楊 茜，文慶蓮

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 腫瘤科，四川 瀘州 646000)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在所有惡性腫瘤中排名第三[1]。 2017年，結(jié)腸癌發(fā)病人數(shù)達180萬例，十年內(nèi)其發(fā)病率增加了38%，其中89.6萬人死亡[2]。結(jié)腸癌目前治療方式是以手術(shù)和化療為主，然而，仍有約50%的結(jié)腸癌患者出現(xiàn)了遠處轉(zhuǎn)移[3-4]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是常用的消化道腫瘤的化療藥物，通過阻斷脫氧核糖尿苷酸受細胞內(nèi)胸苷酸合成酶轉(zhuǎn)化為胸苷酸，而干擾 DNA 的合成。但由于腫瘤細胞易耐藥或個體差異等原因部分患者治療效果欠佳[5]，因此，需要不斷尋找更好的臨床療法來治療結(jié)腸癌。

安羅替尼是我國自主研發(fā)的一種新型、口服的小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑，能夠有效抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)、血小板衍生生長因子受體(Platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)、 纖維母細胞生長因子受體 (Fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR)、干細胞因子受體(c-Kit)等激酶，相比于其他酪氨酸激酶抑制劑能抑制更多的靶點，且具有抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤生長的作用[6-7]，并在多種實體瘤(包括非小細胞肺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺髓樣癌和軟組織肉瘤)中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性[8-11]。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-940通過靶向MACC1(結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)移基因-1)的mRNA抑制結(jié)直腸細胞的增殖和侵襲，增強安羅替尼對結(jié)直腸癌的抗腫瘤作用，表明安羅替尼對于結(jié)腸癌的治療是一個有效的藥物，然而安羅替尼聯(lián)合化療或者其他治療是否能增強對結(jié)腸癌的抗腫瘤效應，尚未有定論。本文旨在探討安羅替尼聯(lián)合5-氟尿嘧啶對結(jié)腸癌的抗腫瘤作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 安羅替尼由中國正大天晴醫(yī)藥有限公司提供，氟尿嘧啶注射液購自天津金耀集團有限公司； DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自于美國 HyClone 公司；MTT 、結(jié)晶紫購自于上海碧云天生物科技有限公司； Transwell 小室，直徑為 6.5 mm，孔徑為 8 μm ，購自于美國 Corning 公司；基質(zhì)膠購自于美國 BD 公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國 BD Biosciences 公司；鼠抗人 Ki-67 和 CD31 抗體購自美國 Bio-World 公司；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)，流式細胞儀(BD / FACSVerse，美國)， 酶標儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)及動物 結(jié)腸癌CT26細胞株由西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤科實驗室提供，將 CT26 細胞用含 10% 的胎牛血清的 DMEM 完全培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。48只 BALB/c-nu (SPF級) 小鼠購自于成都達碩動物實驗中心(生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2015-030；使用許可證：SYXK(川)2018-065)， 4 ～ 6 周齡，雌性，體重 18 ～ 20 g，飼養(yǎng)于無特定病原體條件。

1.3 MTT 細胞增殖實驗 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為 5×104個/mL，接種到 96 孔板(5 000細胞每孔)并于37℃孵箱培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入不同濃度的安羅替尼(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L)、不同濃度 5-FU(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL)、 NS 、安羅替尼(4 μmol/L)、 5-FU (5 μg/mL)以及聯(lián)合組(安羅替尼 4 μmol/L+ 5-FU 5 μg/mL)作用 24 h 后，每孔加入 20 μL MTT， 37 ℃ 孵育 4 h，然后加入 150 μL DMSO，用酶標儀 490 nm 波長處測定吸光度并計算細胞抑制率：細胞活性率=實驗組 OD 值/對照組 OD 值× 100 %。

1.4 Transwell 細胞侵襲轉(zhuǎn)移實驗 制備細胞懸液前撤血清饑餓細胞 12 h ，在 Transwell 小室內(nèi)加入基質(zhì)膠，等待凝固后取 CT26 細胞懸液(濃度為 5×105個/mL) 100 μL加入Transwell小室，下室加600 μL含20%血清的培養(yǎng)基，Transwell小室用含有安羅替尼(4 μmol/L)、5-FU (5 μg/mL)以及聯(lián)合組(安羅替尼4 μmol/L+5-FU 5 μg/mL)的無血清培養(yǎng)基作用 24 h。取出小室， PBS洗2遍，用甲醛固定30 min，倒置風干，加入結(jié)晶紫染色15 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用 PBS 清洗 3 遍，在 400 倍倒置顯微鏡下隨機 5 個視野觀察細胞并計數(shù)。

1.5 流式細胞凋亡實驗 將 CT26 細胞制備成 5×105/mL的細胞懸液接種于6孔板，過夜后加入含有安羅替尼(4 μmol/L)、 5-FU(5 μg/mL)以及聯(lián)合組(安羅替尼4 μmol/L+5-FU 5 μg/mL)的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h。消化、離心細胞后用遇冷的 PBS洗滌2次，加入Annexin Ⅴ- FITC/PI各5 μL，室溫避光反應15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 腫瘤模型的建立與治療 在48只BALB/c小鼠的右大腿皮下注射0.1 mL濃度為1×107/mL的CT26細胞懸液，建立皮下結(jié)腸癌瘤模型。約2周后所有小鼠右大腿皮下長出體積約150～200 mm3的腫瘤。將帶瘤小鼠隨機分為4組(n=12)：NS組，安羅替尼組(2 mg/kg/d)，5-FU組(20 mg/kg/d)，聯(lián)合組(安羅替尼2 mg/kg/d+5-FU 20 mg/kg/d)，安羅替尼以灌胃方式給藥治療，5-FU以腹腔注射方式給藥，待21 d后處死小鼠，并采集腫瘤組織進行進一步免疫組化分析。在治療過程中，每隔4天用游標卡尺測量1次腫瘤大小，腫瘤體積V=a×b2×0.5(a代表腫瘤最長徑，b代表腫瘤最短徑)。本課題已經(jīng)四川省西南醫(yī)科大學動物保護和應用委員會批準。

1.7 免疫組化 將所有石蠟包埋的組織蠟塊切成 4 μm 切片進行脫蠟和水化，抗原修復后，在切片上滴加鼠抗人 Ki-67 抗體(體積稀釋比例為1∶50)及CD31抗體(體積稀釋比例為1∶10)， 4 ℃反應過夜 ；滴加二抗， 37 ℃ 反應 20 min ；加入DAB溶液顯色，蘇木精復染，并使用樹脂進行封固。在倒置相差顯微鏡下用400倍鏡放大觀察每一個病理切片，選擇5個視野，計算Ki-67的陽性表達率：Ki-67 陽性率=陽性著色細胞/一個高倍視野下的細胞數(shù)×100 %。并對微血管的數(shù)量進行計數(shù)，取其平均值作為腫瘤組織中微血管的密度(MVD)。

2 結(jié)果

2.1 各組對結(jié)腸癌 CT26 細胞增殖活性的抑制作用 如圖1A、B所示，不同濃度的安羅替尼(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L)和不同濃度5-FU(0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL)均能抑制結(jié)腸癌細胞 CT26 的活性，并隨著濃度增大其細胞活性降低，顯示出明顯的濃度依賴性。從中選取羅替尼 4 μmol/L和 5-FU 5 μg/mL作為適宜的濃度，分別與生理鹽水以及聯(lián)合組(安羅替尼 4 μmol/L+5-FU 5 μg/mL)共同培養(yǎng)，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組對細胞的活性的抑制率明顯高于單用安羅替尼或 5-FU 組(P<0.05,見圖1C)，表明安羅替尼聯(lián)合5-FU可顯著抑制結(jié)腸癌 CT26 細胞的增殖活性。

A、B：不同濃度安羅替尼和5-FU對細胞增殖活性的抑制曲線；C：各組的細胞抑制率(*：與聯(lián)合組相比，P<0.05)。圖1 各組對結(jié)腸癌 CT26 細胞增殖活性的作用

2.2 各組對結(jié)腸癌 CT26 細胞侵襲能力的影響 如圖2A所示，與生理鹽水組相比較，安羅替尼組(4 μmol/L)、 5-FU 組(5 μg/mL)以及聯(lián)合組(安羅替尼4 μmol/L+5-FU 5 μg/mL)均能夠使穿過Transwell 小室膜的細胞減少。圖2B對各組細胞侵襲數(shù)量的定量分析顯示，聯(lián)合組對結(jié)腸癌 CT26 細胞侵襲能力的抑制作用最大(P<0.05)，這說明安羅替尼聯(lián)合 5-FU 對結(jié)腸癌 CT26 細胞侵襲具有更好的抑制作用。

A：各組細胞侵襲的圖像(400×)；B：各組細胞侵襲的數(shù)量；*：與聯(lián)合組相比，P < 0.05。圖2 各組對結(jié)腸癌 CT26 細胞侵襲能力的影響

2.3 各組對結(jié)腸癌 CT26 細胞凋亡的影響 聯(lián)合組(安羅替尼 4 μmol/L+ 5-FU 5 μg/mL)的細胞凋亡率(90.07 ± 3.10%)顯著高于生理鹽水組(9.34 ± 2.55%，P<0.05)，也明顯高于安羅替尼組(4 μmol/L)的細胞凋亡率(25.56 ± 2.42%，P<0.01)和5-FU 組(5 μg/mL)的細胞凋亡率(33.98 ± 3.53%,P<0.05)(見圖3)，表明了安羅替尼聯(lián)合 5-FU 可顯著的促進結(jié)腸癌 CT26 細胞的凋亡從而抑制細胞的增殖。

A：各組的細胞凋亡圖像；B：各組的細胞凋亡率(與聯(lián)合組相比*：P < 0.05)。圖3 各組對結(jié)腸癌 CT26 細胞凋亡的影響

2.4 各組對小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤體積增長的影響 采用小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型來評估單藥及聯(lián)合用藥在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用，結(jié)果顯示(見圖4)，與生理鹽水組相比，安羅替尼2 mg/kg灌胃治療后，小鼠的皮下移植瘤生長稍有抑制，但差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而5-FU 20 mg/kg腹腔注射治療及聯(lián)合組(安羅替尼2 mg/kg+5-FU 20 mg/kg)治療后，小鼠的皮下移植瘤生長受到明顯抑制，且聯(lián)合組的抗腫瘤生長效應更佳，說明了安羅替尼聯(lián)合5-FU在體內(nèi)同樣發(fā)揮了良好的抗腫瘤作用。

A：各組小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤的圖像；B：各組治療后21 d皮下移植瘤的體積；*：與NS組相比，P<0.05。圖4 各組對小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤體積增長的影響

2.5 各組小鼠腫瘤組織中 Ki-67 和 CD31 的表達情況 不同藥物治療后小鼠腫瘤組織中Ki-67 陽性表達和微血管密度情況(見圖5A)。經(jīng)圖5B所示的定量分析，我們發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組(53.13 ± 3.46%)、單藥安羅替尼組(2 mg/kg)(41.03 ± 1.26%)、單藥 5-FU(20 mg/kg)(30.66 ± 0.34%)組相比，聯(lián)合組(安羅替尼 2 mg/kg +5-FU 20 mg/kg) 的Ki-67 陽性表達率(16.74 ± 1.79%)顯著降低(P< 0.05)，安羅替尼與 5-FU 聯(lián)合治療后腫瘤細胞增殖抑制作用增強。圖5C表明單藥 5-FU 組在小鼠腫瘤組織中微血管密度(11.6 ± 1.02)與生理鹽水組(13.2 ± 0.74)相比，不存在統(tǒng)計學差異(P> 0.05)，不具有抗血管生成作用。而與安羅替尼聯(lián)合作用后，聯(lián)合組的微血管密度與單藥 5-FU 組相比(2.8 ± 0.75 VS 11.6 ± 1.02，P< 0.05)顯著下降，抗血管生成作用明顯增強。

A：各組小鼠腫瘤組織中Ki-67(上圖)和 CD31(下圖)的表達圖像(400×)；B：各組小鼠腫瘤組織中 Ki-67 陽性表達率；C：各組小鼠腫瘤組織中的微血管密度(MVD)；*：與聯(lián)合組相比，P<0.05。圖5 各組小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤中Ki-67和CD31的表達情況

3 討論

結(jié)腸癌是與遺傳因素和飲食習慣密切相關(guān)的疾病，在我國其發(fā)生率以平均每年4%～5%的增速逐年增加[13]，嚴重威脅人類健康和生命。除了傳統(tǒng)的手術(shù)及化療以外，分子靶向藥物應用于臨床極大地改善了結(jié)直腸癌患者的預后，使總生存期(Overall survival， OS)由過去的 6 ～ 12 個月延長至將近 30 個月[14]。臨床上批準用于結(jié)直腸癌的靶向治療藥物包括:表皮生長因子受體(Epithelial growth factor receptor，EGFR)抑制劑代表藥物西妥昔單抗和帕尼單抗、抗血管生成抑制劑代表藥物貝伐單抗、阿柏西普和雷莫蘆單抗以及小分子酪氨酸激酶抑制劑代表藥物瑞戈非尼和呋喹替尼[15]，但由于個體差異缺乏基因突變或缺失等引起的原發(fā)性耐藥或使用藥物治療后引起的繼發(fā)性耐藥等原因使部分患者治療效果欠佳或出現(xiàn)疾病的進展，因此，我們需要不斷探究新的治療藥物及治療方法。

安羅替尼是一個多靶點酪氨酸激酶抑制劑，大多數(shù)據(jù)表示，其對非小細胞肺癌[16]、骨肉瘤[17]、甲狀腺癌[18]以及肝癌[19]均具有良好的抗腫瘤及抗血管生成作用。Sun 等[20]開展的一項I期臨床試驗評估了安羅替尼治療21例晚期難治性實體瘤的安全性及抗腫瘤作用，初步表明安羅替尼對結(jié)直腸癌具有抗腫瘤作用。目前，關(guān)于安羅替尼在結(jié)直腸癌中抗腫瘤作用的臨床研究正初步開展，一項單臂Ⅱ期臨床研究納入了31例經(jīng)標準治療失敗或缺乏標準治療的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者[21]，研究結(jié)果顯示客觀緩解率(Objective response rate，ORR)為 6.45%，疾病控制率(Disease control rate,DCR)為 87.1%，中位無進展生存期(Medical progression free survival，mPFS) 為 5.62 個月(95%CI：3.80～7.32)，中位總生存期(Medical overall survival，mOS)為 9.33 個月(95%CI：8.64～10.21),表明單藥安羅替尼對晚期結(jié)直腸癌的治療具有良好抗腫瘤療效。

本研究體外實驗表明安羅替尼能夠抑制結(jié)腸癌 CT26 細胞的增殖和侵襲，并能促進細胞的凋亡。在此基礎上，我們聯(lián)合5-氟尿嘧啶化療藥物，與單藥安羅替尼或5-氟尿嘧啶相對比，聯(lián)合組顯著增強了對結(jié)腸癌 CT26 細胞活性的抑制作用，降低了細胞的侵襲能力，并使細胞凋亡率大大增加。結(jié)直腸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移通常伴隨著腫瘤細胞的增殖、分化和克隆，因此，抗腫瘤藥物的療效取決于對腫瘤細胞活性、增殖、遷移和侵襲的影響。我們認為安羅替尼通過抑制結(jié)腸癌 CT26 細胞的增殖活性，促進細胞凋亡從而在聯(lián)合5-FU后增強了抗腫瘤的效應。為了評估單藥組及聯(lián)合用藥組在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用，我們進一步建立了小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型，結(jié)果表明聯(lián)合組的抗腫瘤生長效應更佳，說明了安羅替尼聯(lián)合 5-FU 在體內(nèi)同樣發(fā)揮了良好的抗腫瘤作用。

腫瘤組織中血管形成為腫瘤細胞提供了的氧氣和營養(yǎng)，在腫瘤的侵襲及遠處轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮了重要的作用[22-23]，Xie 等研究顯示安羅替尼對 VEGFR2 和 VEGFR3 的表達活性具有強烈的抑制作用，同時對 PDGFR 和 FGFR 途徑也有較強的抑制作用，因此能夠全面阻斷腫瘤血管生成[24]。小鼠腫瘤組織的免疫組化顯示，單藥 5-FU 組的 Ki-67 陽性表達率降低，但微血管密度定量與生理鹽水組不存在統(tǒng)計學差異(P> 0.05)。而單藥安羅替尼組 Ki-67 陽性表達率和微血管密度定量均降低，表明安羅替尼具有雙重抑制腫瘤增殖及血管形成的作用。與生理鹽水組、單藥5-FU 或安羅替尼組相比，聯(lián)合組藥物作用能顯著降低腫瘤組織中的 Ki-67 陽性表達率和微血管密度(P< 0.05)。表明安羅替尼聯(lián)合5-FU 能夠增強對腫瘤細胞增殖和血管生成的抑制作用，進而提高了對結(jié)腸癌的治療療效。

綜上所述，本研究證明了安羅替尼可能在5-氟尿嘧啶的作用基礎上增強了對結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲和腫瘤血管生成的抑制作用，達到了更好的抗腫瘤效應。我們的數(shù)據(jù)加深了對安羅替尼聯(lián)合化療治療結(jié)直腸癌的理解，但仍需要進一步探究與其相關(guān)分子機制，更需要大樣本的臨床試驗來證明。