成天瓊，陳學(xué)農(nóng)

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 針灸科，貴州 遵義 563099)

肺癌是最常見和致命的惡性腫瘤之一，每年約有200萬新病例和180萬人死亡[1]。肺癌通常分為兩種組織病理亞型：小細(xì)胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)，NSCLC占所有肺惡性腫瘤的80%。根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示男性非小細(xì)胞肺癌平均5年生存率為19.2%，女性為26.8%[2]。NSCLC可以進(jìn)一步分為肺鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LADC)和大細(xì)胞癌，而LADC是最常見的肺癌亞型[3]，約占NSCLC的50%，且預(yù)后不佳。盡管隨著外科手術(shù)、放射治療、化學(xué)療法的發(fā)展，但大多數(shù)患者在診斷時(shí)存在局部或廣泛轉(zhuǎn)移，5年總生存率(Overall survival，OS)仍不到20%[2,4]。靶向藥物和免疫療法的應(yīng)用為患者帶來新的希望。腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)即腫瘤所在的細(xì)胞環(huán)境，具有異質(zhì)性，TME由免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和髓樣細(xì)胞以及炎癥介質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)分子等組成[5]，是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和患者高死亡率的關(guān)鍵因素[6]。肺癌的微環(huán)境取決于腫瘤細(xì)胞與鄰近的非癌性基質(zhì)細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的復(fù)雜相互作用[7]。癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)肺癌中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)并促進(jìn)肺癌進(jìn)展[8]。在過去十年研究中認(rèn)識(shí)到TME在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的中心作用[2,9-10]，原發(fā)性和繼發(fā)性肺腫瘤的TME是開發(fā)新型抗癌藥物的一個(gè)靶標(biāo)，針對(duì)TME的相關(guān)藥物包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、芳香化酶等已被批準(zhǔn)用于臨床[4,11]。在TME中，免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞是兩種主要的非腫瘤成分，對(duì)腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值，腫瘤微環(huán)境預(yù)后相關(guān)基因也可能成為下一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

Yoshihara等[12]設(shè)計(jì)了一種稱為ESTIMATE的算法，探討免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與腫瘤預(yù)后的潛在關(guān)系。隨后的研究很快將ESTIMATE算法應(yīng)用于急性白血病[13-14]、膠質(zhì)細(xì)胞瘤[15]、腎透明細(xì)胞癌[16-17]、結(jié)腸癌[18]和乳腺癌[19]，并顯示出這種基于大數(shù)據(jù)算法的有效性。故本研究基于ESTMATE算法探討免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與肺腺癌預(yù)后的潛在關(guān)系，獲取可預(yù)測(cè)肺腺癌患者預(yù)后不良的腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及評(píng)分 從TCGA數(shù)據(jù)門戶網(wǎng)站(https://portal.gdc.cancer.gov/，2019年11月21日訪問)下載可公開獲得肺腺癌隊(duì)列數(shù)據(jù)集，包括基因表達(dá)譜的三級(jí)數(shù)據(jù)和相關(guān)臨床信息。臨床信息包括年齡、性別、病理分期、組織學(xué)分級(jí)、生存時(shí)間和生存狀態(tài)。通過ESTIMATE算法對(duì)下載的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分，并根據(jù)評(píng)分的中位數(shù)將肺腺癌病例分為高分組和低分組。本研究涉及的所有數(shù)據(jù)均從TCGA下載，并且數(shù)據(jù)采集和應(yīng)用均按照TCGA出版指南和數(shù)據(jù)訪問政策進(jìn)行，無需當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)的額外批準(zhǔn)。

1.2 篩選差異表達(dá)基因 使用R(3.6.1版)上的“l(fā)imma”包(3.8版)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)用 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置：錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05，|log2FC|>1。

1.3 功能和通路富集分析及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用“clusterProfiler”、“enrichplot”R包(版本3.8)對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析[20]。GO分析揭示了差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程中的作用、細(xì)胞成分和分子功能，KEGG分析顯示差異表達(dá)基因的通路。校正P值<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了進(jìn)一步探討TME相關(guān)DEGs之間的相互作用，利用在線數(shù)據(jù)庫STRING(https://string-db.org/)構(gòu)建差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)[21]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用乘積極限法(Kaplan-Meier)繪制生存曲線、對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn) (Log-rank) 比較不同樣本的生存曲線。臨床特征與基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分之間的單因素分析用 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用R軟件(3.6.1版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪制韋恩圖、熱圖和生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 研究人群和基質(zhì)、免疫評(píng)分 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了522例肺腺癌患者的基因表達(dá)譜和臨床信息，其中女性280例(53.6%)、男性242例(46.3%)，對(duì)腫瘤組織 RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分。分析在TCGA中具有完整基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床信息的494例肺腺癌，根據(jù)ESTIMATE算法對(duì)下載的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分(見表1)，基質(zhì)評(píng)分范圍為-1 789.62～2 097.96，免疫評(píng)分范圍為-942.51～3 442.08。

表1 ESTMATE評(píng)分

ID基質(zhì)評(píng)分免疫評(píng)分ESTIMATE評(píng)分TCGA-78-7536-01A-11R-2066-07-409.3012239143.67482734.373596TCGA-78-7159-01A-11R-2039-0750.95684095777.2002078828.1570488TCGA-95-7039-01A-11R-1949-07134.6303603882.71773361017.348094TCGA-35-4123-01A-01R-1107-07831.65413282496.8083623328.462495TCGA-93-A4JQ-01A-11R-A24X-07945.90368192324.4172453270.320927TCGA-50-6590-01A-12R-1858-07…451.45496…2248.008966…2699.463926…TCGA-MP-A5C7-01A-11R-A262-07-1043.563327-86.22771915-1129.791046TCGA-67-6216-01A-11R-1755-07-168.7997611838.6193031669.819542TCGA-50-5936-01A-11R-1628-07313.2911311109.7376631423.028794TCGA-MP-A4SV-01A-11R-A24X-0791.133559711735.9363971827.069956TCGA-80-5611-01A-01R-1628-07-207.21365872022.2863051815.072646TCGA-69-7979-01A-11R-2187-07-71.44164873326.6069513255.1653026

2.2 肺腺癌總體生存率、臨床分期與免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的比較 為探討肺腺癌整體存活率與基質(zhì)評(píng)分和免疫評(píng)分的潛在相關(guān)性，將522例肺腺癌患者按基質(zhì)、免疫評(píng)分分為高低兩組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，免疫評(píng)分高組患者的生存時(shí)間比低分組長(zhǎng)(見圖1A，P<0.05)。與較低基質(zhì)評(píng)分的患者相比，基質(zhì)評(píng)分高的患者的總體生存時(shí)間也更長(zhǎng)(見圖1B，P=0.103)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析發(fā)現(xiàn)隨著肺腺癌分期的增高其免疫評(píng)分有所下降(見圖1C，P<0.05)，臨床分期越高基質(zhì)評(píng)分越低，但相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1D)。

A：免疫評(píng)分；B：基質(zhì)評(píng)分；C：免疫評(píng)分與臨床分期關(guān)系；D：基質(zhì)評(píng)分與臨床分期的關(guān)系。圖1 總體生存預(yù)后值

2.3 肺腺癌基因表達(dá)譜與免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的比較 為了揭示全球基因表達(dá)譜與免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的相關(guān)性，我們比較了TCGA數(shù)據(jù)庫中522例肺腺癌患者的微陣列數(shù)據(jù)。熱圖展示了高低免疫評(píng)分組(見圖2A)、基質(zhì)評(píng)分組(見圖2B)病例的不同基因表達(dá)譜。根據(jù)免疫評(píng)分進(jìn)行比較，高分組有611個(gè)基因上調(diào)，164個(gè)基因下調(diào)(|log2FC|>1，F(xiàn)DR<0.05)；同樣在基質(zhì)評(píng)分基礎(chǔ)上，高分組683個(gè)基因上調(diào)，120個(gè)基因下調(diào)(|log2FC|>1，F(xiàn)DR<0.05)。將免疫評(píng)分組上調(diào)基因和基質(zhì)評(píng)分組上調(diào)基因取交集，韋恩圖顯示高分組中有300個(gè)基因普遍上調(diào)(見圖3A)；將免疫評(píng)分組下調(diào)基因和基質(zhì)評(píng)分組下調(diào)基因取交集，韋恩圖顯示有67個(gè)基因普遍下調(diào)(見圖3B)。

A:高低免疫評(píng)分組差異表達(dá)基因熱圖 ；B：高低基質(zhì)評(píng)分組差異表達(dá)基因熱圖(P<0.05、|log2FC|>1)。圖2 TCGA基因表達(dá)譜與免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的比較

A：普遍上調(diào)的基因數(shù)目；B：普遍下調(diào)的基因數(shù)目。圖3 韋恩圖展示高免疫評(píng)分和高基質(zhì)評(píng)分組差異表達(dá)基因

2.4 具有預(yù)后價(jià)值基因的GO、KEGG及PPI網(wǎng)絡(luò)分析 為了揭示差異表達(dá)基因的潛在功能，對(duì)免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分普遍上調(diào)、下調(diào)的基因進(jìn)行了功能富集分析。用“clusterProfiler”R軟件包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析，分別展示了分子功能、生物過程、細(xì)胞組成三個(gè)部分前10個(gè)顯著的GO分類條目(校正后P<0.05，見圖4A)，表明這些差異表達(dá)基因與免疫細(xì)胞增殖和激活、免疫反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)和膜的細(xì)胞成分相關(guān)。此外，KEGG分析(校正后P<0.05，見圖4B)表明，大多數(shù)與差異表達(dá)基因相關(guān)的途徑均與免疫反應(yīng)顯著相關(guān)。使用在線STRING工具獲取了差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖4C)，網(wǎng)絡(luò)包括152個(gè)節(jié)點(diǎn)和612條邊。用R軟件作圖展示出該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中的前30個(gè)核心基因(見圖4D)，分別是FPR2、C3AR1、MCHR1、CCR5、FPR1、CCL19、CCR2、CXCL10、ADORA3、AGTR2、CCL1、CCL13、CCL21、CCR4、CCR8、CNR2、CXCL11、CXCL13、CXCL6、CXCL9、FPR3、GPR183、NPW、P2RY12、P2RY13、IGLL5、CD3G、ITGAM、GPR84、CD4。KEGG富集分析表明，這些核心基因主要與細(xì)胞因子受體相互作用通路、趨化因子信號(hào)通路、造血細(xì)胞、免疫反應(yīng)相關(guān)。這與以前的報(bào)道一致，即TME中的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞共同作用形成有利于腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境。

A：前10個(gè)顯著的GO(包括BP、CC、MF)分類條目；B：前30個(gè)顯著的KEGG通路(校正后P<0.05)；C：差異表達(dá)基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)；D：PPI網(wǎng)絡(luò)前30核心基因。圖4 用“clusterProfiler” R軟件包對(duì)DEGs進(jìn)行功能和通路富集分析

2.5 生存分析 為了探討單個(gè)差異表達(dá)基因的潛在預(yù)后價(jià)值，對(duì)來自TCGA數(shù)據(jù)庫的肺腺癌患者的367個(gè)差異表達(dá)基因和總體生存率之間進(jìn)行了生存分析。在367個(gè)差異表達(dá)基因中，總共顯示124個(gè)基因與總體生存率相關(guān)(log-rank，P<0.05)，其中49個(gè)基因與OS相關(guān)性較大(P<0.01，見表2)，6個(gè)基因與OS顯著相關(guān)(P<0.001，見圖5)，包含GAPT、TMEM273、CLEC17A、CLEC10A、STAP1、RUBCNL。

表2 肺腺癌預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)基因(前48個(gè))

基因P基因P基因PGAPT0.000340852MS4A10.002307784CD800.005729554TMEM2730.000583035ABCC80.002460802FCRL30.005791893CLEC17A0.000588371CCR20.002511909GIMAP40.006008343CLEC10A0.000767638BTK0.002518403IRF80.006078517STAP10.000788289PKHD1L10.002613721FCGR1B0.006085372RUBCNL0.000996332FDCSP0.00315138TNFRSF13B0.006324555FCRL10.001047671SCIMP0.003386817ARHGEF60.00683838CD200R10.001054917ARHGAP150.00338915FOLR20.007363289LILRA40.001154966GIMAP80.003448149SIT10.007527648FAM129C0.001176624TLR70.003548657PTPRQ0.007660058TLR100.001259283CHRNA50.003935483CR10.007844679PRKCB0.00164843RTN10.00428924CLEC4G0.008125148CD330.001702673SLAMF10.004442269IL160.008838459GPIHBP10.001924742INHA0.004857505DNASE2B0.009232354TESPA10.002231855P2RY120.00525026CD300C0.009829507RCSD10.002266693SPN0.005651753CD530.009881504

圖5 6個(gè)基因與OS的相關(guān)性

3 討論

TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘已廣泛應(yīng)用于癌癥預(yù)后的預(yù)測(cè)，最近的研究表明腫瘤微環(huán)境在肺腺癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。因此我們?cè)诒狙芯恐袕腡CGA數(shù)據(jù)庫中鑒定對(duì)肺腺癌預(yù)后有顯著影響的腫瘤微環(huán)境相關(guān)基因，這些基因與TME中的基質(zhì)和免疫成分有關(guān)。首先，通過ESTIMATE算法獲得了基質(zhì)和免疫評(píng)分，以確定它們是否與肺腺癌患者的臨床特征和總體生存率相關(guān)。結(jié)果表明免疫評(píng)分與臨床分期和總體生存率顯著相關(guān)，基質(zhì)評(píng)分高的患者總體生存率也延長(zhǎng)。在TME中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞由許多不同類型的細(xì)胞組成。一方面，成纖維細(xì)胞作為最豐富的基質(zhì)細(xì)胞，可以形成物理屏障，避免免疫識(shí)別和消除腫瘤細(xì)胞；另一方面，它們通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)并分泌相關(guān)的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子來促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[22-23]。本研究中基質(zhì)評(píng)分高的肺腺癌患者生存時(shí)間更長(zhǎng)，這是否意味著這些患者的抗腫瘤基質(zhì)細(xì)胞活性更高，但哪種類型的基質(zhì)細(xì)胞在這些患者的TME中起主要的抗腫瘤作用仍有待進(jìn)一步研究。

TME是免疫系統(tǒng)和腫瘤相互作用的地方，反映了腫瘤和免疫系統(tǒng)的可塑性。腫瘤的發(fā)展高度依賴于TME，而TME成分的任何改變都可能影響惡性腫瘤的演變[24]。了解這一變化可能有助于制定治療策略?；|(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞是TME的重要組成部分，在肺腺癌的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[25]。還有研究表明腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與眾多實(shí)體腫瘤患者的生存相關(guān)。CD8+T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)是肺腺癌的良好預(yù)后因素，在肺腺癌中CD8+T細(xì)胞可以特異性殺死腫瘤細(xì)胞[26]。CD8+T細(xì)胞和成熟樹突狀細(xì)胞在肺癌之間具有異質(zhì)性，并且與生存率密切相關(guān)，CD8+T細(xì)胞密度較大的患者5年生存率更高[27-28]。最近幾年對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的大量研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞和T細(xì)胞的高表達(dá)者在很多腫瘤也具有較高的總體生存率，如乳腺CD8+T細(xì)胞、腺癌B細(xì)胞、黑色素瘤LCK，其中也包括肺腺癌[29]。本研究結(jié)果也表明免疫評(píng)分與臨床分期和肺腺癌總體生存率顯著相關(guān)。然而，免疫浸潤(rùn)在肺腺癌中的確切預(yù)后相關(guān)性尚不清楚。

肺癌的癌變和進(jìn)展不僅取決于基因突變，還取決于TME的異質(zhì)性。肺癌微環(huán)境異質(zhì)性的動(dòng)態(tài)變化取決于免疫細(xì)胞、免疫介質(zhì)及其基因和蛋白譜。腫瘤微環(huán)境中的基因、蛋白質(zhì)或細(xì)胞之間存在大量通信，這是判別生物標(biāo)志物和靶標(biāo)的重要依據(jù)。在過去的幾十年中，廣泛的基因組研究確定了LADC中的幾種高頻率遺傳改變，例如EGFR、KRAS突變和ALK重排，這可能與LADC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，并開發(fā)出了EGFR靶向藥物如吉非替尼為代表的酪氨酸激酶抑制劑[4]?？梢愿鶕?jù)TME的異質(zhì)性開發(fā)靶向療法，未來的治療策略可通過直接消除、恢復(fù)、糾正或修復(fù)突變基因來糾正TME的異質(zhì)性[30]，從而影響癌癥的預(yù)后。

最后通過比較基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的高分組和低分組來篩選差異表達(dá)基因繪制熱圖。免疫評(píng)分高分組有611個(gè)基因上調(diào)，有164個(gè)基因下調(diào)；同樣在基質(zhì)評(píng)分基礎(chǔ)上，高分組有683個(gè)基因上調(diào)，120個(gè)基因下調(diào)。繪制韋恩圖篩選出免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分都上調(diào)和都下調(diào)的差異表達(dá)基因。隨后將這些差異表達(dá)基因行GO功能富集分析、KEGG和PPI網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果表明其中大多數(shù)基因與肺腺癌免疫細(xì)胞增殖和激活、免疫反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)和膜的細(xì)胞成分相關(guān)。構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)以更好地了解DEGs的相互作用，結(jié)果表明它們都與細(xì)胞因子受體相互作用通路、趨化因子信號(hào)通路、造血細(xì)胞、免疫反應(yīng)等密切相關(guān)。最后，進(jìn)行生存分析以探討367個(gè)差異表達(dá)基因的潛在預(yù)后價(jià)值，鑒定了124個(gè)肺腺癌微環(huán)境相關(guān)基因，其中GAPT、TMEM273、CLEC17A、CLEC10A、STAP1、RUBCNL這六個(gè)基因在肺腺癌病例中的基因表達(dá)與不良預(yù)后之間顯示出顯著的相關(guān)性(P<0.001)。這表明我們基于 ESTIMATE算法的大數(shù)據(jù)分析肺腺癌微環(huán)境相關(guān)基因在TCGA數(shù)據(jù)庫的肺腺癌隊(duì)列中具有預(yù)后價(jià)值。

綜上所述，本文用LADC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出6個(gè)TME相關(guān)DEGs與肺腺癌的預(yù)后不良顯著相關(guān)。進(jìn)一步研究這些TME相關(guān)基因可為TME與LADC預(yù)后之間的潛在關(guān)系提供新的認(rèn)識(shí)，這些基因也可能會(huì)啟發(fā)研究人員發(fā)現(xiàn)新的治療肺腺癌的靶點(diǎn)及方法。