趙 林，梁貴友

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心血管外科，貴州 遵義 563099；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025)

體外循環(huán) (Cardio-pulmonary bypass，CPB) 是臨床上心臟外科心內(nèi)直視手術(shù)必需的技術(shù)手段，心肌缺血再灌注損傷 (Myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI) 是CPB后發(fā)生嚴(yán)重心功能障礙甚至死亡的主要因素之一，其主要表現(xiàn)為再灌注后心肌舒縮功能障礙、心律失常及因心功能障礙而引起的各種并發(fā)癥。當(dāng)缺血心肌恢復(fù)灌注時(shí)，稱為再灌注，該過程中發(fā)生的心肌損傷，這種現(xiàn)象稱MIRI[1]。其發(fā)生機(jī)制目前主要有心肌細(xì)胞凋亡、鈣超載、心肌胰島素抵抗、氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)損傷等[2-7]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷提高，CPB術(shù)后心肌的保護(hù)措施不斷完善，術(shù)后的并發(fā)癥逐漸降低，但病死率仍然未達(dá)到臨床所期，臨床防治MIRI的效果仍需進(jìn)一步提高。

APPL1 (Adaptor protein containing PH domain，PTB domain and Leucine zipper motif1) 是與脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)直接結(jié)合且重要的銜接蛋白，也是脂聯(lián)素、脂聯(lián)素信號(hào)傳導(dǎo)通路中下游重要的傳導(dǎo)介質(zhì)， 脂聯(lián)素誘導(dǎo)的AMPK途徑必需將銜接蛋白APPL1與AdipoR1相結(jié)合后激活各種組織[8]。APPL1可以抑制心肌細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)心肌的糖脂等能量代謝、增加胰島素敏感性、減輕胰島素抵抗的作用，而在心肌中發(fā)揮的這些作用可減輕MIRI[9-12]。因此，深入研究APPL1在缺血再灌注后心肌損傷中的保護(hù)作用顯得尤為重要，APPL1或?qū)⒊蔀镸IRI預(yù)防及治療的重要靶點(diǎn)?，F(xiàn)就目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)APPL1在MIRI的作用及其機(jī)制作一綜述。

1 APPL1的結(jié)構(gòu)、分布及其生物活性特點(diǎn)

APPL1是Mitsuuchi在1999年發(fā)現(xiàn)的一種胞內(nèi)結(jié)合蛋白，其人體的APPL1基因位于染色體3p14.3-21.1區(qū)，編碼長(zhǎng)度為709個(gè)氨基酸，APPL1有3個(gè)主要的功能區(qū)：Bar(Bin1 /amphiphysin/Rvs)結(jié)構(gòu)域，Ptb(Phospho-tyrosine binding)結(jié)構(gòu)域及Ph(Pleckstrin homology)結(jié)構(gòu)域(見圖1)[13]。它們主要參與轉(zhuǎn)錄抑制、凋亡以及分泌囊泡的融合、增強(qiáng)與GTP酶的結(jié)合、將蛋白錨定至特定的膜部位、銜接或支架的作用(見表1)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，APPL1的表達(dá)在心肌、腦、肝、骨骼肌、脂肪、腎臟等多種組織中都能檢測(cè)得到[14-15]。

圖1APPL1的結(jié)構(gòu)

表1 APPL1的結(jié)構(gòu)域及其作用

結(jié)構(gòu)域主要作用BAR結(jié)構(gòu)域感知和生成膜曲率、轉(zhuǎn)錄抑制、凋亡以及分泌囊泡的融合[15]PTB結(jié)構(gòu)域在信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白質(zhì)結(jié)合過程中,發(fā)揮銜接或支架作用與AdipoR1/2結(jié)合,調(diào)節(jié)脂聯(lián)素代謝[16]PH結(jié)構(gòu)域與小GTP酶結(jié)合,在細(xì)胞內(nèi)吞過程發(fā)揮作用[17]與BAR結(jié)構(gòu)域相互作用,將蛋白錨定至特定的膜部位介導(dǎo)Reptin的核質(zhì)穿梭,參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展[18]

2 APPL1通過抑制心肌細(xì)胞凋亡減輕MIRI

心血管外科體外循環(huán)術(shù)后MIRI過程中出現(xiàn)的心肌細(xì)胞凋亡也是加重MIRI的重要因素之一。ROS是誘發(fā)凋亡并引起缺血再灌注損傷的重要因素。MIRI主要通過三條途徑產(chǎn)生氧自由基：黃嘌呤氧化酶途徑、花生四烯酸代謝途徑和線粒體呼吸鏈途徑[19]，線粒體是MIRI中ROS 產(chǎn)生的主要場(chǎng)所[20]。ROS的大量堆積導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，膜蛋白和酶的功能及活性也受損，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。李波等[21]研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖(LPS)處理心肌細(xì)胞后，APPL1信使RNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著降低、心肌細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率增加、細(xì)胞調(diào)亡蛋白酶-3蛋白水平升高；而 APPL1過表達(dá)的心肌細(xì)胞活力增高、細(xì)胞凋亡減少，且氧化損傷較輕、抗氧化酶能力強(qiáng)且ROS水平低，因此，APPL1 可以降低心肌細(xì)胞的氧化損傷，減少細(xì)胞凋亡，從而減輕MIRI。

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中需要構(gòu)建人體心肌細(xì)胞缺血再灌注的基本模型，目前主要是由H9C2細(xì)胞通過缺氧后再?gòu)?fù)氧(Hypoxia-reoxygenation，HR)來實(shí)現(xiàn)[22]。正是利用這種模型，Park等發(fā)現(xiàn)APPL1發(fā)揮著抗細(xì)胞凋亡的作用，尤其是通過球狀脂聯(lián)素(Globular Adiponectin，gAcrp)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：在由HR引起的細(xì)胞內(nèi)ROS中，抑制脂聯(lián)素受體(AdipoR1)的表達(dá)后，APPL1與AdipoR1的結(jié)合率降低，顯著抑制了APN(Adiponectin，脂聯(lián)素)預(yù)防HR誘導(dǎo)ROS生成的能力；gAcrp通過AdipoR1/APPL1信號(hào)傳導(dǎo)阻止細(xì)胞凋亡途徑并增加抗氧化能力； gAcrp可阻止缺氧/再氧合誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡蛋白酶-3的活化，而沉默APPL1基因后gAcrp的上述表現(xiàn)發(fā)生顯著減弱[23]。更有幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明了APN可以明顯地減輕MIRI以及慢性冠脈綜合征所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[24-28]。孫冬冬等[12]研究發(fā)現(xiàn)，APN可上調(diào)APPL1的表達(dá)，在心肌缺血再灌注損傷過程中起到抗凋亡的作用，并促進(jìn)心肌細(xì)胞存活。由此可見，APPL1可通過APN抗心肌細(xì)胞凋亡在MIRI中發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的重要作用。

3 APPL1通過改善心臟微血管內(nèi)皮功能障礙減輕MIRI

心臟微血管的內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成心肌微循環(huán)的最基本的結(jié)構(gòu)，它不僅可以分泌內(nèi)皮素，調(diào)節(jié)微血管直徑以控制組織循環(huán)流量，而且還可通過旁分泌和自分泌功能，調(diào)節(jié)心肌的生長(zhǎng)發(fā)育、組織代謝、收縮功能以及節(jié)律控制，當(dāng)發(fā)生心肌缺血再灌注損傷時(shí)，還可分泌NO，保護(hù)心肌細(xì)胞[29]；不僅如此，內(nèi)皮細(xì)胞還表達(dá)AdipoR1，與脂聯(lián)素直接結(jié)合，對(duì)胰島素抵抗作用產(chǎn)生重要影響[30]。內(nèi)皮素及NO主要由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，內(nèi)皮素的主要作用是收縮血管，而NO的主要作用是舒張血管，生理狀態(tài)下，二者處于動(dòng)態(tài)平衡，共同維持正常的內(nèi)皮細(xì)胞功能[31]。血管內(nèi)皮功能障礙表現(xiàn)為NO分泌減少，內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損。血管通透性異常，血小板聚集，局部炎癥反應(yīng)，平滑肌增生及動(dòng)脈粥樣硬化等[32]。在體外循環(huán)心臟術(shù)后，發(fā)生的高血糖、高血脂刺激血管內(nèi)皮時(shí)，NO釋放減少或破壞增加而導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，從而打破血管平衡穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致一系列的心血管事件的發(fā)生，如心肌缺血再灌注損傷[31]。當(dāng)心臟血流恢復(fù)時(shí)，在心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注損傷前，心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞就已經(jīng)受到了再灌注的損傷，也就是說，MIRI發(fā)生的第一步是心臟微血管內(nèi)皮的損傷及功能障礙[33]。缺血和損傷的細(xì)胞釋放大量的促炎介質(zhì)，如白細(xì)胞介素、TNF-α等，使冠脈內(nèi)皮細(xì)胞激活，激活的冠脈內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)大量炎性黏附分子，介導(dǎo)白細(xì)胞的粘附反應(yīng)和血小板的活化，從而加重心肌微循環(huán)障礙[34]。

心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)AdipoR1，AdipoR1通過與脂聯(lián)素結(jié)合后發(fā)揮作用[35]，脂聯(lián)素對(duì)血管內(nèi)皮的急性功能障礙與慢性結(jié)構(gòu)損傷均有保護(hù)作用[36]。而離體實(shí)驗(yàn)表明，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，脂聯(lián)素可抑制由高糖、高脂所誘發(fā)的炎癥效應(yīng)，逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮的慢性結(jié)構(gòu)損傷[35,37]。上述提及，AdipoR1作為APPL1上游的直接結(jié)合物，在體外循環(huán)心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，且內(nèi)皮功能障礙也是導(dǎo)致MIRI的重要原因，雖然目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道APPL1與內(nèi)皮功能障礙之間的直接關(guān)系，但我們可以推測(cè)，APPL1很可能通過改善心臟微血管內(nèi)皮功能障礙，從而減輕MIRI。

4 APPL1通過調(diào)節(jié)糖、脂代謝減輕MIRI

脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)是一種改善胰島素敏感性的增敏劑，其受體主要包括脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)、脂聯(lián)素受體2(AdipoR2)及T-鈣粘蛋白(T-Cadherin)，在心肌細(xì)胞中AdipoR1是APN的主要受體，APPL1是AdipoR1的關(guān)鍵結(jié)合蛋白[38]。位于APPL1功能區(qū)的PTB 結(jié)構(gòu)域可與AdipoR1的胞內(nèi)段直接結(jié)合[39]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，AdipoR1與APPL1相互作用，可介導(dǎo)APN 在多種細(xì)胞內(nèi)的多條信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(見圖2)[38-41]。

圖2 APPL1與AdipoR1及APN的關(guān)系

APN的降糖作用是通過抑制糖異生來發(fā)揮效應(yīng)，具體包括以下幾點(diǎn)：促進(jìn)葡萄糖和脂肪酸的消耗、增加乳酸的生成和乙酰輔酶A羧化酶的磷酸化[42]。AdipoR1和APN結(jié)合后調(diào)節(jié)糖代謝，而過氧化物酶增殖物激活受體α(PPAR-α)和AMP活化后的蛋白激酶(AMPK)在這個(gè)過程發(fā)揮了重要的作用；AMPK是一種蛋白激酶，在能量代謝中如同傳感器，高度依賴AMP發(fā)揮作用[43]。AMPK參與了β氧化及葡萄糖的攝取過程，通過影響APN受體下游的信號(hào)通路，也可導(dǎo)致胰島素抵抗[44]。在心肌組織中，APN可通過降低甘油三酯的水平、消耗葡萄糖、脂肪酸和ATP來改善胰島素的敏感性[9]。在PPAR-α信號(hào)通路中，APN上調(diào)下游蛋白乙酰輔酶A氧化酶和CD36的表達(dá)，加快了脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，并調(diào)節(jié)糖代謝，進(jìn)而減輕了胰島素抵抗[10]。

本課題組研究也發(fā)現(xiàn)，CPB后心肌損傷嚴(yán)重及心臟舒縮功能發(fā)生障礙，但通過補(bǔ)充APN后，AMPK的表達(dá)及磷酸化增加，心肌葡萄糖攝取率增加，心肌細(xì)胞損傷減輕；相反，特異性的抑制了AMPK的活性，APN的上述功能也受到了抑制[11]。因此，我們認(rèn)為APPL1可通過APN增加AMPK活性的作用，增加心肌胰島素敏感性并減輕胰島素抵抗，進(jìn)一步促進(jìn)心肌對(duì)葡萄糖的攝取，從而減輕MIRI。具體的機(jī)制作用仍需進(jìn)一步探索。

5 展望

越來越多的證據(jù)表明APPL1對(duì)心肌具有保護(hù)作用，當(dāng)體外循環(huán)術(shù)后，刺激內(nèi)源性APPL1的表達(dá)可能成為減輕MIRI的預(yù)防及靶向治療方向。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了APPL1在MIRI中通過發(fā)揮抗凋亡作用保護(hù)心肌細(xì)胞[24,26]；而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，APPL1的表達(dá)受到抑制后，APN減輕心肌缺血/再灌注損傷的作用顯著減弱，主要體現(xiàn)在心肌梗死面積的擴(kuò)大及左心室射血分?jǐn)?shù)的降低[45]。此外，APPL1在脂肪組織中還可以通過與HDAC3相互作用，緩解胰島素抵抗[46]，但其與HDAC3在心肌中的胰島素抵抗作用尚無(wú)相關(guān)研究。APPL1 在心力衰竭和糖尿病心肌病損傷中也發(fā)揮著重要的心肌保護(hù)作用[47-49]。但APPL1在人體心肌細(xì)胞中的作用，仍然有很多問題需要解決，主要有以下幾個(gè)方面：① APPL1通過何種方式參與APN對(duì)AMPK的活化過程，怎樣識(shí)別AdipoR1等機(jī)制并不清楚； ② 無(wú)論APPL1是在心肌能量代謝、胰島素抵抗的作用，還是在抗心肌細(xì)胞凋亡中的作用，皆因其通過APN而發(fā)揮作用，是否APPL1還有其它途徑來改善MIRI，目前國(guó)內(nèi)外研究甚少；③ APPL1在MIRI中的作用及其機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外的研究仍然停留在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，APPL1在人體內(nèi)心肌缺血再灌注損傷中的表達(dá)及其作用并無(wú)相關(guān)研究。可見，想要更加細(xì)致的了解APPL1在人體心臟中的生物作用及其機(jī)制，并將其轉(zhuǎn)化為預(yù)防及治療MIRI的靶點(diǎn)，還有很長(zhǎng)的路要走。隨著在細(xì)胞、動(dòng)物及人體中的研究不斷的深入，APPL1或?qū)⒊蔀榉乐蜯IRI潛在的藥物作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為心血管外科CPB術(shù)后并發(fā)癥的臨床治療提供新的思路。