董蕾　黃曉波　劉靜璇

摘要 多重PCR技術(shù)建立在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，作為一種高效、快速、高靈敏性及特異性的方法，其被應(yīng)用在食品檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域。從食品安全檢測(cè)角度，簡(jiǎn)要論述多重PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和弓形菌等食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用，并根據(jù)長(zhǎng)期工作總結(jié)多重PCR技術(shù)操作的重難點(diǎn)和前景展望，以期為多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的工作提供幫助。

關(guān)鍵詞 多重PCR;食品致病菌;檢測(cè)

中圖分類號(hào) TS207.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2020）11-0015-04

AbstractMultiplex PCR which is based on conventional PCR is an efficient， fast， sensitive and specific method for food detection. In this paper， the application of multiplex PCR in detection of foodborne pathogenic bacteria such as Escherichia coli， Staphlococcus aureus and Arcobacter， etc. was discussed to provide support for the work of multiplex PCR technology in food detection.

Key words Multiplex PCR;Food pathogenic bateria;Detection

自1988年Chamberlain等[1]首次提出多重PCR技術(shù)（multiplex polymerase chain reaction，MPCR），并利用該技術(shù)進(jìn)行杜氏營養(yǎng)不良癥（Duchenne musculardystrophy）基因外顯子缺失的檢測(cè)以來，多重PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)（包括遺傳病診斷、病原體檢測(cè)等）、食品科學(xué)（食品原料溯源、食品病原微生物檢測(cè)等）等科學(xué)領(lǐng)域均有極大貢獻(xiàn)，成為檢測(cè)的一項(xiàng)重要技術(shù)工具。筆者從食品安全檢測(cè)角度，簡(jiǎn)要論述多重PCR技術(shù)在金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和弓形菌等食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用，并根據(jù)長(zhǎng)期工作總結(jié)多重PCR技術(shù)操作的重難點(diǎn)和前景展望，以期為多重PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的工作提供幫助。

1 多重PCR技術(shù)簡(jiǎn)介

多重PCR技術(shù)又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR技術(shù)，是一種建立在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，并進(jìn)行改進(jìn)的新型PCR技術(shù)。不同于常規(guī)PCR的單一引物擴(kuò)增，在多重PCR體系中同時(shí)加入多對(duì)引物進(jìn)行多目標(biāo)DNA片段擴(kuò)增[2]，由于目標(biāo)片段大小不同，經(jīng)由多重PCR擴(kuò)增后，凝膠成像即可直接進(jìn)行分析[3]。該方法相比常規(guī)PCR方法，因其在同一體系中同時(shí)進(jìn)行多目標(biāo)DNA片段的擴(kuò)增，從而達(dá)到節(jié)約模板DNA、節(jié)省時(shí)間和成本的優(yōu)勢(shì)。

多重PCR技術(shù)建立在常規(guī)PCR技術(shù)之上，利用模板DNA、多對(duì)引物、4種脫氧核糖核苷酸，依賴于DNA聚合酶完成酶促合成反應(yīng)。多重PCR技術(shù)具有高效性：在同一反應(yīng)體系、反應(yīng)時(shí)間內(nèi)可以同時(shí)檢測(cè)多種病原菌或目標(biāo)基因;系統(tǒng)性：對(duì)于同一食品或癥狀相同的病原菌可以進(jìn)行同時(shí)檢測(cè);經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性：由于在同一體系內(nèi)同時(shí)反應(yīng)，可大大節(jié)約檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)試劑[4]。

2 多重PCR技術(shù)在食品致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

多重PCR技術(shù)在同一體系中加入不同目標(biāo)片段的引物，即可完成在一次反應(yīng)中多個(gè)目標(biāo)片段的同時(shí)擴(kuò)增，多重PCR技術(shù)大大提升了檢驗(yàn)過程的時(shí)長(zhǎng)、降低了試劑耗材的損耗，使檢驗(yàn)過程快速簡(jiǎn)便，被廣泛應(yīng)用于食品檢驗(yàn)的各個(gè)領(lǐng)域。

2.1 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，SA）在自然界分布廣泛，是革蘭氏陽性菌的代表，能夠引起人和動(dòng)物的嚴(yán)重感染發(fā)病，是一種重要的人類病原菌[5-6]。該菌所產(chǎn)生的腸毒素（SE）引起的食物中毒是世界性的衛(wèi)生難題，在美國、加拿大等國家，由于金黃色葡萄球菌引起的食物中毒現(xiàn)象超過30%，中國也時(shí)有發(fā)生。近年來利用PCR技術(shù)診斷檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素，使檢測(cè)快速準(zhǔn)確。

楊玉軍等[7]針對(duì)金黃色葡萄球菌最常引起食物中毒的4種類別（A、B、C、D型）SE基因保守序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物（表1），對(duì)SE片段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得最優(yōu)反應(yīng)體系，總體積為25 μL體系中，各引物濃度為0.2 μmol/L;徐曉可等[8]以耐熱核酸酶基因nuc、纖維蛋白原結(jié)合蛋白基因clfA和SmaI限制性酶切片段特異序列為目標(biāo)片段，設(shè)計(jì)引物3對(duì)（表1），驗(yàn)證靈敏度在模板水平上可達(dá)1.197 3 ng;Costa等[9]針對(duì)mecA和nuc目標(biāo)片段，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，效果優(yōu)異（表1）。

2.2 沙門氏菌的檢測(cè)

沙門氏菌（Salmonella）是一類革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科，除感染人以外，也會(huì)感染哺乳類、鳥類、魚類等，當(dāng)人接觸含這類菌的食物時(shí)均會(huì)引起食物中毒，出現(xiàn)傷寒、腸胃炎、腸毒癥、敗血癥等腸道疾病。每年全球由于沙門氏菌引發(fā)的食源性疾病均居于食源性疾病病因的前列[10-13]。

邵碧英等[14]根據(jù)沙門氏屬特異基因hut基因、hilA基因、invA基因和hns基因設(shè)計(jì)特異性引物，實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的三重PCR;唐雨德等[15]針對(duì)S1、S2、invA基因設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，對(duì)16株沙門氏菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，靈敏度平均為100 CFU，人工污染樣品最低檢出限為10 CFU，大大縮短檢驗(yàn)時(shí)間（表2）。

[2] KIM J，DEMEKE T，CLEAR R M，et al.Simultaneous detection by PCR of Escherichia coli，Listeria monocytogenes and Salmomella typhimurium in artificially inoculated wheat grain[J].Int J Food Microbiol，2006，111：21-25.

[3] 李業(yè)鵬，鐘凱，楊寶蘭，等.食品中沙門菌PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2006，18（1）：17-22.

[4] 譚貴良，賴心田.現(xiàn)代分子生物學(xué)及組學(xué)技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[M].廣州：中山大學(xué)出版社，2014.

[5] 胡曉寧，蘇誠玉，權(quán)玉玲，等.甘肅省生鮮乳中金黃色葡萄球菌及腸毒素污染狀況調(diào)查[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（4）：984-985，989.

[6] 白曉娟.多重PCR檢測(cè)原料乳品中微生物研究[J].食品工業(yè)，2018，39（4）：313-315.

[7] 楊玉軍，黃韋唯，王志云，等.多重PCR快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌四型腸毒素基因的研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36（9）：1713-1715.

[8] 徐曉可，吳清平，張菊梅，等.食品中金黃色葡萄球菌多重PCR檢測(cè)方法的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30（1）：84-89.

[9] COSTA A M，KAY I，PALLADINO S.Rapid detection of mecA and nuc genes in staphylococci by realtime multiplex polymerase chain reaction[J].Diagnostic microbiology and infectious disease，2005，51（1）：13-17.

[10] European Food Safety Authority（EFSA）.The European union summary report on trends and sources of zoonoses，zoonotic agents and foodborne outbreaks in 2011[R].EFSA，2013.

[11] Centers for Disease Control and Prevention.Salmonella[R].CDC，2011.

[12] ALMEIDA C，CERQUEIRA L，AZEVEDO N F，et al.Detection of Salmonella enterica serovar Enteritidis using real time PCR，immunocapture assay，PNA FISH and standard culture methods in different types of food samples[J].Int J Food Microbiol，2013，161（1）：16-22.

[13] Centers for Disease Control and Prevention.Investigation update：Multistate outbreak of human Salmonella Enteritidis infections associated with shell eggs[R].CDC，2010.

[14] 邵碧英，陳彬，湯敏英，等.沙門氏菌多重PCR檢測(cè)方法的建立[J].食品科學(xué)，2007，28（10）：489-492.

[15] 唐雨德，梁洪軍，周東明，等.應(yīng)用多重PCR檢測(cè)食品中的沙門菌[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，16（5）：1366-1369.

[16] HO H T K，LIPMAN L J A，GAASTRA W.Arcobacter，what is known and unknown about a potential foodborne zoonotic agent！[J].Vet Microbiol，2006，115（1/2/3）：1-13.

[17] VANDAMME P，DE LEY J.Proposal for a new family，Campylobacteraceae[J].Int J Syst Bacteriol，1991，41（3）：451-455.

[18] VANDAMME P，F(xiàn)ALSEN E，ROSSAU R，et al.Revision of Campylobacter，Helicobacter and Wolinella taxonomy：Emendation of generic descriptions and proposal of Arcobacter gen.nov.[J].Int J Syst Bacteriol，1991，41（1）：88-103.

[19] CHINIVASAGAM H N，CORNEY B G，WRIGHT L L，et al.Detection of Arcobacter spp.in piggery effluent and effluentirrigated soils in southeast Queensland[J].Appl Environ Microb，2007，103（2）：418-426.

[20] RIVAS L，F(xiàn)EGAN N，VANDERLINDE P.Isolation and characterisation of Arcobacter butzleri from meat[J].Int J Food Microbiol，2004，91（1）：31-41.

[21] HOUF K，TUTENEL A，DE ZUTTER L，et al.Development of a multiplex PCR assay for the simultaneous detection and identification of Arcobacter butzleri，Arcobacter cryaerophilus and Arcobacter skirrowii[J].FEMS Microbiol Lett，2000，193（1）：89-94.

[22] 畢水蓮，劉一鳴，陳金，等.多重PCR法檢測(cè)雞肉中3種食源性弓形菌[J].中國食品學(xué)報(bào)，2014，14（8）：227-232.

[23] 馮可，胡文忠，姜愛麗，等.鮮切果蔬中4種病原微生物多重PCR檢測(cè)技術(shù)[J].食品科學(xué)，2018，39（6）：276-283.

[24] 姜華，焦陽，李遠(yuǎn)宏，等.多重PCR檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中3種食源性致病菌[J].食品工業(yè)科技，2018，39（14）：213-218.

[25] 苗小草，陳萬義，施春雷，等.乳品中4種常見致病菌多重PCR檢測(cè)方法的建立[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，39（1）：63-71.

[26] 李遠(yuǎn)宏，張逸飛，張慶成，等.谷類食品中克羅諾桿菌的分離與鑒定[J].食品工業(yè)科技，2016，37（15）：154-158，164.

[27] MALORNY B，HOORFAR J，BUNGE C，et al.Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR：Towards an international standard[J].Applied and environmental microbiology，2003，69（1）：290-296.

[28] CHEN W Y，AI L Z，YANG J L，et al.Development of a PCR assay for rapid detection of Cronobacter spp.from food[J].Canadian journal of microbiology，2013，59（10）：656-661.

[29] 楊帆，王紅寧，張安云，等.多重PCR檢測(cè)病死雞中沙門氏菌方法的研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，52（1）：163-169.

[30] KIM C H，KHAN M，MORIN D E，et al.Optimization of the PCR for detection of Staphylococcus aureus nuc gen in bovine milk[J].Journal of dairy science，2001，84（1）：74-83.

[31] PARK Y S，LEE S R，KMI Y G.Detection of Escherichia coli O157：H7，Salmonella spp.，Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in kimchi by multiplex polymerase chain reaction（mPCR）[J].The journal of microbiology，2006，44：92-97.

[32] DOOLEY J J，PAINE K E，GARRETT S D，et al.Detection of meat species using TaqMan realtime PCR assays[J].Meat science，2004，68（3）：431-438.

[33] GIRISH P S，ANJANEYULU A S R，VISWAS K N，et al.Meat species identification by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism（PCRRFLP）of mitochondrial 12S rRNA gene[J].Meat science，2005，70（1）：107-112.

[34] GHOVVATI S，NASSIRI M R，MIRHOSEINI S Z，et al.Fraud identification in industrial meat products by multiplex PCR assay[J].Food control，2009，20（8）：696-699.

[35] YIN R H，BAI W L，WANG J M，et al.Development of an assay for rapid identification of meat from yak and cattle using polymerase chain reaction technique[J].Meat science，2009，83（1）：38-44.

[36] SOARES S，AMARAL J S，MAFRA I，et al.Quantitative detection of poultry meat adulteration with pork by a duplex PCR assay[J].Meat science，2010，85（3）：531-536.

[37] 蘇葳藝，李欣南，于雷，等.利用多重PCR方法檢測(cè)牛肉中的摻假肉[J].食品工業(yè)，2015，36（2）：277-280.

[38] 許曉丹，劉暢，史永翠，等.轉(zhuǎn)基因大豆食品中外源基因種類及食用安全性分析[J].食品與藥品，2013，15（6）：446-449.

[39] KPPEL R，SENDIC A，WAIBLINGER H U.Two quantitative multiplex realtime PCR systems for the efficient GMO screening of food products[J].European food research and technology，2014，239：653-659.

[40] KPPEL R，BUCHER T，F(xiàn)REI A，et al.Droplet digital PCR versus multiplex realtime PCR method for the detection and quantification of DNA from the four transgenic soy traits MON87769，MON87708，MON87705 and FG72，and lectin[J].European food research and technology，2015，241：521-527.

[41] WANG F J，ZHANG X L，F(xiàn)ENG J L，et al.Establishment of a quadruplex realtime PCR for screening of genetically modified tomatoes[J].European food research and technology，2014，238（4）：683-690.