程文靜，鄭衍芳，鄭 晨，劉 波，王明曉

(遵義醫(yī)科大學 珠海校區(qū)生理學教研室，廣東 珠海 519000)

高血壓是一種常見的、對人類健康有嚴重影響的慢性疾病，是引發(fā)心腦血管疾病的主要危險因素之一[1]。高血壓發(fā)病的病因有很多，包括日常生活飲食習慣的影響。目前民眾普遍認知的是高鈉飲食可導致血壓升高，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)鉀飲食在調節(jié)血壓中的作用與鈉飲食同等重要[2]。

大量研究已經(jīng)指出鉀飲食與血壓水平存在負相關，缺鉀可致高血壓，補鉀能降低血壓[3]。腎臟在血壓的長期調節(jié)中起決定性作用，有人認為高血壓的發(fā)生是由腎臟對鈉的處理紊亂引起[4]。高鉀飲食可直接抑制腎鈉的重吸收，增加尿鈉的排泄，降低血壓。利用動物模型數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)近端腎單位(主要指近端小管)在高鉀飲食增加尿鈉排泄中起決定性作用[5]，但Terker等[6]在研究高鈉/低鉀對鈉-氯同向轉運體(Sodium chloride cotransporter，NCC)基因敲除小鼠血壓的影響中發(fā)現(xiàn)，高鈉/低鉀飲食使野生型小鼠血壓升高，但NCC基因敲除小鼠的血壓并未出現(xiàn)增高，說明遠端腎單位尤其遠曲小管(Distal convoluted tubule，DCT)部位是高鉀調節(jié)血壓的關鍵部位。NCC是負責腎臟DCT部位主動重吸收NaCl的關鍵轉運體。有報道指出高鉀可引起DCT細胞內氯離子濃度升高，抑制無賴氨酸激酶4(With no lysine kinase 4，WNK4)-STE20相關脯氨酸/丙氨酸豐富激酶(Ste20-related proline /alanine-rich kinase，SPAK)途徑，SPAK表達的降低造成NCC活性下降[6]。我們前期研究還發(fā)現(xiàn)高鉀可通過抑制DCT管周膜內向整流性鉀通道4.1(Inwardly rectifying potassium，Kir 4.1)的活性下調NCC的表達[7]。而NCC的表達改變直接影響機體血壓和尿鈉排泄平衡穩(wěn)定狀態(tài)[8]。但以上結果的得出都是針對正常小鼠或細胞進行的實驗，未測定機體血壓的變化，難以確定高鉀在調控高血壓過程中的作用，高鉀飲食對高血壓大鼠血壓的調控作用的研究并不透徹。本實驗直接通過觀察自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rat,SHR)經(jīng)過高鉀飲食干預后，機體血壓、尿液Na+、K+水平、腎臟組織Kir 4.1、WNK4、SPAK、NCC蛋白表達的變化，探討高鉀飲食對SHR血壓的調節(jié)作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 兔抗NCC多克隆抗體(SPC-402)來至stressMarq公司；兔抗pNCC多克隆抗體(ab254039)、兔抗Kir 4.1多克隆抗體(ab240872)為Abcam公司產品；兔抗WNK4多克隆抗體(NB600-284)購于NOVUS公司；兔抗β-Actin多克隆抗體(4970)、兔抗SPAK多克隆抗體(2281)購于CST公司；抗兔IgG-HRP來自Boster公司。

1.2 動物與分組 4月齡體重約200 g，SPF級雄性SHR、對照組(Wistar kyoto,WKY)大鼠各14只購于北京維通利華實驗動物中心[許可證號為SCXK(京)2016-0006]。實驗將SHR和WKY大鼠隨機分為正常飲食組(含1% 氯化鉀)(Normal diet,NK)和高鉀組(含5%的氯化鉀)(High potassium,HK)，共4組，每組7只大鼠，自由進食、攝水7 d(參考高鉀對正常小鼠的實驗時間[7])。

1.3 方法

1.3.1 大鼠血壓測量 尾套法間接測量大鼠尾動脈收縮壓，采用無創(chuàng)動物血壓測試儀分別于高鉀飲食前及飲食后1、3、5、7 d測量SHR和WKY大鼠尾動脈收縮壓。

1.3.2 蛋白免疫印跡法檢測腎臟NCC、WNK4、SPAK、Kir 4.1蛋白表達 5%水合氯醛麻藥過量處死大鼠，提取各組大鼠腎皮質蛋白，BCA法測定蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳，后蛋白轉移至PVDF膜上。5%BSA室溫下封閉1 h，分別加入兔抗NCC、pNCC、SPAK、Kir 4.1多克隆抗體稀釋比例(1∶1 000)，兔抗WNK4多克隆抗體稀釋比例(1∶500)，兔抗β-Actin多克隆抗體稀釋比例(1∶1 000)，4℃封閉過夜。PBS洗膜，加入抗兔IgG-HRP(1∶5 000)，室溫孵育1 h。在全自動凝膠成像儀中曝光、顯影，以目的條帶灰度值與內參(β-Actin)條帶平均灰度值的比值統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

1.3.3 大鼠尿鈉、尿鉀濃度測定 收集每組大鼠高鉀飲食前和高鉀飲食后第7天的尿液，用水平離心機取上清，采用全自動生化分析儀檢測尿液的鈉、鉀離子濃度。

2 結果

2.1 高鉀飲食后SHR尾動脈收縮壓的變化 如圖1所示高鉀飲食前SHR尾動脈收縮壓(175.75±4.55 mmHg)明顯高于WKY組(127.23±3.46 mmHg)(P<0.05)，高鉀飲食第5天SHR尾動脈收縮壓開始下降(P<0.05)。高鉀飲食對WKY大鼠血壓無明顯影響(P>0.05)。

#:與WKY組相比，P<0.05；*:與高鉀飲食前SHR相比，P<0.05，n=7。圖1 高鉀飲食對SHR尾動脈收縮壓的影響

2.2 高鉀飲食對SHR腎臟NCC蛋白表達及磷酸化水平的影響 高鉀飲食前SHR腎臟組織NCC蛋白表達及磷酸化水平明顯強于WKY組(P<0.05)，說明SHR血壓的升高與NCC的表達增強有關。高鉀飲食(7 d)后，兩組大鼠NCC的蛋白表達及磷酸化水平均下降(P<0.05，見圖2)。

NK:正常飲食；HK:高鉀飲食；*:P<0.05，n=3。圖2 高鉀飲食對SHR腎臟NCC蛋白表達及磷酸化水平的影響

2.3 高鉀飲食對SHR腎臟WNK4、SPAK蛋白表達的影響 與WKY大鼠相比，SHR腎臟組織WNK4、SPAK蛋白表達明顯增強(P<0.05)。高鉀飲食可顯著降低SHR的WNK4、SPAK蛋白表達(P<0.05，見圖3)。

NK:正常飲食；HK:高鉀飲食；*:P<0.05，n=3。圖3 高鉀飲食對SHR腎臟WNK4、SPAK蛋白表達的影響

2.4 高鉀飲食對SHR腎臟Kir 4.1蛋白表達的影響 與WKY大鼠相比，SHR腎臟Kir 4.1蛋白水平表達明顯增強(P<0.05)；高鉀飲食可顯著降低SHR的Kir 4.1蛋白水平表達(P<0.05，見圖4)。

2.5 高鉀飲食對SHR尿鈉、尿鉀排泄的影響 如圖5所示，高鉀飲食后SHR尿鈉排泄明顯增加(P<0.05)，而WKY組尿鈉排泄沒有明顯變化(P>0.05)，說明高鉀飲食能夠增加SHR尿鈉排泄。同時，高鉀飲食使SHR及WKY大鼠尿鉀排泄均顯著增加(P<0.05)。

NK:正常飲食；HK:高鉀飲食；*:P<0.05，n=3。圖4 高鉀飲食對SHR腎臟Kir 4.1蛋白表達的影響

NK:正常飲食；HK:高鉀飲食；*:P<0.05，n=7。圖5 高鉀飲食對SHR尿鈉、尿鉀排泄的影響

3 討論

人類高血壓分原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類型，其中原發(fā)性高血壓患者占90%以上[9]。引起高血壓的發(fā)病的病因有很多，NaCl代謝紊亂是引發(fā)高血壓發(fā)病的因素之一。早有報道指出原發(fā)性高血壓病常伴有鈉排泄障礙，高血壓病患者血漿內鈉含量較血壓正常者升高，高血壓模型動物腎動脈或內臟組織血管壁內鈉含量增高并在一定條件下存在腎排鈉功能的改變[10]。

高鉀飲食具有明顯的利尿作用，鉀鹽在促進大量水的排泄同時增加了NaCl的排泄，研究發(fā)現(xiàn)當腎小管周圍鉀濃度增加0.1倍時，尿鈉含量將增加2.3倍[11]。Mente等[3]指出鉀的攝入與血壓呈負相關，對于高血壓患者鉀的攝入水平越高，血壓水平將降低。有研究指出高鉀可通過抑制腎臟對NaCl的重吸收，增加尿鈉排泄，降低血壓。目前對于原發(fā)性高血壓病人的診治，鉀補給可作為其輔助治療手段[12]。

腎臟是人體最重要的排泄器官，在維持血壓及電解質平衡方面發(fā)揮著重要作用。腎臟調節(jié)血壓的機制主要與腎鈉重吸收量改變有關。腎臟對NaCl的重吸收主要通過腎小管上皮細胞細胞膜上的轉運體而進行，如髓袢升支粗段(Thick ascending limb,TAL)的鈉-鉀-氯同向轉運體(Na+-K+-2Cl-cotransporter， NKCC2)、DCT部位的NCC、遠曲小管后端及集合管部位的上皮細胞鈉通道(Epithelial sodium channel，ENaC)等。雖然遠端腎單位(遠端小管和集合管)重吸收NaCl的量所占比例非常小(僅10%左右)，但卻是臨床多種利尿/降壓藥作用的關鍵部位，高血壓發(fā)病機制也主要與這些部位轉運體活性異常有關[6]。針對高鉀抑制NaCl重吸收的機制，近年來研究者們開始關注DCT上皮細胞管腔膜NCC的功能變化。DCT 長度僅有5 mm，不僅是腎單位中最短的部位，而且是致密斑存在的部位，可直接感受小管液中NaCl含量的變化，并通過管球反饋等方式調節(jié)機體水鹽代謝的平衡。在DCT，小管液中的Na+與Cl-被管腔膜NCC轉運至細胞內，隨后在管周膜鈉泵及Cl-通道的作用下進入到組織液被重吸收。利用NCC敲除小鼠對鉀飲食、NCC與血壓的關系進行了研究，發(fā)現(xiàn)低鉀飲食使野生型小鼠血壓升高，但敲除NCC基因的小鼠血壓并未出現(xiàn)明顯增高，說明高血壓的發(fā)生與NCC功能密切相關[6]。DCT上皮細胞細胞膜除含有直接影響NaCl重吸收的NCC外，還存在間接影響NaCl重吸收的Kir 4.1。Kir 4.1是由兩個 KCNJ10及兩個 KCNJ16通道蛋白組成的異四聚體，研究發(fā)現(xiàn)敲除 KCNJ10 將導致Kir 4.1消失，而 KCNJ16 的敲除并未造成這種結果，因此這個通道也被稱為 Kir 4.1或 KCNJ10[13]。研究全身性 KCNJ10 敲除小鼠發(fā)現(xiàn)，KCNJ10 的缺失將降低 NCC 的表達及磷酸化[14]。最近我們研究發(fā)現(xiàn)，高鉀飲食能夠抑制C57BL/6J小鼠腎臟NCC的活性，而這種抑制作用在腎臟特異性KCNJ10敲除小鼠上消失，說明Kir 4.1的功能正常是高鉀飲食調節(jié)NCC活性的必要條件[7]。更有研究提出，細胞外鉀離子可通過影響細胞膜電位(大量的鉀離子進入細胞引起細胞靜息電位增高)，造成細胞內氯離子外流增加，胞內氯離子的濃度降低進而激活對氯濃度敏感的WNK4-SPAK信號途徑(高濃度抑制，低濃度激活)而后影響NCC的功能[6]，而Kir 4.1是鉀離子進入DCT細胞的唯一途徑，這提示Kir 4.1對WNK4-SPAK途徑也有調節(jié)作用。

WNK4在腎臟中高度表達，并且主要表達在DCT和集合管胞漿和細胞連接中[15-16]。有研究對原發(fā)性高血壓患者及健康者的WNK4基因進行分析，結果發(fā)現(xiàn)WNK4基因第七外顯子G1662A的1個cSNP，且其等位基因頻率在原發(fā)性高血壓組與健康組中存在顯著性差異，提示W(wǎng)NK4基因與原發(fā)性高血壓密切相關[17]。利用WNK4基因敲除小鼠，Takahashi等[18]證實WNK4是調節(jié)NCC的主要蛋白激酶；Wilson等[19]也發(fā)現(xiàn)WNK4缺失能夠降低腎小管上皮細胞膜70%的NCC表達量。WNK4調節(jié)NCC的表達機制涉及多個方面，包括提高醛固酮[20]、血管緊張素II[21]、抗利尿激素水平[22]，增加細胞外信號調節(jié)激酶(ex-tracellutarsignal-regulated kinase,ERK)1/2的磷酸化等抑制NCC的表達[23]。目前更多的研究指出WNK4可激活SPAK，繼而磷酸化NCC，導致高血壓[24]。對于WNK4表達與鉀飲食改變之間的關系，在最新的一篇有關鉀調節(jié)血壓機制的綜述中已提出WNK4-SPAK-NCC途徑可能在鉀調節(jié)血壓中發(fā)揮著重要作用[2]。

結合上述文獻所述，高鉀可能通過下調WNK4-SPAK信號途徑抑制腎臟DCT部位NCC的活性，減少NaCl的重吸收，降低血壓，而且Kir 4.1可能在WNK4的上游。但這些研究都是針對血壓正常的小鼠進行的實驗，對于高血壓大鼠的調控是否有同樣的變化并未見報道。本研究選用與人類原發(fā)性高血壓形成機制比較相似的SHR作為我們的研究對象，對其進行一周的高鉀飲食飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)高鉀飲食前SHR血壓、腎臟Kir 4.1、WNK4、SPAK、NCC、pNCC蛋白表達明顯高于WKY大鼠，說明SHR高血壓的發(fā)生與上述指標的增強有關，高鉀飲食后上述指標顯著降低。說明Kir 4.1-WNK4-SPAK-NCC途徑可能參與高鉀對SHR血壓的調控。但本研究并沒有對該途徑的上下游關系仔細研究，僅提出這種可能性機制，需更多實驗來驗證。此外，高鉀飲食通過降低NCC活性使DCT對NaCl的重吸收減少，更多的NaCl流至DCT的下端，這可能使下端負責NaCl重吸收的ENaC活性增強，而在這些部位ENaC與腎臟外髓鉀通道 (renal outer medullary potassium channel，ROMK)的功能相連[25]，當鈉離子通過ENaC進入到細胞內被重吸收時，鉀離子通過ROMK被排泄至管腔內，這說明高鉀飲食在調節(jié)血壓的同時，還可能涉及尿鈉、尿鉀水平的改變。本研究測定了高鉀飲食前后SHR尿鈉、尿鉀濃度變化，發(fā)現(xiàn)高鉀飲食能明顯增加SHR的尿鈉、尿鉀的排泄。對此，我們認為高鉀飲食對SHR的降壓作用與NCC活性降低有關，NCC的活性降低引起下游ENaC活性的增加，但因下游ENaC活性增強而導致的NaCl重吸收增加的量可能并不能彌補上游NCC活性降低所引起NaCl重吸收的減少量，整體表現(xiàn)為尿鈉增加，血壓下降，而高鉀飲食對WKY大鼠血壓的維持作用可能與上游NCC和下游ENaC對NaCl的重吸收達到平衡相關。

原發(fā)性高血壓患者血壓升高的確切病因不清楚，而且大多數(shù)原發(fā)性高血壓見于中老年，起病隱匿，進展緩慢，初期很少有癥狀，多數(shù)患者因體檢或因其他疾病就醫(yī)時才發(fā)現(xiàn)血壓增高，這些原因增加了原發(fā)性高血壓的治療難度[26]。通過本次實驗結果我們得出高鉀飲食能夠降低SHR血壓，而且Kir 4.1-WNK4-SPAK-NCC途徑可能參與高鉀對SHR血壓的調節(jié)。本研究結果為原發(fā)性高血壓患者進行飲食治療提供了更有力的證據(jù)，而且為探討原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制也提供了一定的理論依據(jù)，但我們在實驗中同時發(fā)現(xiàn)長時間的高鉀飲食會引起大鼠機能降低以及壽命縮短的情況，對此針對具體高鉀飲食濃度的設定及使用時間等問題仍需要進一步地探討。