謝文平　鮑素敏　劉權(quán)　張鴻

摘要 [目的]建立納塔葡糖酸醋桿菌遺傳操作系統(tǒng)，為采用基因工程方法改造該類菌株，提高纖維素產(chǎn)量，提升纖維素品質(zhì)提供參考依據(jù)。[方法]通過優(yōu)化培養(yǎng)基確定菌株電轉(zhuǎn)化感受態(tài)制備條件，采用質(zhì)粒或者線性化片段在不同電壓下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)化條件。[結(jié)果]采用添加了1%纖維素酶的C2培養(yǎng)基進(jìn)行1次搖瓶轉(zhuǎn)接，可有效制備納塔葡糖酸醋桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài);采用攜帶同源臂及Kan抗性基因的環(huán)狀質(zhì)?；蛘呔€性化片段均實現(xiàn)了對納塔葡糖酸醋桿菌葡萄糖脫氫酶基因（GDH）的同源雙交換基因敲除;GDH基因的敲除降低了工程菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素膜過程的葡萄糖酸產(chǎn)生，提高了細(xì)菌纖維素的最終產(chǎn)量及品質(zhì)。[結(jié)論]成功建立了納塔葡糖酸醋桿菌遺傳轉(zhuǎn)化方法和基因敲除方法。

關(guān)鍵詞 細(xì)菌纖維素;納塔葡糖酸醋桿菌;電轉(zhuǎn)化;基因敲除

中圖分類號 S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）11-0001-06

Abstract [Objective]Establishing a genetic operating method for Gluconacetobacter nataicola can provide reference for modifing the strains by genetic engineering，improving the yield and the quality of bacterial cellulose.[Method]The conditions for the preparation of competent cells were determined by the growth ability of the strain in different media，and the optimal transformation conditions were determined by positive clone obtained by transforming the plasmid or the linearized fragment at different electrotransformation voltages.[Result]The C2 medium supplemented with 1% cellulase was used for one time bottom transferring，which can effectively prepare the electroporation of G.nataicola.The homologous doubleexchange knockout of the glucose dehydrogenase gene （GDH） was achieved by transferring the circle plasmid or the linearized fragment carrying homologous arm of GDH and Kan resistance gene.Knockout of GDH gene reduced the production of gluconic acid in the process of fermentation，and improved the final yield and quality of bacterial cellulose membrane.[Conclusion]The genetic transformation method and gene knockout method of G.nataicola were successfully established.

Key words Bacterial cellulose;Gluconacetobacter nataicola;Electroporation;Gene knockout

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是細(xì)菌利用葡萄糖合成的由β-1，4-糖苷鍵連接而成的纖維素。因其具有超高的純度、高結(jié)晶性、高楊氏模量、優(yōu)良的生物可降解性、高持水量和良好的生物相容性等特點，已作為新型生物可降解材料用于食品、化學(xué)工業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1-2]。目前，細(xì)菌纖維素已經(jīng)成功應(yīng)用于燒傷敷料、退熱貼、高端面膜等產(chǎn)品的基材而在各國實現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)[3-5]。

根據(jù)已有的報道，具有細(xì)菌纖維素合成功能的微生物包括葡糖酸醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、無色桿菌屬（Achromobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）等[3，6-7]。其中，葡糖醋酸菌屬的木醋桿菌（G.xylinum）、巴氏醋桿菌（G.pasteurianus）、漢式醋桿菌（G.hansenis）、納塔葡糖酸醋桿菌（G.nataicola）等種屬的微生物都具有相對較強的纖維素合成能力[6]。

目前，對產(chǎn)纖維素菌種的研究主要集中在發(fā)酵條件的優(yōu)化上，以提高纖維素合成能力[8-11]。采用基因工程方法進(jìn)行育種具有更好的目標(biāo)性和有效性，也是目前微生物育種常用的方法。但是由于細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株為非模式生物，有關(guān)其遺傳轉(zhuǎn)化的方法研究很少。2006年，Chien等[12]采用廣宿主質(zhì)粒在木醋桿菌中表達(dá)了血紅素蛋白，增強菌株的攝氧能力，提高菌株的細(xì)菌纖維素合成能力。2015年Kuo等[13]在木醋桿菌中采用同源重組的方法敲除了其中的GDH基因，提高了纖維素產(chǎn)量。2016年，F(xiàn)lorea等[14]在G.rhaeticus（又稱Komagataeibacter rhaeticus）中構(gòu)建了一套遺傳操作工具，用于在該菌株中進(jìn)行外源基因的表達(dá)。但目前對于葡糖酸醋桿菌屬的其他種屬，如納塔葡糖酸醋桿菌的遺傳操作鮮有報道。

該研究以納塔葡糖酸醋桿菌為對象，通過摸索優(yōu)化感受態(tài)制備條件和轉(zhuǎn)化條件，實現(xiàn)對該種菌的基因敲除操作，以期為優(yōu)化納塔葡糖酸醋桿菌在工業(yè)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒。

納塔葡糖酸醋桿菌HEC-004，是一株快速、高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的工業(yè)化生產(chǎn)菌株，已保藏于中國普通微生物管理中心，保藏號：CGMCC No.11588。大腸桿菌DH5a，載體構(gòu)建用菌株。pMD18-T載體購于寶生物工程（大連）有限公司，pET-28a質(zhì)粒為Novagen公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑和設(shè)備。

PCR用的高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase、普通DNA聚合酶EmeraldAmp PCR Master Mix （2× Premix）、連接酶Solution I、 QuickCut限制性內(nèi)切酶、DNA marker、質(zhì)粒提取及DNA凝膠回收試劑盒均購于寶生物工程（大連）有限公司。纖維素酶，硫酸卡那霉素（Kan）和氨芐青霉素（Amp）購于生工生物工程（上海）股份有限公司。其余化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析級試劑。

主要設(shè)備：PCR儀（Biometric），凝膠成像系統(tǒng)（BioRad），電穿孔儀器（Bio-Rad，型號165-2100）。

1.1.3 培養(yǎng)基。

大腸桿菌所用LB培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L。根據(jù)需要，在大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)建過程中加Kan 至終濃度50 mg/L或Amp至終濃度100 mg/L。納塔葡糖酸醋桿菌所用的培養(yǎng)基有3種（表1），其中固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。7#培養(yǎng)基用于菌種的基礎(chǔ)培養(yǎng)，C2培養(yǎng)基用于菌株發(fā)酵產(chǎn)纖維素膜。

1.2 方法

1.2.1 納塔葡糖酸醋桿菌對Kan和Amp抗生素的耐受性測試。

將納塔葡糖酸醋桿菌HEC-004菌株接到7#液體培養(yǎng)基中，28 ??℃ 振蕩培養(yǎng)2 d后，取菌液稀釋100倍，取50 μL分別涂布到Kan濃度為 0、5、25、50、150、100 mg/L的7#培養(yǎng)基固體平板上;按照上述相同方法，取50 μL分別涂布到Amp濃度為 0、25、50、100、150、200 mg/L的7#培養(yǎng)基固體平板上。上述平板置于28 ?℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察平板上菌落生長狀況，連續(xù)觀察7 d。

1.2.2 GDH基因敲除載體及敲除片段的構(gòu)建。

研究參照木醋桿菌基因敲除方案進(jìn)行[13，16]。通過構(gòu)建同源重組雙交換質(zhì)粒，用于HEC-004菌株GDH基因的敲除。其中同源敲除盒的結(jié)構(gòu)為GDH上同源臂-Kan表達(dá)盒-GDH下同源臂。其中基因組DNA提取、質(zhì)粒提取、PCR擴增、DNA酶切、回收、連接均參照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。質(zhì)?？寺〉乃拗鳛榘凑铡斗肿涌寺∈謨浴稢aCl2法制備的大腸桿菌DH5a化學(xué)感受態(tài)。

質(zhì)粒的具體構(gòu)建過程如下：按照表2所列的引物和DNA模板分別擴增4個片段并回收，各取0.5 μL作為混合模板，以GDHupF和GDHdownR為引物進(jìn)行4片段的overlapping PCR擴增。將上述融合PCR產(chǎn)物割膠回收后，利用HindⅢ和EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，并連接到同樣酶切的pMD18-T載體上，在含有50 mg/L Kan和100 mg/L Amp的LB雙抗平板上篩選，得到含有pBAC03-GDHKⅡ質(zhì)粒的克隆。

研究同時也嘗試直接采用線性化片段進(jìn)行基因敲除。將pBAC03-GDHKⅡ質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ和EcoRI雙酶切，獲取包含GDH上游同源臂、Kan抗性表達(dá)盒以及GDH下游同源臂的DNA作為線性基因敲除盒（命名GDHKⅡ）。

1.2.3 納塔葡糖酸醋桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化。以往文獻(xiàn)關(guān)于木醋桿菌的轉(zhuǎn)化均用HS培養(yǎng)基（表1）進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞制備，后采用電轉(zhuǎn)化的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化[17-18]。由于研究所使用的菌株為非標(biāo)準(zhǔn)菌株，其感受態(tài)細(xì)胞的制備及遺傳轉(zhuǎn)化的方式需進(jìn)行條件摸索。一般用處于對數(shù)生長期生長活力旺盛的細(xì)胞制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。為了篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)基及細(xì)胞生長狀態(tài)，對細(xì)胞在3種培養(yǎng)基中的生長狀況進(jìn)行生長曲線考察。

生長曲線的制作方法：從7#平板上挑2個在28 ℃培養(yǎng)了5 d的單克隆，分別轉(zhuǎn)接到含25 mL HS、C2和7#培養(yǎng)基的三角瓶中，同時加入1%纖維素酶溶液防止細(xì)菌纖維素的形成，150 r/min，28 ℃培養(yǎng)36 h，然后分別轉(zhuǎn)接10%培養(yǎng)物到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，測定OD600至衰亡期。每種培養(yǎng)基進(jìn)行3個平行試驗。

納塔葡糖酸醋桿菌HEC-004菌株電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備按照以下方法進(jìn)行：①將細(xì)胞養(yǎng)至對數(shù)生長期，用于感受態(tài)細(xì)胞的制備。②將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入50 mL滅菌離心管中，在預(yù)冷的離心機中4 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。

③去上清后，用預(yù)冷的1 mmol/L HEPES溶液（pH7.0）對細(xì)胞輕輕懸浮洗滌，4 ℃ 4 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。并將步驟③重復(fù)一遍。

④用預(yù)冷的15%甘油輕輕重懸細(xì)胞，4 ℃ 4 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。⑤往收集的細(xì)胞沉淀中加入1 mL預(yù)冷的15%甘油，置于冰上用于電轉(zhuǎn)化。

⑥在一個預(yù)冷的1.5 mL離心管中加入1 μg DNA量的待轉(zhuǎn)化pBAC03-GDHKⅡ質(zhì)粒或者Hind Ⅲ和Eco RI雙酶切的線性化DNA片段，然后加入40 μL做好的感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的2 mm電轉(zhuǎn)杯中。⑦轉(zhuǎn)化使用Bio-Rad MicroPulser基因?qū)雰x，嘗試使用電壓：1.5、2.0、2.5和3.0 kV。⑧電擊完畢后在電轉(zhuǎn)杯中迅速加入預(yù)冷的7#培養(yǎng)基1 mL，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 PA瓶中進(jìn)行6 h的復(fù)蘇培養(yǎng)。⑨6 h后收集菌液，離心濃縮到100 μL，涂布到含有50 mg/L Kan的平板上。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定。

根據(jù)細(xì)胞內(nèi)同源重組的原理，由于pBAC03-GDHKⅡ載體上具有與GDH基因上下游相同的同源臂，因此轉(zhuǎn)化所得到的轉(zhuǎn)化子理論上會出現(xiàn)3種結(jié)局：①上游同源臂或者下游同源臂發(fā)生了單交換，整個質(zhì)粒插入到GDH位置（圖1A），形成2個拷貝的GDH基因，同時具有Kan和Amp抗性;②按照預(yù)期進(jìn)行雙交換;Kan基因替換原GDH基因（圖1B），克隆只具有Kan抗性，沒有Amp抗性;③發(fā)生了隨機整合，原GDH基因處未發(fā)生變化（圖1C），菌株可能同時具有Kan和Amp抗性。而GDHKⅡ線型片段轉(zhuǎn)化子只有2種可能：①按照預(yù)期進(jìn)行了雙交換;②發(fā)生了隨機整合。

由于單交換菌株發(fā)生重組后存在正向重復(fù)，能發(fā)生同源重組，形成回復(fù)突變，因此從穩(wěn)定性方面考慮，目的是篩選進(jìn)行了雙交換的克隆。菌株在含有50 mg/L Kan的抗性平板上生長5 d后，進(jìn)行克隆的篩選。

采用pBAC03-GDHKⅡ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子，挑取分別接種到含有200 mg/L Amp抗性的C2瓊脂平板和50 mg/L Kan抗性的C2瓊脂平板進(jìn)行抗性測試;將只能在Kan平板上生長的轉(zhuǎn)化子用于進(jìn)一步的PCR基因型驗證。線性化片段轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子直接采用PCR的方法進(jìn)行驗證。在GDH被替換區(qū)域兩側(cè)設(shè)計引物GDH-F1（5′-cggactgtatcacggtaatcagg-3′）和GDH-R2（5′-caggcggtcctgccacagcac-3′）用于進(jìn)行整合菌株雙交換轉(zhuǎn)化子的鑒定。

1.2.5 GDH基因敲除菌株與出發(fā)菌株的產(chǎn)纖維素比較。將篩選到的GDH基因敲除菌株與野生HEC-004菌株進(jìn)行產(chǎn)纖維素比較試驗。在三角瓶中考察纖維素膜的產(chǎn)量，并測定發(fā)酵過程的pH，以確定GDH的敲除是否能降低發(fā)酵過程葡萄糖酸的產(chǎn)生而改善菌株的產(chǎn)膜能力。

為進(jìn)一步確定GDH敲除對葡萄糖消耗及葡萄糖酸生成產(chǎn)生的影響，取發(fā)酵液200 μL與-20 ℃預(yù)冷的丙酮800 μL混勻，-20 ℃冷凍4 h后，12 000 r/min離心10 min進(jìn)行HPLC檢測，分析殘液中葡萄糖酸及葡萄糖含量。分析條件：流動相為85%乙腈，色譜柱為Agilent Glycan （4.6×150 mm），柱溫為45 ℃，流速為0.5 mL/min， RID檢測器溫度為35 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 納塔葡糖酸醋桿菌HEC-004對Kan和Amp的耐受性測定 通過比較發(fā)現(xiàn)其在不同抗性濃度下的生長有所不同（表3）。該菌在較高濃度的Amp抗生素培養(yǎng)基中仍然可以生長，在150 mg/L的Amp抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d可以在平板上觀察到微菌落。而在Kan抗性條件下，25 mg/L的濃度即可完全抑制菌體生長。綜合菌株在2種抗生素平板上的生長情況，在轉(zhuǎn)化子篩選過程中，Kan抗生素的濃度采用25 mg/L，Amp抗生素的濃度采用200 mg/L。

2.2 感受態(tài)制備培養(yǎng)基的優(yōu)化 將HEC-004菌株在HS培養(yǎng)基、7#培養(yǎng)基和C2培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該菌株在7#培養(yǎng)基和C2培養(yǎng)基中可以生長，但在HS培養(yǎng)基中不能生長。為了選擇最佳培養(yǎng)基并在合適時間收集細(xì)胞制備感受態(tài)，繪制了HEC-004在7#和C2培養(yǎng)基的生長曲線（圖2）。

從生長曲線上看，7#培養(yǎng)基和C2培養(yǎng)基的最大比生長速率均在μ=0.05。7#培養(yǎng)基的生長曲線顯示在35 h后不再生長。綜合考慮生長速率和細(xì)胞生長狀態(tài)以及制作感受態(tài)細(xì)胞所需要的細(xì)胞密度，選擇C2培養(yǎng)基作為感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，當(dāng)菌體濃度生長到OD600=1.0左右時用于電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備。

2.3 電轉(zhuǎn)化結(jié)果

pBAC03-GDHKⅡ質(zhì)粒圖譜見圖3。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含Kan抗生素的7#平板培養(yǎng)5 d后，能看到針尖大小的轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。不同條件下的轉(zhuǎn)化結(jié)果如表4所示。pBAC03-GDHKⅡ質(zhì)粒及其線性化敲除盒在2.0、2.5、3.0 kV電壓條件下均獲得轉(zhuǎn)化子，其中采用2.5 kV條件下得到的轉(zhuǎn)化子最多。

2.4 陽性克隆的篩選鑒定

通過抗性平板對pBAC03-GDHKⅡ載體轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行抗性表型篩選。挑選50個克隆在Amp平板上進(jìn)行點菌，其中有46個具有Amp抗性，剩余的4個采用引物GDH-F1和GDH-R2進(jìn)行PCR驗證，只有3個發(fā)生了預(yù)期的雙交換，雙交換概率6%。

GDHKⅡ線型片段所得到的轉(zhuǎn)化子，挑選了40個采用引物GDH-F1和GDH-R2進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果只有7個克隆具有預(yù)期基因型，陽性率為17.5%。

選取其中一個具有正確基因型的陽性克隆HEC-33進(jìn)行基因組的抽提，采用3組引物進(jìn)行再鑒定，結(jié)果表明HEC-33在3對引物的擴增下均具有預(yù)期大小的片段（圖4），進(jìn)一步證明了所挑選克隆為雙交換的轉(zhuǎn)化子。該克隆用于下一步的產(chǎn)膜試驗驗證。

2.5 GDH敲除菌株產(chǎn)纖維素發(fā)酵 選取成功進(jìn)行了雙交換的一株菌株HEC-33進(jìn)行產(chǎn)膜發(fā)酵試驗。三角瓶中細(xì)菌纖維素膜的結(jié)果表明，與野生菌株HEC-004相比，HEC-33菌株產(chǎn)膜速度變慢，但最終的纖維素膜產(chǎn)量提升，該結(jié)果與Kuo等[13]敲除G.xylinus菌株中的結(jié)果類似。經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，與野生菌株相比，HEC-33菌株的產(chǎn)膜濕重提高了18.3%。通過肉眼觀察，工程菌株所產(chǎn)膜質(zhì)地更均勻，柔韌性更好。對HEC-004和HEC-33菌株在三角瓶中培養(yǎng)的纖維素膜發(fā)酵殘液進(jìn)行pH測定，也證明敲除了GDH基因的菌株，其發(fā)酵殘液中沒有葡萄糖酸的產(chǎn)生（表5）。

3 討論

該研究通過培養(yǎng)基篩選確定了高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的G.nataicola 菌株HEC-004的感受態(tài)制備方法。由于目前暫未查詢到有文獻(xiàn)研究G.nataicola的遺傳轉(zhuǎn)化方法，試驗首先借鑒了文獻(xiàn)報道常用于培養(yǎng)Gluconacetobacter屬的HS培養(yǎng)基[12-13]對HEC-004菌株進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明HEC-004菌株在HS培養(yǎng)基中難以生長，說明HEC-004菌株與目前文獻(xiàn)報道的Gluconacetobacter屬其他菌株在代謝生理上存在區(qū)別。

不少研究中從自然界中分離產(chǎn)纖維素微生物時采用的均為HS培養(yǎng)基[19]，而該研究中的高產(chǎn)纖維素菌株在該類型中不能生長，這可能導(dǎo)致高產(chǎn)菌株的漏篩，因此該研究結(jié)果可為后續(xù)菌株篩選提供借鑒。

以往的研究文獻(xiàn)中，產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株的基因敲除都是采用帶同源臂的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化[13，16]。該研究嘗試線性化片段進(jìn)行直接電轉(zhuǎn)化，也可以得到陽性轉(zhuǎn)化子，證明了可以通過直接轉(zhuǎn)線性化片段對G.nataicola進(jìn)行基因敲除或者敲入。由于線性化片段不會出現(xiàn)單交換克隆子，因此在該研究中，轉(zhuǎn)化子中采用線性片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化的雙交換概率大于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗組（17% vs 6%）。該結(jié)果也說明，G.nataicola菌的同源重組概率較低，相對而言，大多數(shù)轉(zhuǎn)化子均發(fā)生了非同源重組插入到了基因組的未知位置。在后期研究中，可借助目前廣泛使用的基因編輯方法，在該類菌株中建立基因編輯系統(tǒng)，提高對菌株定向操作的能力。

GDH基因負(fù)責(zé)編碼G.nataicola菌株中的葡萄糖脫氫酶，使發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖變?yōu)槠咸烟撬?。試驗中敲除GDH后所得到的HEC-33菌株生長速度變慢，產(chǎn)膜速度也變慢，這可能與GDH基因編碼的葡萄糖脫氫酶在葡萄糖脫氫過程中產(chǎn)生還原型PQQ輔酶能促進(jìn)細(xì)胞生長有關(guān)[20]，敲除該基因后影響了還原型PQQ的生成，因此菌體生長速度變慢。但是發(fā)酵結(jié)束時，工程菌株的膜產(chǎn)量比野生型高，推測野生型菌株中葡萄糖酸的產(chǎn)生影響了發(fā)酵體系的pH，使得體系過酸，導(dǎo)致后期菌體活力下降，產(chǎn)膜能力受影響。

4 結(jié)論

以一株工業(yè)化高產(chǎn)細(xì)菌纖維素的納塔葡糖酸醋桿菌為對象，研究了其遺傳轉(zhuǎn)化條件，并敲除了其中與葡萄糖酸生成相關(guān)的葡萄糖脫氫酶基因GDH，構(gòu)建了一株在長周期發(fā)酵過程中具有更高產(chǎn)膜能力的工程菌株。

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