郭建華 張春強(qiáng) 郭宏文

關(guān)鍵詞：產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌;FPA酶;CMC酶;發(fā)酵條件優(yōu)化

能源、環(huán)境及工農(nóng)業(yè)原料生產(chǎn)等問題越來越影響著人們的日常生活，高產(chǎn)纖維素酶微生物的篩選對解決這些問題都十分重要[1-3]。大多數(shù)細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶與真菌來源的酶性質(zhì)不同，某些方面具有真菌酶不可替代的作用[4]。細(xì)菌纖維素酶在飼料工業(yè)、洗滌劑工業(yè)及紡織工業(yè)中具有廣泛的利用前景，因此在工業(yè)生產(chǎn)中的地位逐漸提高[5]，其中產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌成為近年來的研究熱點(diǎn)[6]。本試驗(yàn)以從白酒酒醅中選育得到的產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌菌株DM-4為試驗(yàn)菌株，利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)酶條件，為進(jìn)一步的試驗(yàn)研究準(zhǔn)備條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

菌株DM-4，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從白酒酒醅中選育得到，經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH值7.5～7.6，121 ℃下滅菌30 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g，蛋白胨2.5 g，酵母浸出汁 1.0 g，NaCl 2.5 g，KH2PO3 0.5 g，硫酸鎂0.1 g，瓊脂10 g，去離子水500 mL，121 ℃下滅菌30 min。

1.3 纖維素酶活力測定方法

待測發(fā)酵液倒入離心管中，5 000 r/min離心 10 min，取上清液測定酶活。濾紙酶（FPA酶）活力測定：根據(jù)國際理論應(yīng)用化學(xué)協(xié)會（IUPAC）的方法測定[7]。CMC酶活力測定見參考文獻(xiàn)[8]。

1.4 菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.4.1 發(fā)酵時(shí)間的確定 發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)接入種子后，從12 h開始，每12 h取樣測定酶活，直到72 h。

1.4.2 接種量的確定 按照1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、搖瓶轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下發(fā)酵36 h后測酶活力。

1.4.3 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

1.4.3.1 碳源的優(yōu)化 （1）碳源種類的優(yōu)化：以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、麩皮（過80目篩）、玉米粉、葡萄糖、蔗糖、淀粉和微晶纖維素作為唯一碳源（2%）配制培養(yǎng)基，接入種子后發(fā)酵36 h后測酶活力。（2）碳源濃度的優(yōu)化：在優(yōu)化碳源種類后，配制碳源濃度為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、35%和4%的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入突變菌株發(fā)酵36 h后測酶活力。

1.4.3.2 氮源的優(yōu)化 （1）氮源種類的優(yōu)化：優(yōu)化碳源后，以蛋白胨、豆餅粉（過80目篩）、大豆蛋白粉、硫酸銨、硝酸鉀和尿素作為唯一氮源（0.5%）配制發(fā)酵培養(yǎng)基，接入種子后發(fā)酵36 h后測酶活力。（2）氮源濃度的優(yōu)化：在優(yōu)化氮源種類后，配制優(yōu)化氮源濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和11%發(fā)酵培養(yǎng)基，接入種子后發(fā)酵36 h后測酶活力。

1.4.3.3 初始pH值的優(yōu)化 分別配制pH值4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0碳氮源優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基，接入突變菌株發(fā)酵36 h后測酶活力。

1.4.3.4 磷酸鹽濃度優(yōu)化 配制K2HPO3濃度為01%、0.5%、0.9%、1.3%和1.7%的上述條件優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入突變菌株發(fā)酵36 h后測酶活力。

1.4.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在上述優(yōu)化基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behuken設(shè)計(jì)方法，采用minitab 16構(gòu)建3因素（碳源濃度、氮源濃度和磷酸鹽濃度）3水平響應(yīng)面分析[9-10]。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPASS軟件實(shí)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析及差異顯著性檢驗(yàn)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

接入種子液后，從發(fā)酵12 h開始每隔12 h測定FPA酶活和CMC酶活，直到發(fā)酵后72 h，結(jié)果如圖1所示。發(fā)酵時(shí)間為36 h時(shí)，菌株產(chǎn)FPA酶和CMC酶都表現(xiàn)出了比較高的酶活力，繼續(xù)發(fā)酵到48 h會有少許增加，之后逐漸下降。經(jīng)差異顯著性檢驗(yàn)，發(fā)酵36 h酶活與發(fā)酵48 h酶活差異不顯著（P>0.05），而與其他發(fā)酵時(shí)間的酶活差異極顯著（P<0.01），確定36 h為最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

2.2 接種量的確定

不同接種量下菌株發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果見圖2。隨接種量提高，菌株產(chǎn)酶活力不斷提高。接種量大于4%時(shí)，酶活提高量變小。經(jīng)差異顯著性檢驗(yàn)，4%、5%和6%這3種接種量條件下的酶活差異不顯著（P>0.05），綜合考查，選擇4%的接種量為優(yōu)化條件。

2.3 初始pH值的優(yōu)化

菌株DM-4在不同初始pH值條件下發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力結(jié)果見圖3。試驗(yàn)結(jié)果顯示，初始pH值為5.5～6.0時(shí)，菌株DM-4產(chǎn)酶活性最高。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，初始pH值5.5條件下菌株所產(chǎn)酶活與初始pH值6.0條件下差異不顯著（P>005），而與其他初始pH值條件下差異極顯著（P<0.01），因此，確定最優(yōu)產(chǎn)酶初始pH值為5.5～6.0。

2.4 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

2.4.1 碳源的優(yōu)化 分別利用不同碳源作為唯一碳源配制培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果見圖4?？傮w分析，含有纖維素物質(zhì)的碳源比不含纖維素物質(zhì)的碳源所產(chǎn)酶活高。其中以麩皮為唯一碳源時(shí)產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，與其他碳源比較差異極顯著（P<0.01），確定麩皮為最優(yōu)碳源。由圖5可知，當(dāng)麩皮濃度在 2.5% 以下時(shí)，隨著麩皮濃度升高，酶活升高，超過2.5%時(shí)，酶活反而下降。在碳源濃度為2.5%時(shí)菌株所產(chǎn)酶活與其他濃度下所產(chǎn)酶活比較具有顯著性差異。碳源濃度過低會造成營養(yǎng)不足，能源物質(zhì)少，細(xì)胞不能生成足夠的ATP滿足菌體的生長代謝，菌體生長不良，產(chǎn)酶活性低;而碳源濃度過高時(shí)，能源物質(zhì)充足，細(xì)胞生長快，同時(shí)發(fā)酵液黏度升高，溶氧不足，使細(xì)胞產(chǎn)酶量下降，降低活性。在本試驗(yàn)條件下選擇麩皮濃度2.5%作為優(yōu)化碳源濃度。

2.4.2 氮源的優(yōu)化 分別以不同物質(zhì)作為唯一氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見圖6?？傮w而言，有機(jī)氮源產(chǎn)纖維酶酶活性要比無機(jī)氮源稍高。差異顯著性檢測表明，蛋白胨、豆餅粉和大豆蛋白粉作為氮源時(shí)，其酶活之間差異不顯著（P>005），而與硫酸銨、硝酸鉀和尿素作為氮源時(shí)的產(chǎn)酶活性差異極顯著（P<0.01）。由于試驗(yàn)菌株是在酒醅中篩選出來的，經(jīng)常年不斷優(yōu)化，適應(yīng)了有機(jī)氮源的營養(yǎng)，同時(shí)，有機(jī)氮源中所含的營養(yǎng)，除氮源外還有其他營養(yǎng)成分，會促進(jìn)菌體產(chǎn)酶。綜合考慮，本試驗(yàn)以蛋白胨作為最佳氮源。氮源濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果（圖7）顯示，隨氮源濃度增加，菌株產(chǎn)酶活力增加，當(dāng)?shù)礉舛葹?.9%時(shí)，菌株產(chǎn)酶活力最高，氮源濃度繼續(xù)提高至1.1%后，酶活力少許下降。氮源是細(xì)胞合成產(chǎn)物的重要物質(zhì)，數(shù)量過少，產(chǎn)物合成不足，數(shù)量過多，有可能造成底物抑制，細(xì)胞合成酶的數(shù)量降低，從而使菌體產(chǎn)酶活性降低。通過0.9%濃度時(shí)的酶活力與其他氮源濃度下的酶活力差異性比較可知，氮源濃度0.9%時(shí)，F(xiàn)PA酶活和CMC酶活與其他濃度下的酶活具有顯著性差異（P<0.05），因此，選擇氮源濃度為0.9%作為優(yōu)化濃度。

2.4.3 磷酸鹽濃度的優(yōu)化 配制磷酸鹽濃度分別為0.1%、0.5%、0.9%、1.3%和1.7%的培養(yǎng)基，接入菌株后進(jìn)行發(fā)酵，36 h后測定纖維素酶活力，結(jié)果見圖8。當(dāng)磷酸鹽（KH2PO3）濃度為 0.5% 時(shí)，菌株所產(chǎn)酶活最高。濃度進(jìn)一步增加后，酶活反而下降。磷酸鹽濃度很小時(shí)，磷元素不足造成細(xì)胞代謝緩慢，磷酸鹽濃度過高，會引起細(xì)胞生長過快，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)只合成細(xì)胞而不產(chǎn)酶。顯著性檢驗(yàn)表明，在磷酸鹽濃度為0.5%的條件下，與其他濃度條件下的酶活差異極顯著（P<0.01），因此，確定磷酸鹽0.5%的濃度作為優(yōu)化結(jié)果。

2.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 選擇碳源（麩皮）濃度、氮源（蛋白胨）濃度和磷酸鹽（KH2PO3）濃度作為培養(yǎng)基組分優(yōu)化因子（分別為X1、X2、X3）以FPA酶（Y1）和CMC酶（Y2）活力分別作為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。試驗(yàn)因子和水平見表1，試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

使用mintab 16進(jìn)行關(guān)于響應(yīng)值與因子麩皮濃度（X1）、蛋白胨濃度（X2）和磷酸鹽濃度（X3）的二次回歸分析，去掉不顯著因素，得到二次表達(dá)式：

Y1=29.81-X3-4.267 5X21-1.872 5X22-3.52X23-1.352 5X2X3;

Y2=134.14+2.355X1-1.383 8X3-6.913 7X21-3.091 2X22-5.166 3X23-1.837 5X2X3。

方程顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3至表6所示，2個(gè)回歸方程都具有顯著性（R21=0.936，R22=0.949，P<0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），剔除其他項(xiàng)后，保留的各項(xiàng)系數(shù)都具有顯著性（P<0.05）。根據(jù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可以得知，對于菌株產(chǎn)FPA酶活力來說，培養(yǎng)基中的麩皮濃度和蛋白胨濃度在二次水平上影響FPA酶的產(chǎn)生，磷酸鹽濃度在一次水平和二次水平上都對FPA酶的產(chǎn)生具有顯著性影響，麩皮濃度和蛋白濃度之間及麩皮與磷酸鹽濃度之間不具有交互作用，而蛋白胨和磷酸鹽之間對FPA酶的產(chǎn)生具有交互作用。對菌株所產(chǎn)CMC酶來說，麩皮濃度在一次水平上也會影響CMC酶活的生產(chǎn)，其他與FPA酶一致，由此說明，菌株所產(chǎn)的CMC酶活力是FPA酶活力的重要組成部分。

利用mintab 16軟件繪出等值線圖及響應(yīng)面圖（圖9、圖10）。等值線的形狀反映因素間交互作用的大小，圖形傾斜表示交互作用顯著。結(jié)合方差分析和響應(yīng)面圖可知，蛋白質(zhì)濃度與磷酸鹽濃度交互作用具有顯著水平，而麩皮與蛋白胨、麩皮與磷酸鹽之間的交互作用不顯著。

FPA酶優(yōu)化后水平為：X1=0，X2=0.055 1，X3=-0.152 6;CMC酶優(yōu)化后因子水平為：X1=0.170 3，X2=0.037 8，X3=0.141 4。考慮2種酶取因子水平平均值：X1=0.085 15，X2=0.046 45，X3=-0.005 6。對應(yīng)的麩皮濃度為2.54%，蛋白胨為0.92%，磷酸鹽為0.497%（取0.50%）。在此條件下利用回歸表達(dá)式預(yù)測2種酶活力大小，F(xiàn)PA酶為29.78 IU/mL，CMC酶為134.29 U/mL。

2.4 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，在麩皮濃度2.54%、蛋白胨濃度0.92%、磷酸鹽濃度0.50%、發(fā)酵初始pH值 5.5、接種量4%和發(fā)酵時(shí)間36 h的條件下對菌株進(jìn)行5次產(chǎn)酶試驗(yàn)，檢測產(chǎn)酶活力，并與模型預(yù)測值比較，結(jié)果如表7所示。

驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，在菌株所產(chǎn)纖維素酶活力與模型預(yù)測值接近，差率很小（<5%），由此可確定對菌株DM-4產(chǎn)酶條件的優(yōu)化模型是有效和可靠的。

3 結(jié)論

利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定產(chǎn)纖維酶菌株DM-4的產(chǎn)酶優(yōu)化條件為：發(fā)酵時(shí)間為36 h，接種量4%，培養(yǎng)基初始pH值5.5～6.0，培養(yǎng)基麩皮濃度2.54%，蛋白胨濃度0.92%，磷酸鹽濃度 0.5%。驗(yàn)證試驗(yàn)表明優(yōu)化模型是有效和可靠的。

參考文獻(xiàn)：

[1]Peter M，Zarnea G，Adrina P，et al. Biodegradation and bioconversion of cellulose wastes using bacterialb and fungalcells immobilized hydrogels[J]. Resources Conservation and Recycling，1999，27（5）：309-332.

[2]Rabinovich M L，Melnick M S，Bolobova A V. The structure and

mechanism of action of cellulolytic enzymes[J]. Biochemistry-Moscow，2002，67（8）：850-871.

[3]Chinnarjan R，Thangiah N，Govindaswamy R V. Optimization of alkaline cellulase production by the marine-derived fungus Chaetomium sp. using agricultural and industrial wastes as substrates[J]. Botanica Marina，2010，53（3）：275-282.

[4]Taechapoempol K，Sreethawong T，Rangsunvigit P，et al. Cellulase-Producing bacteria from Thai higher termites，Microcerotermes sp.：enzymatic activities and ionic liquid tolerance[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，164（2）：204-222.

[5]Deka D，Jawed M，Goyal A.Purification and characterization of an alkaline cellulase produced by Bacillus subtilis （AS3）[J]. Preparative Biochemistry & Biotechnology，2013，43（3）：256-270.

[6]Choudhuryl B，Chauhan S，Singh S N，et al. Production of xylanase of Bacillus coagulans and its bleaching potential[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2006，22（3）：283-288.

[7]Ghose T K. Measurement of cellulase activity[J]. Pure and Applied Chemistry，1987，59（2）：257-268.

[8]Nwagu K E，Ominyi M C，Nwoba G E. Isolation，screening and measurement of amylase and cellulase activities of some microorganisms[J]. Continental Journal of Biological Sciences，2012，6（1）：37.

[9]Wang G G. Adaptive response surface method using inherited Latin hypercube design points[J]. Journal of Mechanical Design，2003，125（2）：210-220.

[10]Steinberg D M，Bursztyn D. Response surface methodology in biotechnology[J]. Quality Control & Applied Statistics，2011，22（2）：109-110.

[11]Hoshino T，Hashimoto T，Shigemasu K. A bayesian significance test for the difference and linear combination of factor means between groups[J]. Japanese Journal of Educational Psychology，2001，49（1）：31-40.李林紅，李孟涵. 農(nóng)產(chǎn)品圖文呈現(xiàn)與在線評論不一致性對銷量的影響——以蘋果為例[J].