葉曉婉 張桂麗 戚賀飛

關鍵詞：明黨參;內生菌;苯磺隆;降解率;生物學鑒定

明黨參（Changium smyrnioides Wolff）為我國特有的傘形科明黨參屬植物，別稱山花、山蘿卜、明參、明黨[1]。明黨參是草本植物，周圍易雜草叢生，雜草與明黨參植株競爭土壤中的營養(yǎng)成分，從而影響植株的生長發(fā)育，而磺酰脲類除草劑，如苯磺隆，能夠有效去除其周圍雜草，使明黨參旺盛生長。

苯磺隆（tribenuron-methyl，TBM），別稱麥樂樂、苯磺隆、巨星（杜邦）、億力、闊葉凈、麥磺隆等，是20世紀80年代由美國杜邦公司開發(fā)的一種內吸傳導型磺酰脲類麥田除草劑[2-5]，主要用于防除各種一年生闊葉雜草。苯磺隆在我國長江、黃河和淮河流域有著廣泛的使用范圍。苯磺隆的大量使用，給土壤、水體、生物及大氣等諸多環(huán)境因子造成大量污染，影響農業(yè)生產和生態(tài)平衡[6-8]。因此，解決苯磺隆的殘留問題對改善除草劑對作物的藥害，修復受除草劑污染的土地有重要的理論意義和實際價值。而在生態(tài)系統(tǒng)中，作為分解者的微生物，代謝類型多樣，適應環(huán)境的能力極強，能利用各種人工合成的農藥作為碳、氮源生長，并將其完全降解成無機物[9]。田爽等篩選出4株能以苯磺隆為唯一碳源生長的降解菌，并對其生理生化特性進行研究[9]。Zhang等篩選出一株苯磺隆降解菌，經初步鑒定為假單胞桿菌，根據所查資料，國外尚未見有關于降解苯磺隆菌株的研究報道[10]。本試驗從明黨參內生菌著手，進行一系列的研究，旨在從中篩選出能夠高效降解苯磺隆的明黨參內生菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基（inorganic salt medium，IS）：磷酸二氫鉀（3.0 g/L）、七水硫酸鎂（0.1 g/L）、硝酸銨（2.0 g/L）、磷酸氫二鉀（1.5 g/L）、無水氯化鈣（0.01 g/L）、乙二胺四乙酸二鈉（0.01 g/L），pH值7.5±0.1，25 ℃。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）：牛肉浸粉（3.0 g/L）、蛋白胨（10.0 g/L）、氯化鈉（5.0 g/L）、瓊脂粉（15.0 g/L），pH值7.3±0.1，25 ℃。

1.1.2 試驗樣品與試劑 試驗樣品明黨參產自河南省鄭州市某中草藥試驗田。試驗試劑：苯磺?。兌?5%）由中國沈陽化工研究所提供;甲醇（色譜純）由天津市科密歐化學試劑有限公司生產;乙腈（色譜純）由天津市科密歐化學試劑有限公司生產。

1.1.3 試驗儀器和設備 一次性無菌進樣器（1 mL）：江蘇華達醫(yī)療器材有限公司生產;紫外可見分光光度計（UV2600）：日本島津儀器有限公司生產;高效液相色譜儀（Agilent 1200）：安捷倫科技有限公司生產;臺式高速冷凍離心機（Allegra 64R）：美國貝克曼庫爾特有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 明黨參內生菌的分離 取明黨參的根、莖、葉等組織部位，將組織表面的泥土等雜質用自來水沖洗之后在干凈的自來水中浸泡1 h;然后移入無菌超凈工作臺，用無菌水再次沖洗3次之后用無菌濾紙吸干表面的水分。采用“75%乙醇-2.5%次氯酸鈉-75%乙醇”三步表面消毒法將各組織消毒，其中根組織用75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸鈉浸泡7 min，75%乙醇浸泡20 min;莖組織用75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸鈉浸泡5 min，75%乙醇浸泡18 min;葉組織用75%乙醇浸泡 2 min，2.5%次氯酸鈉浸泡3 min，75%乙醇浸泡 15 min。表面消毒過的明黨參組織，分別用無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干表面的水分。之后用滅菌的鑷子、剪刀、無菌刀片將明黨參的根與葉組織剪切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，莖組織剪切成長度約為0.5 cm的組織。在NA、PDA、高氏一號培養(yǎng)基的平板上，分別等距接種4個根、莖、葉組織塊，每個處理重復3次。將平板依次放置到37、28、30 ℃培養(yǎng)箱中，觀察平板中組織邊緣菌落生長狀況。

對照組：采用組織印跡法，將以上經過消毒處理的根、莖、葉組織放入NA、PDA、高氏一號培養(yǎng)基中，使滅菌材料表面與培養(yǎng)基接觸20 min后移走明黨參各組織塊，并將培養(yǎng)基置于相同條件下培養(yǎng)相同時間，觀察平板是否有肉眼可見的菌落長出。

1.2.2 明黨參內生細菌的純化與保藏 待平板中組織塊邊緣長出可以用肉眼觀察到的菌落后，用接種環(huán)挑取少許邊緣菌落接種到新的NA培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，待菌落生長后重復此操作6次以上進行純化，直到得到單一的純菌落。定期觀察，挑選優(yōu)勢單菌落劃線純化后甘油保藏備用。

1.2.3 苯磺隆降解菌的篩選 （1）初篩。將以上分離得到的明黨參內生菌接種在NA培養(yǎng)基上進行活化，再轉接到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)12 h。配制無機鹽固體培養(yǎng)基，121 ℃、0.1 MPa 下滅菌15 min。在超凈工作臺中，向無機鹽培養(yǎng)基中加入等量的濃度為10%的苯磺隆溶液，倒平板，冷卻。分別取1 mL菌液接種于無機鹽培養(yǎng)基，無菌環(huán)境下涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。將得到的菌株接入NB培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 d，向100 mL無機鹽液體培養(yǎng)基中加入濃度為10%的苯磺隆溶液1 mL，取1 mL NB培養(yǎng)基中的菌液接種于無機鹽液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，定時取樣，于D600 nm測定菌株的生長情況，重復多次。（2）復篩。配制150 mL的無機鹽液體培養(yǎng)基，121 ℃、0.1 MPa下滅菌15 min。在超凈工作臺中，向培養(yǎng)基加入苯磺隆標準品0.45 g，搖勻混合。將初篩得到的菌液接種于此，37 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)，定時觀察無機鹽培養(yǎng)基的清晰程度，并定時取樣，于D600 nm測定菌株的生長情況，重復多次。

2.4.2 降解菌的16S rDNA基因序列同源性分析 經過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、純化回收DNA目的條帶、PCR引物測序，菌株PMG3的16S rDNA基因序列全長為1 418 bp。選取與內生菌菌株同源性較高的10株菌株的16S rDNA基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果見圖4。通過BLAST同源性比對，結果表明，菌株PMG3與Bacterium wsb-1和Bacillus tequilensis stain Y11進化距離較近;結合菌株形態(tài)特征、生化特性、微生物質譜鑒定結果和16S rDNA基因序列同源性分析，初步鑒定菌株PMG3為芽孢桿菌屬（Bacillus sp. PMG3）。

2.4.3 降解菌的質譜分析 本試驗所用的質譜儀基本原理是基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術[11]，根據離子的質荷比與離子的飛行時間成正比，檢測樣品到達檢測器的飛行時間即可檢測離子，對樣品進行分析，通過與數(shù)據庫信息比對，篩選并確定相應圖譜，進而得到鑒定結果，從而實現(xiàn)對不同細菌屬、種的鑒定。菌株PMG3的質譜圖譜如圖5所示，菌株PMG3在4 307.89 m/z附近離子流強度最大， 其峰高為1 600， 峰面積為2 789 635，信噪比為28，分辨率為753。菌株PMG3經檢索后與數(shù)據庫中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的匹配分值為9.115，菌株PMG3鑒定為芽孢桿菌屬。

3 討論與結論

苯磺隆是一種乙酰羥基酸合成酶（AHAs）抑制除草劑[12]。AHAs又稱乙酰乳酸合酶，催化支鏈氨基酸合成途徑的第一步，包括纈草堿、亮氨酸和異亮氨酸[13-14]。苯磺隆通過將AHAs活性位點轉變?yōu)殡y以與底物結合的構象來抑制雜草。目前，國內外關于苯磺隆的研究主要集中在藥理、殘留分析方法及其對植物生理特性的影響等方面[6-7，15-23]。雖然在苯磺隆的篩選、鑒定等方面已有一些文獻報道，如田爽等篩選出4株能降解苯磺隆的菌株[9]。Zhang等篩選出2株苯磺隆降解菌，但很少涉及苯磺隆降解試驗及降解率指標，所報道降解菌的降解效率不明晰，且菌源多為土壤[10]。杜迅等的試驗菌源來自河南省臨潁縣麥田[24]，田爽等的試驗菌源來自受農藥苯磺隆污染的土壤[9]。

本研究首次以中草藥明黨參為菌源材料，分離得到了1株能夠高效降解苯磺?。ń到饴式咏?89.07%）的內生菌，并對能高效降解苯磺隆的明黨參內生細菌進行生物學鑒定，根據16S rDNA基因序列同源性分析以及質譜結果確定屬于芽孢桿菌屬，這與已有文獻多數(shù)報道的降解菌不同，豐富了苯磺隆降解菌資源庫，對于修復受苯磺隆污染的農田有著重要意義，也為中草藥內生菌資源利用及農藥生物降解菌的篩選開辟了新途徑。

苯磺隆作為磺酰脲類除草劑的一員，沸點較低，并且國內外對其報道都相對較少，再加上試驗條件和試驗時間所迫，本研究還存在一定的不足。今后可以在苯磺隆的降解條件、降解機理等方面進行探討和研究，為中草藥內生菌降解苯磺隆提供理論依據。

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