雷方玉，王玉芳，葉天太，高 琛，毛夢菌

(衢州市衢江區(qū)畜牧獸醫(yī)站，浙江 衢州 324022)

熱應(yīng)激是指人或動物，在受到比自身能夠承受的最高溫度之外更高溫度刺激時產(chǎn)生的一種非特異性應(yīng)答反應(yīng)總和，而這種熱應(yīng)激可能造成人或動物生理功能的改變，常見的包括生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂等[1]。在畜牧生產(chǎn)過程中，熱應(yīng)激對動物生殖系統(tǒng)的影響更加突出。有研究指出[2]，熱應(yīng)激對可能導(dǎo)致雄性動物睪丸組織細(xì)胞損傷，導(dǎo)致生精細(xì)胞(GC)凋亡，而使用黃芩苷能在一定程度上防止或減少熱應(yīng)激對生殖系統(tǒng)造成傷害。為研究熱應(yīng)激對動物生殖系統(tǒng)的影響機制，明確黃芩苷在其中的作用，本研究以40只小鼠進行實驗，探討黃芩苷對受熱應(yīng)激小鼠睪丸損傷的保護作用。

1 材料

1.1實驗動物 選擇40只健康的雄性昆明小鼠，以6～8周齡，體重40 g左右為宜；將其飼養(yǎng)在23 ℃，光暗周期12 h：12 h，定時喂食喂水，飼養(yǎng)1周。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 Eppendorf Centrifuge 5415D離心機；Bio Photometer生物分光光度計和微量移液器；Applied Biosystems ABI7500熒光定量PCR儀；Sigma 3K-18離心機和1-13離心機；ACCULABA LC-11002電子天平；寧波江南儀器廠提供的恒溫恒濕箱HWS；北京君意生產(chǎn)的JY300C電泳儀；北京六一生產(chǎn)的DYCP-31D電泳槽；OLYMPUS SZX12型體視顯微鏡。

1.2.2試劑 黃芩苷購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，TUNEL試劑盒購于南京建成，蘇木精CAS#517-28-2購于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，伊紅購于天津博迪化工股份有限公司，中性樹膠購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，Bcl-2相關(guān)X蛋白基因(Bax，ab182733)和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2，ab196495)一抗和二抗購自Abcam公司。

1.3處理方法 將40只小鼠隨機分成四組，每組10只。A組和C組于腹腔注射0.2 mL/只生理鹽水，B組和D組注射0.2 mL的黃芩苷，1次/d，連續(xù)處理7 d；第8 d對C組和D組進行熱應(yīng)激處理：設(shè)置41 ℃、80%濕度，恒定后將小鼠同時放入恒溫恒濕箱中進行熱應(yīng)激處理2 h，期間自由飲水。處理后斷頸法處死小鼠，取出睪丸，用生理鹽水清洗后置于4%組織細(xì)胞固定液中，固定后用流水沖洗6 h，依次用50%、75%、85%、95%、95%、100%、100%乙醇脫水1～1.5 h，再用1∶1二甲苯酒精沖洗30 min，直至邊緣透明。放入1∶1苯蠟中50 min，再放入石蠟Ⅰ 2 h、石蠟Ⅱ 1.5 h、石蠟Ⅲ 1 h。按照常規(guī)操作將組織塊放入包埋盒中，再置于冰箱內(nèi)快速凝固，完成固定后取出備用。將石蠟切片用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫石蠟各20 min，然后放入1:1二甲苯酒精5 min，再放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95% Ⅰ、95% Ⅱ、90%和80%各級酒精溶液中各5 min，自來水沖洗5 min。將切片在蘇木精中染色10～30 min，顯微鏡下觀察染色情況。最后，采用DNA斷裂檢測試劑盒TUNEL法檢測小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果 A、B、D三組HE染色顯示精母細(xì)胞(PS)精子細(xì)胞(S)、精子(SZ)、睪丸支持細(xì)胞(SC)和間質(zhì)細(xì)胞(LC)等細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞間排列緊密，組織結(jié)構(gòu)正常完整，但C組小鼠睪丸PS排列疏松，GC核濃縮，呈月牙狀，細(xì)胞膜皺縮，睪丸間質(zhì)中出現(xiàn)空泡化。

2.2熱應(yīng)激對小鼠睪丸GC的影響 根據(jù)TUNEL檢測AI結(jié)果顯示，A、B兩組的凋亡指數(shù)(AI)對比，P>0.05；C、D兩組AI明顯高于A、B兩組，而D組AI低于C組，P<0.05，詳見表1。

表1 熱應(yīng)激對小鼠睪丸GC的影響

2.3熱應(yīng)激對小鼠Bax、Bcl-2和Bcl-2/Bax的影響 C組Bcl-2和Bcl-2/Bax與A組比較，P<0.05；Bax與A組對比，P>0.05；B、C兩組Bax比較，P>0.05；B組Bcl-2和Bcl-2/Bax與C組比較，P<0.05；D組與A組對比，P>0.05，詳見表2。

表2 熱應(yīng)激對小鼠Bax、Bcl-2和Bcl-2/Bax的影響

3 討論

適當(dāng)?shù)膽?yīng)激刺激能提高動物機體對環(huán)境的適應(yīng)能力和生產(chǎn)性能，但超過某個極限，則可能造成動物生理、心理、行為等多方面的異?；顒樱瑖?yán)重的甚至造成機體內(nèi)環(huán)境紊亂、組織器官生理功能和機能活動障礙，進一步導(dǎo)致生命健康質(zhì)量下降[3]。熱應(yīng)激是動物飼養(yǎng)和運輸過程中常見的應(yīng)激，正常情況下，動物對熱應(yīng)激的刺激會通過調(diào)節(jié)自身體溫中樞來適應(yīng)，促使機體產(chǎn)熱和散熱處于一個始終平衡的狀態(tài)[4]。但如果溫度過高，超越了動物調(diào)節(jié)的極限，體內(nèi)熱量聚集而不能很好的散熱，導(dǎo)致機體中樞神經(jīng)調(diào)節(jié)失常，機體脂質(zhì)和蛋白分解加快，體內(nèi)自由基急速增加，而自由基清除不足，就對動物的機體組織造成氧化損傷，影響動物的生產(chǎn)性能和健康[5]。

正常情況下，2～8 ℃是精子存活的最佳溫度，但高溫會使睪丸溫度升高，引發(fā)睪丸組織細(xì)胞變化，影響精子成熟及存活。急性熱應(yīng)激會致使雄性小鼠睪丸系數(shù)發(fā)生變化，促進細(xì)胞凋亡，生殖細(xì)胞和SC減少，影響精子發(fā)育能力；熱應(yīng)激會破壞SC的間隙，其連接緊密性降低[6]。從本次研究結(jié)果來看，A、B、D三組HE染色顯示PS、S、SZ、SC和LC細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞間排列緊密，組織結(jié)構(gòu)正常完整；但C組小鼠睪丸PS排列疏松，GC核濃縮，呈月牙狀，細(xì)胞膜皺縮，睪丸間質(zhì)中出現(xiàn)空泡化。這說明，熱應(yīng)激會造成精子質(zhì)量降低，精子輸出減少，睪丸內(nèi)雄性激素合成受到抑制，而黃芩苷單獨作用時對小鼠睪丸正常生理功能無影響。雄性小鼠受熱應(yīng)激后，其睪丸組織形態(tài)發(fā)生變化，GC的細(xì)胞核濃縮，呈現(xiàn)月牙狀，細(xì)胞膜發(fā)生皺縮，細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加，表明熱應(yīng)激能對小鼠睪丸組織造成損傷，誘導(dǎo)AI增加，對熱應(yīng)激造成的損傷做出反應(yīng)[7]。細(xì)胞對熱應(yīng)激的敏感性與細(xì)胞發(fā)育程度有關(guān)，經(jīng)過有絲分裂和減數(shù)分裂的細(xì)胞對熱敏感，快速增殖的細(xì)胞比緩慢增殖的細(xì)胞更具有熱敏感型，因此，細(xì)胞凋亡多集中在曲細(xì)精管的PS和精原細(xì)胞中。而黃芩苷干預(yù)再熱應(yīng)激后，小鼠睪丸細(xì)胞凋亡指數(shù)減少，表明黃芩苷能夠保護小鼠睪丸免受熱應(yīng)激損傷[8]。

同時，根據(jù)TUNEL檢測AI結(jié)果顯示，A、B兩組AI對比，P>0.05；C、D兩組AI明顯高于A、B兩組，D組AI低于C組，P<0.05。這也提示我們，熱應(yīng)激會導(dǎo)致生精障礙，而生精能力的喪失又與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，隨著陰囊溫度升高，可以增加生殖細(xì)胞凋亡，造成不可逆的損傷。但黃芩苷可以減輕熱應(yīng)激對睪丸組織的損傷，這可能是因為黃芩苷可以消除體內(nèi)各種氧自由基，抑制黃嘌呤氧化酶的活性，是一種很好的抗氧化劑；當(dāng)小鼠受到熱應(yīng)激時會引起ROS繼發(fā)性氧化應(yīng)激反應(yīng)，不飽脂肪酸產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，繼而生成過氧化脂質(zhì)，產(chǎn)生大量的氧化中間產(chǎn)物，引起細(xì)胞的毒性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白等物質(zhì)的損傷，對細(xì)胞造成傷害，減少細(xì)胞的增殖率；黃芩苷可降低MDA、NO含量，提高SOD、CAT、GSH-Px的活力對熱應(yīng)激下小鼠睪丸組織的氧化損傷起到緩解作用，提高生殖系統(tǒng)的抗氧化能力，進而減少生殖系統(tǒng)的氧化損傷[9]。

另外，研究還指出，C組Bcl-2和Bcl-2/Bax與A組比較，P<0.05；Bax與A組對比，P>0.05；B、C兩組Bax比較，P>0.05；B組Bcl-2和Bcl-2/Bax與C組比較，P<0.05；D組與A組對比，P>0.05。Bcl-2是細(xì)胞凋亡的抑制基因，Bax拮抗Bcl-2抑制凋亡作用，也促進細(xì)胞凋亡功能，兩者參與線粒體應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。熱應(yīng)激可增加SC的凋亡率，通過上調(diào)LLC-PK1細(xì)胞中Bax的表達(dá)來增加Bcl-2與Bax的比例并增加細(xì)胞凋亡。ERK1/2信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞對生理和病理刺激的生長和適應(yīng)，而黃芩苷對受熱應(yīng)激小鼠睪丸損傷的保護作用是通過ERK1/2和PI3K/Akt信號通路來調(diào)節(jié)的，通過調(diào)控Bcl-2和Bax來抑制機體正常細(xì)胞的凋亡和腫瘤細(xì)胞的增殖，表明黃芩苷對機體正常細(xì)胞具有選擇保護性，對腫瘤細(xì)胞可抑制其生長增殖[10]。同時，研究中發(fā)現(xiàn)黃芩苷單獨處理小鼠，對于Bcl-2/Bax比值與對照組比較差異不顯著，表明黃芩苷對于小鼠睪丸組織及GC的正常生理功能不產(chǎn)生影響，或是影響較?。坏S芩苷干預(yù)后的熱應(yīng)激處理結(jié)果，表明黃芩苷能顯著提高Bcl-2/Bax比值，抑制小鼠睪丸組織GC凋亡。

綜上所述，熱應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠睪丸組織損傷和GC凋亡，而黃芩苷可對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠睪丸組織損傷及GC凋亡起保護作用，通過抑制ERK1/2信號通路活化和激活PI3K/Akt信號通路，降低Bcl-2/Bax比值，減少熱應(yīng)激造成的小鼠睪丸GC凋亡。