制率作比較。依據(jù)公式計(jì)算酪氨酸酶的抑制百分率[14]:抑制率=(A-B)-(C-D)A-B×100%。
2 結(jié)果與分析
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果見圖1,按“1.2.1.1”節(jié)下方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果顯示:y=0.613x-0.059 5,r2=0.999 1,齊墩果酸在0.125~0.875 mg/mL范圍內(nèi),質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。
2.2 提取工藝條件考察
2.2.1 單因素考察試驗(yàn)結(jié)果 以無患子總皂苷含量為參考指標(biāo),分別對(duì)影響總皂苷提取率的乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)等試驗(yàn)因素作為研究對(duì)象,按照“1.2.1.2”節(jié)下試驗(yàn)考察上述因素。
2.2.1.1 乙醇濃度對(duì)無患子總皂苷提取得率的影響 保持其他因素不變,考察無患子果皮提取時(shí)提取溶液乙醇濃度對(duì)總皂苷得率影響,結(jié)果如圖2所示。隨著提取溶劑中乙醇濃度不斷增加,總皂苷得率與乙醇濃度呈正相關(guān),當(dāng)提取液乙醇濃度高于50%時(shí),總皂苷得率呈下降趨勢(shì),而當(dāng)乙醇濃度在40%~60%時(shí),總皂苷得率較高且得率較接近,因此,綜合考慮試驗(yàn)成本,應(yīng)當(dāng)考察乙醇濃度為40%、50%、60%時(shí)乙醇濃度對(duì)無患子總皂苷提取得率的影響。
2.2.1.2 提取時(shí)間對(duì)無患子總皂苷提取得率的影響 保持其他因素不變,考察無患子果皮提取時(shí)提取時(shí)間對(duì)總皂苷得率影響,結(jié)果如圖3所示。隨著提取時(shí)間的不斷增加,在0~1.5 h時(shí)間范圍內(nèi)總皂苷提取率與提取時(shí)間呈正相關(guān),當(dāng)提取時(shí)間超過15 h時(shí),總皂苷提取率沒有明顯降低,因此,綜合考慮試驗(yàn)成本,應(yīng)當(dāng)考察提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5 h時(shí),提取時(shí)間對(duì)無患子總皂苷提取得率的影響。
2.2.1.3 料液比對(duì)無患子總皂苷提取得率的影響 保持其他因素不變,考察無患子果皮提取時(shí)料液比對(duì)總皂苷得率影響,結(jié)果如圖4所示。當(dāng)料液比為 1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 50 mL時(shí)總皂苷得率隨提取液增加而提高,呈現(xiàn)這種規(guī)律的原因是隨著提取溶劑比例增加,無患子果皮中活性物質(zhì)逐漸從細(xì)胞內(nèi)部溶出并擴(kuò)散到溶液中。當(dāng)料液比為 1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 70 mL、1 g ∶ 90 mL時(shí)總皂苷得率呈下降趨勢(shì)。綜上,考慮到試驗(yàn)成本及總皂苷提取效果,選擇料液比1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 70 mL 時(shí),提取料液比對(duì)無患子總皂苷提取得率的影響。
2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果(表3、表4)表明,在正交試驗(yàn)結(jié)果表(表3)中 RA>RC>RB,因此,無患子總皂苷提取率影響因素從大到小依次為:溶劑濃度>料液比>提取時(shí)間,根據(jù)直觀分析對(duì)于A因素提取溶劑濃度 k3>k2>k1;對(duì)于B因素提取時(shí)間k3>k1>k2;對(duì)于C因素料液比k3>k2>k1;可得出最佳提取工藝為A3B3C1,即:以60%乙醇為提取溶劑,提取時(shí)間 1.5 h,料液比1 g ∶ 30 mL進(jìn)行提取。
2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)
對(duì)篩選后的提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn), 提取率分別為8.76%、8.71%、8.89%,RSD值為106%,表明本試驗(yàn)確定的提取工藝穩(wěn)定、可行。
2.5 對(duì)酪氨酸酶的抑制活性
由表5可以看出,2種不同富集方式總皂苷得率不同,各組分得膏率順序如下:水飽和正丁醇得膏率>Y-3(70%乙醇)>H2O>Y-1(水-D101)>Y-2(30%乙醇)>乙酸乙酯>石油醚,在考察各個(gè)樣品體外對(duì)酪氨酸酶抑制活性時(shí),不同富集方式得到的樣品抑制率有顯著不同,如表6所示,在初始質(zhì)量濃度(0.25 mg/mL)下,各樣品抑制率較接近,無明顯區(qū)別,在中間質(zhì)量濃度(0.5 mg/mL)下,較其他樣品,熊果苷對(duì)酪氨酸酶抑制作用最強(qiáng),其抑制率為46.77%,石油醚次之,其抑制率為4482%,Y-3(70%乙醇)稍差,其抑制率為4462%,在高質(zhì)量濃度(1 mg/mL) 時(shí),各樣品對(duì)酪氨酸酶抑制活性基本與中間濃度時(shí)表現(xiàn)一致,其中熊果苷對(duì)酪氨酸酶抑制作用最強(qiáng),其抑制率為84.69%,石油醚次之,其抑制率為81.25%,Y-3(70%乙醇)稍差,其抑制率為8022%。但石油醚得率較低,考慮成本問題,D101大孔樹脂富集法70%乙醇洗脫更經(jīng)濟(jì)實(shí)用,綜上,無患子果皮提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性,因此,可作為美白產(chǎn)品添加劑,綜合考察得膏率及抑制率,通過大孔樹脂D101,70%乙醇洗脫后得到總皂苷對(duì)酪氨酸酶活性抑制效果最好,因此,可選此工藝為無患子總皂苷富集工藝。
3 討論與結(jié)論
酪氨酸酶在人體皮膚黑色素生成系列反應(yīng)中具有重要的生理功能,抑制酪氨酸酶活性可以阻斷人體皮膚黑色素形成,從而起到美白皮膚的效果,本試驗(yàn)以天然藥物無患子為研究對(duì)象,優(yōu)化無患子總皂苷提取、富集工藝并合理評(píng)價(jià)無患子總皂苷的體外酪氨酸酶抑制效果。
在無患子提取工藝研究中,分別對(duì)影響無患子總皂苷提取得率的因素:乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行單因素考察試驗(yàn),并以無患子總皂苷得率為參考指標(biāo),通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化得到無患子總皂苷提取工藝為:提取溶劑為60%乙醇,提取時(shí)間為 1.5 h,料液比為1 g ∶ 30 mL,經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證此方法穩(wěn)定可靠。
本試驗(yàn)不僅對(duì)無患子總皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,還進(jìn)一步考察了無患子提取物體外酪氨酸酶抑制活性。為提高無患子提取物的應(yīng)用效率,又分別對(duì)無患子提取物進(jìn)行2種純化方式下的得膏率和酪氨酸酶活性抑制作用的考察。水飽和正丁醇組得膏率相對(duì)較高,為43.12%,但其對(duì)酪氨酸酶抑制活性相對(duì)較差,因此不選作較優(yōu)的富集方案;石油醚層組分雖相同質(zhì)量濃度下對(duì)酪氨酸酶抑制活性與熊果苷接近,但由于其得膏率較低,不作選擇,考慮到成本問題遂選擇無患子提取物通過大孔樹脂D101、70%乙醇洗脫方法對(duì)無患子提取物進(jìn)行富集純化。純化后無患子總皂苷提取物利用效率更高,對(duì)酪氨酸酶抑制活性更強(qiáng),能更好地發(fā)揮無患子的美白功效。
參考文獻(xiàn):
[1]劉玉壺,羅獻(xiàn)瑞. 中國(guó)植物志(第四十七卷第一分冊(cè))[M]. 北京:科學(xué)出版社,1998.
[2]張敏杰,劉佩茹,趙俊滋,等. 無患子的開發(fā)利用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1993,12(4):76-79.
[3]李 銳,周 燕,楊永成,等. 無患子皂苷成分的串聯(lián)質(zhì)譜分析[J]. 高等學(xué)?;瘜W(xué)學(xué)報(bào),2006,27(1):52-54.
[4]解 輝. 無患子總皂苷分離純化的研究[M]. 合肥:合肥工業(yè)大學(xué),2008.
[5]楊志斌,楊 柳,李 暉. 無患子有效化學(xué)成分的分析研究[J]. 湖北林業(yè)科技,2010,22(5):32-34.
[6]趙志敏,南艷平,唐青濤,等. 無患子總皂苷抗炎及抑制酪氨酸酶活性研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2014,25(7):1592-1595.
[7]陳清西,宋康康. 酪氨酸酶的研究進(jìn)展[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,45(5):731-737.
[8]陳莎莎,陳麗萍,林繼輝. 無患子果皮皂苷提取工藝研究[J]. 云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2019,28(6):558-562.
[9]馮月燕,李智斌. 天然無患子總皂苷提取工藝研究[J]. 廣東化工,2019,46(9):128-129.
[10]張永忠,徐建軍,葉玉杰. 無患子果皮皂苷提取及天然洗手液制備研究[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2017,13(14):34-36.
[11]馬麗珍. 無患子皂苷提取工藝的優(yōu)化[J]. 日用化學(xué)工業(yè),2015,45(3):149-151.
[12]李智斌,張彥燾. 無患子總皂苷表面活性及其含量測(cè)定方法的研究[J]. 廣東化工,2019,46(9):124-125.
[13]陳 雷,趙春琳,周生學(xué). 無患子總皂苷體外抑制酪氨酸酶活性的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(21):56-58.
[14]趙志敏,南艷平,唐青濤,等. 無患子總皂苷抗炎及抑制酪氨酸酶活性研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2014,25(7):1592-1595.趙玥琪,郝婧瑋,王 穎. HPLC法評(píng)價(jià)儲(chǔ)存溫度對(duì)茶葉中3種兒茶素含量的影響[J].