周福平，王堅(jiān)強(qiáng)，范娜，張海燕，史紅梅，楊彬，張桂香

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所/高粱遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西晉中030600）

早春冷害是高粱幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的主要非生物脅迫因素之一，培育廣適性耐冷品種是解決高粱早春冷害的行之有效途徑。明確抗冷性鑒定指標(biāo)和掌握鑒定方法，可以提高高粱品種耐冷鑒定和篩選的效率，加快高粱耐冷品種的選育進(jìn)程［1］。

高粱播種后，種植區(qū)域遭遇低溫氣候會(huì)對(duì)高粱種子的萌發(fā)、出苗和幼苗生長(zhǎng)造成一定程度的傷害。種子萌發(fā)和高粱幼苗階段低溫冷害已經(jīng)成為影響高粱產(chǎn)量的重要因素之一。

有關(guān)植物的耐冷性生理指標(biāo)，國(guó)內(nèi)學(xué)者已在黃瓜［2］、扁蓿豆［3］、水稻［4］、玉米［5］等作物上做了大量研究。我國(guó)高粱研究學(xué)者就關(guān)于高粱耐低溫材料的篩選、鑒定等研究做了初步工作，之后有研究者從高粱資源中篩選出了一批耐冷材料，并從傷害率、總糖含量等方面做了一些研究［6］，表明高粱品種間耐冷性存在差異，一些生理指標(biāo)的測(cè)定也有助于對(duì)高粱耐冷性的確定。

篩選耐冷高粱品種，明確高粱幼苗的耐冷生理機(jī)制，對(duì)于選育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的耐冷型高粱種資尤為重要。關(guān)于高粱耐低溫脅迫的機(jī)制以及品種間的耐冷性比較的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)對(duì)高粱幼苗進(jìn)行2 ℃低溫脅迫的不同時(shí)間處理，檢測(cè)分析幼苗葉片中的 SOD 活性、POD 活性、MDA 含量、Pro 含量，比較不同品種間耐冷響應(yīng)機(jī)制，建立多因素高粱耐冷種質(zhì)鑒定綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，為耐冷高粱品種的選育及高粱耐冷性科學(xué)鑒定提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018 年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選擇2 個(gè)耐冷品種（2 ℃下，死苗率為≤15%，為耐冷材料）“凍高粱”和“紅殼四號(hào)”和2 個(gè)冷敏品種（2 ℃下，死苗率為≥80%，為冷敏材料）“SC407”和“晉 303”為試驗(yàn)材料。2017 年在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行高粱品種耐冷性鑒定結(jié)果如表1 所示。

表1 高粱品種耐冷性鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of cold tolerance of sorghum lines

1.2 試驗(yàn)方法

將參試材料種于發(fā)芽盒內(nèi)，3 次重復(fù)。置于適宜高粱生長(zhǎng)的室外環(huán)境中，常溫下統(tǒng)一管理，待高粱長(zhǎng)出三葉一心后，選取大小一致的幼苗，把發(fā)芽盒中完整植株置于脅迫溫度2 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，脅迫處理時(shí)間分別為12、24、36 h，以室外生長(zhǎng)的材料作為對(duì)照。每個(gè)處理分別取高粱幼苗 0.2 g，進(jìn)行 MDA 含量、SOD 活性、POD 活性、Pro 含量等4 項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 生理指標(biāo)及測(cè)定方法

參照任紅旭等［7］方法提取酶液，參照高俊鳳［8］的氮藍(lán)四唑（NBT）還原法測(cè)定SOD 活性。

POD 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，參照高俊鳳［8］的方法進(jìn)行。

MDA 含量測(cè)定用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法，參照王學(xué)奎［9］的方法進(jìn)行。

Pro 含量測(cè)定方法采用茚三酮方法［10］。

1.4 耐冷性綜合評(píng)價(jià)方法

隸屬函數(shù)平均值法是植物抗逆生理實(shí)驗(yàn)中常用的一種方法，可用于多指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)，能消除個(gè)別評(píng)價(jià)指標(biāo)評(píng)價(jià)的片面性，使供試材料的耐冷性差異具有可比性，對(duì)于反映植物的抗逆性更為合理準(zhǔn)確。隸屬函數(shù)平均值U 越大，說(shuō)明植物的耐冷性越強(qiáng)［11］。

耐冷系數(shù)=脅迫后的測(cè)量值/對(duì)照的測(cè)量值

與耐冷性呈正相關(guān)的參數(shù)POD、SOD 和Pro隸屬函數(shù)采用公式：

與耐冷性呈負(fù)相關(guān)的參數(shù)MDA 隸屬函數(shù)采用公式：

式中，Uij為 i 品種 j 指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xij為 i 品種 j指標(biāo)的耐冷系數(shù)；Xmax為所有品種中此指標(biāo)的最大值；Xmin為所有品種中此指標(biāo)的最小值。Ui是為i品種的各性狀的平均耐冷隸屬函數(shù)值。

參考宋廣樹(shù)［12］水稻耐冷性綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，確定高粱品種耐冷分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：U≥0.7 為耐冷品種，0.4≤U＜0.7 為中等耐冷品種，U＜0.4 為冷敏品種。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用DPS 10.5 和Excel 2007 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用LSD 法（P＜0.05 和P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 各生理指標(biāo)的基本統(tǒng)計(jì)分析

表2 為4 個(gè)高粱品種不同時(shí)間低溫脅迫下各生理指標(biāo)性狀的平均數(shù)、極差、變異系數(shù)、最大值、最小值的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

由表2 可知，供試品種的MDA 含量最小為6.737 μmol·g-1，最 大 為 23.425 μmol·g-1；POD 活性 最 小 為 2.968 U·min-1·g-1，最 大 達(dá) 5.335 U·min-1·g-1；SOD 活性最低為 315.328 U·g-1，最高為878.747 U·g-1；脯氨酸含量最低為 1.167 mg·g-1，最高達(dá) 2.147 mg·g-1。

同時(shí)可以看出，供試品種的變異系數(shù)存在較大差異在15.4%～39.8%之間變化，其中，MDA含量、SOD 活性和游離脯氨酸變異系數(shù)較大，在25.4%～39.8%之間，變異系數(shù)的變化區(qū)間大反映了性狀指標(biāo)存在的差異大。POD 活性的變異系數(shù)中等（15.4%）；表明參試品種的POD 活性差異較小。以上數(shù)據(jù)分析顯示，不同時(shí)長(zhǎng)的低溫脅迫處理對(duì)高粱品種耐冷性影響存在著較大變異。

表2 不同低溫脅迫時(shí)間高粱苗期生理指標(biāo)性狀Table 2 Physiological indices in sorghum seedlings under different low temperature stress periods.

2.2 低溫脅迫各生理指標(biāo)的方差分析

4 個(gè)高粱品種的4 個(gè)生理指標(biāo)各性狀在處理間、品種間、低溫脅迫時(shí)間均達(dá)到了顯著或極顯著水平，品種×低溫脅迫時(shí)間之間的互作的未達(dá)到差異顯著（表3）。不同低溫脅迫時(shí)間處理間的MDA 含量、SOD 活性差異極顯著（P＜0.01），POD 活性差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），脯氨酸差異不顯著。品種處理間和低溫脅迫時(shí)間處理間的 2 個(gè)生理指標(biāo)（MDA 含量、SOD 活性、POD 活性）差異極顯著（P＜0.01），而脯氨酸含量差異不顯著。

表3 不同低溫脅迫時(shí)間對(duì)高粱苗期生理指標(biāo)的方差分析Table 3 Variance analysis of physiological indexes of sorghum seedlings under different low temperature stress time

2.3 低溫脅迫對(duì)高粱幼苗MDA 含量的影響

MDA（丙二醛）是膜脂過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，12、24、36 h 低溫處理的冷敏品種“晉 303”、“SC407”和“凍高粱”的MDA 含量與CK 處理差異達(dá)顯著水平，且耐冷品種“凍高粱”不同時(shí)間低溫處理間差異顯著，36 h 低溫脅迫處理的耐冷品種“紅殼四號(hào)”和“凍高粱”與對(duì)照相比差異達(dá)顯著水平（表4）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，高粱耐冷和冷敏品種的幼苗MDA 含量均呈增高趨勢(shì)，而且脅迫前期上升速度較快，隨著低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)上升速度延緩。低溫脅迫后期，上升的幅度品種間有明顯差異，冷敏品種“晉303”和“SC407”上升平均幅度較大，分別為158.2%、133.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于耐冷品種“紅殼四號(hào)”和“凍高粱”上升平均幅度，分別為58.9%、80.0%，且冷敏品種的MDA 含量始終高于耐冷品種（圖1）。

2.4 低溫脅迫對(duì)高粱幼苗POD 活性的影響

隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，冷敏品種POD 活性各低溫處理間差異不顯著，耐冷品種與對(duì)照相比，12、36 h 處理差異均達(dá)顯著水平（表5）。由此表明冷敏品種在低溫脅迫下，POD 活性增加不明顯，而耐冷品種隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，POD 活性比對(duì)照有明顯提升，這樣在一定程度上幫助高粱幼苗調(diào)節(jié)細(xì)胞膜透性，防止膜受損傷，從而提高了高粱幼苗的低溫適應(yīng)能力。

2 類高粱材料的幼苗POD 活性隨低溫脅迫時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，耐冷品種和冷敏品種幼苗在低溫脅迫12 h 內(nèi)，POD 活性均增至最高值，其平均增幅分別為53.6%、31.8%，然后開(kāi)始下降，在隨后36 h 內(nèi)，活性平穩(wěn)下降，但與對(duì)照相比，仍維持在高于對(duì)照的水平（圖2）。耐冷品種的峰值、24 h 的值、36 h 的值均高于冷敏品種。

表4 不同高粱品種不同時(shí)間葉片MDA 含量變化Table 4 Changes of MDA in leaves of different sorghum lines at different time 單位：μmol·g-1

圖1 低溫下不同處理時(shí)間對(duì)高粱苗期MDA 含量的影響Fig.1 Effect of different treatment time on MDA content of sorghum seed seedings

表5 不同高粱品種不同時(shí)間下葉POD 活性變化Table 5 Changes of POD activity in leaves of different sorghum lines at different time 單位：U·min-1·g-1

2.5 低溫脅迫對(duì)幼苗SOD 活性的影響

隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD 活性變化冷敏品種“SC407”的對(duì)照、12、24、36 h 處理間差異不顯著，“晉303”與對(duì)照相比12、36 h 差異均達(dá)顯著水平，12 h 與36 h 處理間差異也達(dá)顯著水平，其余處理間差異呈不顯著水平；而耐冷品種“紅殼四號(hào)”和“凍高粱”與對(duì)照相比12 h 差異達(dá)顯著水平，其余處理間差異不顯著（表6）。

耐冷和冷敏兩類高粱品種的幼苗葉片SOD 與POD 活性低溫脅迫處理的變化趨勢(shì)基本一致，活性峰值出現(xiàn)的低溫脅迫時(shí)間相同，其平均增幅分別為43.5%、37.3%，且低溫處理后的POD 活性增幅高于SOD 活性增幅，表明2 種酶對(duì)低溫脅迫有著不同的響應(yīng)機(jī)制（圖3）。

圖2 低溫下不同處理時(shí)間對(duì)高粱苗期POD 活性的影響Fig.2 Effect of different treatment time on POD activity of sorghum seedlings

表6 不同高粱品種不同時(shí)間下葉SOD 活性變化Table 6 Changes of SOD activity in leaves of different sorghum lines at different time 單位：U·g-1

圖3 低溫下不同處理時(shí)間對(duì)高粱苗期SOD 活性的影響Fig.3 Effect of different treatment time on SOD activity of sorghum seedlings.

2.6 低溫脅迫對(duì)幼苗Pro 含量的影響

方差分析顯示，2 類高粱品種的Pro 含量不同時(shí)間低溫脅迫處理間差異均未達(dá)到顯著。由圖4可知，隨低溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，2 種材料高粱品種幼苗葉片的Pro 含量變化均為升高趨勢(shì)，冷敏品種其上升平均幅度分別為21.1%、18.3%，耐冷品種其上升平均幅度分別為75.2%、41.3%，耐冷高粱幼苗的Pro 含量始終高于冷敏品種（表7）。由此表明，高粱幼苗Pro 含量與耐冷性成正比，遇冷脅迫可以通過(guò)生理機(jī)制增高脯氨酸含量來(lái)提高自身的抗寒性。

圖4 低溫下不同處理時(shí)間對(duì)高粱苗期pro 含量影響Fig.4 Effect of different treatment time on Pro content of sorghum seedlings.

表7 不同高粱品種不同時(shí)間下Pro 含量變化Table 7 Changes of proline content in leaves of different sorghum lines at different time 單位：mg·g-1

2.7 低溫脅迫下12 h 高粱品種的各種生理指標(biāo)隸屬函數(shù)及綜合評(píng)價(jià)

試驗(yàn)中由于 12 h 處理時(shí)的 SOD 活性、POD 活性最大，因而，計(jì)算4 種生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值時(shí)采用12 h 的各項(xiàng)值進(jìn)行。對(duì)低溫脅迫下12 h 內(nèi)的高粱生理指標(biāo)平均隸屬函數(shù)值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，U值越大，表示高粱幼苗的耐冷性越強(qiáng)。低溫脅迫下4 個(gè)高粱品種耐冷性U 值排序?yàn)椋篠C407＜晉303＜紅殼四號(hào)＜凍高粱。這與低溫下篩選結(jié)果基本一致，說(shuō)明隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)法可以應(yīng)用于耐冷篩選（表8）。

3 討論與結(jié)論

植物在逆境脅迫時(shí)可以通過(guò)自身生理功能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝，包括各種保護(hù)酶活性以及對(duì)抗逆境的生理物質(zhì)含量的調(diào)整，從而降低逆境條件下代謝過(guò)程產(chǎn)生的有害物質(zhì)對(duì)植物的傷害，有效保護(hù)植株正常生長(zhǎng)發(fā)育［13，14］。研究表明，遇冷脅迫時(shí)抗寒性較強(qiáng)的作物，其自身SOD 和POD 等保護(hù)酶仍能維持正常生理機(jī)能，凍害、冷害產(chǎn)生的毒害代謝物會(huì)被高活性的酶系統(tǒng)分解，減少和緩解了由膜脂過(guò)氧化所引起的膜傷害，從而增加了機(jī)體的抗寒能力［15～17］。由于低溫脅迫 ，細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的平衡被破壞從而有利于活性氧的產(chǎn)生?；钚匝踹^(guò)剩的毒害之一是引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷。因而作為膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，MDA 含量變化是質(zhì)膜損傷程度的重要標(biāo)志之一［16］。游離脯氨酸是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能增加胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，降低細(xì)胞的冰點(diǎn)，防止細(xì)胞過(guò)度脫水，從而減少低溫對(duì)細(xì)胞的傷害［18］。

本試驗(yàn)以高粱耐冷和冷敏品種為試驗(yàn)材料，對(duì)高粱苗期葉片低溫脅迫下不同時(shí)間的MDA 含量、SOD 活性、POD 活性等與耐冷性有關(guān)的生理指標(biāo)進(jìn)行分析測(cè)定，較為系統(tǒng)地研究和篩選高粱苗期耐冷性鑒定指標(biāo)，完善高粱耐冷性評(píng)價(jià)機(jī)制，建立高粱耐冷性種質(zhì)多項(xiàng)生理指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)體系，為耐低溫高粱品種的篩選提供依據(jù)，為更好更快對(duì)高粱耐冷資源進(jìn)行有效利用奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，低溫脅迫后，耐冷和冷敏材料的MDA 含量、SOD 活性、POD 活性及Pro 含量都出現(xiàn)了增高的趨勢(shì)，耐冷材料的 SOD 活性、POD 活性和 Pro 含量的增加顯著高于冷敏材料，而MDA 含量卻是冷敏材料的增加高于耐冷材料，這與張桂香［19］、馬艷青［20］、馬智宏［21］、廖啟［22］和曾智馳［23］等的研究結(jié)果一致。

表8 12 h 低溫脅迫高粱苗期生理指標(biāo)隸屬函數(shù)值、U 值及耐冷綜合評(píng)價(jià)Table 8 Membership function value of physiological indexes of sorghum seedlings under 12-hour low temperature stress，U value and comprehensive evaluation of cold tolerance

本試驗(yàn)認(rèn)為單一逆境生理指標(biāo)無(wú)法準(zhǔn)確判斷植物遇冷的綜合適應(yīng)能力，只有采用多項(xiàng)生理指標(biāo)的進(jìn)行隸屬函數(shù)值的綜合評(píng)價(jià)，才能比較準(zhǔn)確地反映品種的耐冷水平。本試驗(yàn)確定丙二醛、過(guò)氧化物酶、脯氨酸和超氧化物歧化酶4 個(gè)生理指標(biāo)可以為高粱耐冷性鑒定指標(biāo)，隸屬函數(shù)對(duì)高粱幼苗耐冷性綜合評(píng)價(jià)科學(xué)有效。