黃碧霞，劉妍，思蘭蘭，陳容娟，李曉東，羅丹，劉璐潔，王鈞，徐東平，劉新光

1廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東東莞 523808；2解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心全軍傳染病研究所/臨床研究管理中心，北京 100039

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染可導(dǎo)致慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化及肝細(xì)胞癌等肝臟疾病。目前，臨床上治療乙型肝炎最常用的抗病毒藥物是核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogues，NAs)，包括核苷類藥物[如拉米夫定(lamivudine，LAM)、替比夫定(tebivudine，LdT)、恩替卡韋(entecavir，ETV)]和核苷酸類藥物[如阿德福韋酯(adefovir dipivoxil，ADV)、富馬酸替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)]。由于HBV反轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，在病毒學(xué)、免疫、肝臟和誘發(fā)因素的壓力下，HBV易發(fā)生突變。長(zhǎng)期應(yīng)用NAs，藥物壓力導(dǎo)致HBV易發(fā)生耐藥突變[1]，且主要發(fā)生在多聚酶/反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase，RT)區(qū)域。近年來有研究表明，HBV發(fā)生適應(yīng)性突變不僅是藥物壓力作用的結(jié)果，還取決于其復(fù)制力及對(duì)抗病毒藥物和宿主免疫反應(yīng)的敏感性[2-3]。

乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是診斷HBV感染、判斷抗HBV療效的重要指標(biāo)。HBsAg主要親水區(qū)(major hydrophilic region，MHR)指99-169氨基酸(aa)序列區(qū)(aa 99-169)，是刺激B細(xì)胞產(chǎn)生中和性抗體的重要抗原表位[4]。目前有42種HBsAg突變被確定為MHR免疫逃逸相關(guān)突變(表1)[5-6]。由于S基因與HBV RT區(qū)完全重疊，NAs治療引起的耐藥突變亦可導(dǎo)致S基因突變，相反S基因突變亦可誘導(dǎo)RT區(qū)突變[7-8]。目前，關(guān)于免疫適應(yīng)性對(duì)耐藥突變病毒株影響的臨床大樣本研究相對(duì)較少[9]。本研究探討RT耐藥突變患者HBV S基因MHR免疫逃逸相關(guān)突變的特點(diǎn)。

表1 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的HBsAg MHR免疫逃逸相關(guān)突變Tab.1 Immune escape-associated mutations of HBsAg MHR reported in literature

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 采用解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心建立的中國(guó)多功能HBV基因數(shù)據(jù)庫(kù)，回顧性分析2007年7月-2017年8月就診于該院經(jīng)多種核苷(酸)類藥物抗病毒治療并行HBV DNA直接測(cè)序的27 394例患者的臨床資料，從中篩出6917例18～60歲慢性乙型肝炎C基因型患者的基因直接測(cè)序數(shù)據(jù)，并按照是否發(fā)生HBV RT耐藥突變分為HBV RT耐藥突變組(n=4332)與HBV RT野生組(n=2585)。CHB診斷依據(jù)為我國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南(2015)》[10]，排除HIV、HCV、HDV等重疊感染者；排除原發(fā)性肝癌患者。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2 收集臨床資料 收集患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、抗病毒治療史、血清HBV DNA、HBsAg水平和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、膽堿酯酶(CHE)等生化指標(biāo)。

1.3 血清生化指標(biāo)、HBV血清標(biāo)志物和HBV DNA定量檢測(cè) 均由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床檢驗(yàn)中心完成。HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)使用Roche公司的Elecsys定性試劑，其中血清HBsAg定量檢測(cè)使用HBsAg Elecsys定量試劑(檢測(cè)下限為0.05 IU/ml)；血清HBV DNA定量采用Roche公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(檢測(cè)下限為40 IU/ml)。

1.4 HBV RT耐藥突變和HBV S基因MHR免疫逃逸相關(guān)突變分析 HBV RT基因和S基因核酸序列均來源于HBV基因數(shù)據(jù)庫(kù)，采用Megalign軟件比對(duì)分析HBV RT耐藥突變和HBV S基因MHR免疫逃逸相關(guān)突變。HBV標(biāo)準(zhǔn)序列從NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpagex.cgi)獲得。

1.5 HBV RT耐藥突變和HBsAg MHR突變分析 分析RT區(qū)LAM、ADV、ETV經(jīng)典耐藥突變位點(diǎn)和S區(qū)MHR免疫逃逸相關(guān)突變。前者包括rtV173L、r tL180M、r t A181V/T、r tT184A/S/L/G/F、rtS202G/C、rtM204I/V、rtN236T和rtM250L/V[11]；后者包括國(guó)內(nèi)外報(bào)道的42種MHR免疫逃逸相關(guān)突變(表1)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用x±s或M(Q1，Q3)表示，組間比較采用方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CHB患者的HBV RT耐藥突變檢出率 回顧性分析結(jié)果顯示，HBV RT耐藥突變總體檢出率為37.37%(2585/6917)。研究對(duì)象篩選流程見圖1。

2.2 兩組CHB患者M(jìn)HR免疫逃逸相關(guān)突變的臨床特點(diǎn) HBV RT耐藥突變組患者平均年齡為43.5歲，其中2101例(81.30%)為男性，而HBV RT野生組患者平均年齡為40.0歲，其中3489例(80.50%)為男性。HBV RT耐藥突變組HBV DNA載量高于HBV RT野生組[(5.09±1.84) lg10IU/mlvs. (4.95±1.96) lg10IU/ml，P<0.05]，總體突變率顯著高于HBV RT野生組(30.00%vs. 17.13%，P<0.05)。兩組患者一般資料見表2。

圖1 研究對(duì)象篩選流程圖Fig.1 Flow chart of research objects screening

表2 HBV RT耐藥突變組與HBV RT野生組患者一般資料Tab.2 General information of patients in HBV RT resistant mutation group and HBV RT wild group

2.3 兩組CHB患者HBsAg MHR免疫逃逸相關(guān)突變氨基酸替換 HBV RT耐藥突變組中sQ101K/R/H、sS114T/A/L、sT/I126S/N/A、sG130N/R/K/A、sM133T/I、sS143T/L、sA159V/G、sE164D/G單點(diǎn)突變檢出率均高于HBV RT野生組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且這些突變均是已報(bào)道且公認(rèn)的MHR免疫逃逸相關(guān)突變。詳細(xì)結(jié)果見圖2。

3 討 論

世界衛(wèi)生組織2018年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球約有2.92億人感染了HBV，其中我國(guó)約有8600萬[12-13]。 NAs是目前臨床常用的抗HBV藥物，但長(zhǎng)期應(yīng)用易引起耐藥，耐藥主要發(fā)生在HBV RT區(qū)域，HBV RT耐藥突變會(huì)影響HBV感染的治療[14]。核苷(酸)類藥物耐藥突變株發(fā)生演變除取決于病毒和藥物的影響(藥物敏感性降低程度、復(fù)制力水平、突變基因屏障)外，還可能受到免疫逃逸(免疫適應(yīng)性)的影 響[15-16]。本研究主要通過臨床大樣本分析明確免疫因素對(duì)耐藥突變株的影響。

圖2 兩組慢性乙型肝炎患者M(jìn)HR免疫逃逸相關(guān)突變分析Fig.2 Analysis of MHR immune escape related mutations in two groups of patients with chronic hepatitis B

迄今為止，已經(jīng)鑒定出10種HBV基因型，命名為A～J[17-18]，其具有明顯的地理分布特征，我國(guó)主要是B和C基因型。近期Ababneh等[19]關(guān)于約旦地區(qū)D基因型分離株HBV S基因免疫逃逸突變及反轉(zhuǎn)錄酶突變模式的小樣本研究發(fā)現(xiàn)，RT突變和HBsAg突變均增加了耐藥風(fēng)險(xiǎn)。本研究?jī)H納入了C基因型CHB患者，因此可擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析其他基因型在HBV RT耐藥突變和MHR免疫逃逸相關(guān)突變中的意義。

免疫逃逸相關(guān)突變主要發(fā)生在HBsAg主要親水區(qū)域。文獻(xiàn)報(bào)道，約有42種HBsAg突變被確定為MHR免疫逃逸相關(guān)突變[5-6]。本研究在6917例C基因型CHB患者中檢出2585例HBV RT耐藥相關(guān)突變，檢出率為37.37%(2585/6917)；檢出1517例MHR免疫逃逸相關(guān)突變，檢出率為21.93%(1517/6917)，略低于Colagrossi等[20]的研究結(jié)果，后者報(bào)道接受NAs治療的828例患者中，447例(54.00%)發(fā)生NAs誘導(dǎo)的突變，183例(22.10%)發(fā)生免疫逃逸相關(guān)突變。提示臨床上HBV耐藥突變和MHR免疫逃逸相關(guān)突變較常見，且對(duì)HBV抗病毒治療應(yīng)答影響較大，應(yīng)引起重視。

HBV耐藥發(fā)生順序?yàn)榛蛐湍退?、病毒學(xué)耐藥和臨床耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，抗病毒耐藥突變是通過長(zhǎng)期NAs治療選擇的，且病毒學(xué)耐藥與耐藥突變及免疫逃逸相關(guān)突變的不斷積累有關(guān)[21]。本研究納入2585例HBV RT耐藥突變患者和4332例HBV RT野生型患者，二者在年齡構(gòu)成及ALT、AST、CHE等生化指標(biāo)和HBV DNA載量上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HBV RT耐藥突變組HBV DNA載量高于HBV RT野生組，且MHR總體免疫逃逸相關(guān)突變率顯著高于HBV RT野生組(30.00%vs. 17.13%，P<0.05)。本研究結(jié)果表明，HBV耐藥突變可能使病毒復(fù)制力增加，導(dǎo)致NAs的敏感性下降，抗病毒應(yīng)答不佳或無應(yīng)答；MHR免疫逃逸相關(guān)突變的存在更利于HBV耐藥的發(fā)生，提示耐藥性與免疫相關(guān)逃逸突變密切相關(guān)，兩者協(xié)同影響病毒的存活和疾病的進(jìn)展。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H B V RT 耐藥突變組中sQ101K/R/H、sS114T/A/L、sT/I126S/N/A、sG130N/R/K/A、sM133T/I、sS143T/L、sA159V/G、 sE164D/G等單點(diǎn)突變檢出率高于HBV RT野生組(P<0.05)，表明這8種MHR免疫逃逸相關(guān)突變?cè)贖BV RT耐藥突變患者中更易出現(xiàn)。體外研究發(fā)現(xiàn)，sT/I126S[22]、sM133T[22-23]、sS143L[24]、sA159G[25]可影響HBsAg的表達(dá)與分泌，并降低其抗原性，但是目前鮮有研究報(bào)道HBV RT耐藥突變與其中任意MHR免疫逃逸相關(guān)突變共同存在對(duì)耐藥發(fā)生和HBV臨床治療的影響。值得注意的是，Amini-Bavil-Olyaee等[26]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典免疫逃逸相關(guān)突變sG145R和sP120T可明顯降低HBsAg水平，致使L AM耐藥性HBV突變體復(fù)制力升高，表明sG145R和sP120T與LAM耐藥突變具有相關(guān)性；且體外研究結(jié)果表明，TDF可作為一種有效治療臨床LAM耐藥突變和免疫逃逸突變結(jié)合突變體的一線藥物。因此，應(yīng)加強(qiáng)臨床實(shí)踐中既有S區(qū)免疫逃逸突變又有RT區(qū)耐藥突變的復(fù)雜HBV突變體的檢測(cè)和抗病毒治療研究。

綜上所述，本研究通過臨床大樣本分析發(fā)現(xiàn)，HBV RT耐藥突變患者具有更高的HBsAg MHR免疫逃逸突變檢出率，明確了MHR免疫逃逸相關(guān)突變與HBV RT耐藥突變的相關(guān)性，有助于加深人們對(duì)耐藥突變病毒株影響機(jī)制中免疫因素的理解，提高臨床對(duì)HBV耐藥的監(jiān)控水平，以及幫助臨床醫(yī)師優(yōu)化抗病毒治療方案。