王雅雯，趙祚全，韓凱，張宗耀，方緯

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100037

隨著我國老齡化進(jìn)程的加快，冠心病的發(fā)病率及死亡率持續(xù)上升[1]。美國心臟病協(xié)會(huì)(American Heart Association，AHA)及歐洲心臟病學(xué)會(huì)(European Society of Cardiology，ESC)均將核素心肌灌注顯像作為冠心病診斷、危險(xiǎn)分級(jí)及治療決策的重要方法[2-3]。隨著正電子發(fā)射斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)技術(shù)的逐步推廣普及，對(duì)新型PET心肌灌注顯像藥物的發(fā)展也提出了新的要求[4]。

目前， 常用的P E T 心肌灌注顯像劑為15O-H2O、13N-氨水及82Rb，三者半衰期分別為2 min、9.96 min及76 s，必須配備昂貴的回旋加速器或正電子核素發(fā)生器，成本高，難以推廣普及。18F的半衰期較長(約109.8 min)、能量適中、空間分辨率高、便于進(jìn)行商業(yè)化配送，是較為理想的正電子標(biāo)記核素。目前，國內(nèi)外評(píng)價(jià)最高的18F標(biāo)記心肌灌注顯像劑為18F-Flurpiridaz，由于其心肌攝取較高、鄰近非靶器官攝取較好，且在整個(gè)血流范圍內(nèi)能達(dá)到線性的心肌攝取[5-11]，被譽(yù)為心肌灌注顯像領(lǐng)域里程碑式的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段。本研究的新型心肌灌注顯像劑18F-MyoZone與18F-Flurpiridaz同屬于噠螨靈衍生物，相比于18F-Flurpiridaz，18F-MyoZone水溶性更強(qiáng)，從而降低了血液本底及心臟鄰近非靶器官的攝取[12-13]。 該類顯像劑通過被動(dòng)擴(kuò)散富集于心肌細(xì)胞的線粒體中，達(dá)到特異性評(píng)價(jià)心肌血流的目的[14]。但目前18F-MyoZone與心肌細(xì)胞的作用機(jī)制尚未經(jīng)過系統(tǒng)性研究。本研究通過體外放射自顯影、心肌細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)及酶活性測(cè)定驗(yàn)證了18F-MyoZone為線粒體復(fù)合體Ⅰ(mitochondrial complex Ⅰ，MC-Ⅰ)抑制劑，為進(jìn)一步闡明18F-MyoZone的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑及材料 SpectraMax 190微孔板酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)，CM1850冷凍切片機(jī)(Leica公司)，CRC-55tR活度計(jì)(CAPINTEC.INC公司)，Cyclone Plus放射自顯影儀(PerkinElmer公司)，2480 WIZARD自動(dòng)伽馬計(jì)數(shù)儀(PerkinElmer公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)。線粒體復(fù)合體Ⅰ活性檢測(cè)試劑盒(Cayman MitoCheck? Complex Ⅰ Activity Assay)，魚騰酮(北京伊諾凱科技有限公司)，噠螨靈(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，19F-Flurpiridaz(北京先通國際醫(yī)藥科技股份有限公司)，19F-MyoZone(北京先通國際醫(yī)藥科技股份有限公司；19F-MyoZone不具有放射性，其他性質(zhì)與18F-MyoZone一致，非放射性實(shí)驗(yàn)研究采用19F-MyoZone)。新生大鼠原代心肌細(xì)胞(北京愛思益普生物科技股份有限公司)。

1.2 研究藥物制備 制備18F-MyoZone的18F離子由原子高科股份有限公司提供，MyoZone前體由北京先通國際醫(yī)藥科技股份有限公司提供，18F-MyoZone的標(biāo)記、純化、質(zhì)量鑒定按照文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年SD大鼠，雌性，5周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006；合格證編號(hào)：No.1100111911069732。飼養(yǎng)條件：溫度24～26 ℃，濕度約56%，通風(fēng)換氣，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置流程獲得阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.4 方法

1.4.1 抑制線粒體呼吸鏈酶活性機(jī)制的研究 使用Cayman MitoCheck? Complex I Activity Assay試劑盒，以不同濃度的19F-MyoZone(起始濃度15 μmol/L， 3倍稀釋，稀釋12個(gè)點(diǎn))與試劑盒中線粒體復(fù)合物混合物室溫(25 ℃)孵育20 min后，再與線粒體復(fù)合物酶活性反應(yīng)底物混合物混勻，置于酶標(biāo)儀讀板機(jī)中，在Kinetic模式下讀取340 nm吸光度(OD)值(25 ℃，每隔30 s讀一次，連續(xù)讀15 min)，獲取線粒體復(fù)合物酶活性反應(yīng)率，測(cè)定其抑制線粒體呼吸鏈酶活性的半數(shù)抑制率(IC50)。數(shù)據(jù)分析以吸光度值為Y軸、時(shí)間為X軸做直線圖，斜率為反應(yīng)率，結(jié)果以線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物的活性表示，采用以下公式計(jì)算，并采用Graph Pad prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性(%)=(實(shí)驗(yàn)孔反應(yīng)率/對(duì)照孔反應(yīng)率)×100%。

1.4.2 與MC-Ⅰ結(jié)合的放射自顯影研究 ①4種抑制劑的競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)：大鼠心肌組織切片用生理鹽水或不同的抑制劑(4 μmol/L魚藤酮、4 μmol/L19F-Flurpiridaz、4 μmol/L19F-MyoZone及4 μmol/L噠螨靈)100 μl孵育30 min后，除去孵育溶液，再加入100 μl18F-MyoZone溶液(10～30 kBq，20 nmol/L)孵育30 min。清洗切片后，置于暗室中經(jīng)儲(chǔ)磷屏曝光5～20 min。上述實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)一次。②競爭結(jié)合劑量依賴實(shí)驗(yàn)：采用魚藤酮及19F-MyoZone作為抑制劑，設(shè)為兩組(一組為魚藤酮抑制劑組，一組為19F-MyoZone抑制劑組)。每組抑制劑濃度采用0、20 μmol/L、2 μmol/L、200 nmol/L及20 nmol/L。 每張組織切片上加100 μl體積的上述抑制劑溶液進(jìn)行孵育30 min。然后除去上述溶液，在切片上均加入60 μl18F-MyoZone溶液(約12 kBq，20 nmol/L)孵育30 min。清洗切片后，置于暗室以儲(chǔ)磷屏顯影10 min，掃描曝光后膠片的顯影結(jié)果采用ImageJ 1.52a軟件進(jìn)行分析。將每組的平行對(duì)照放射性計(jì)數(shù)率(counts per minute，CPM)視為100%，按以下公式計(jì)算抑制劑各濃度的抑制率。抑制率(%)=(1-CPM抑制劑/ CPM對(duì)照)×100%。

1.4.3 魚藤酮抑制心肌細(xì)胞對(duì)18F-MyoZone的攝取研究 體外培養(yǎng)新生大鼠原代心肌細(xì)胞，以不同濃度的魚藤酮(0、0.1、0.3、1、3、10、30 nmol/L及0.1、0.3、1、3、10 μmol/L)孵育15 min。完成后加入18F-MyoZone(約17 kBq)50 μl，孵育30 min。收集裂解液，對(duì)其進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算魚藤酮的抑制劑量。采用Graph Pad prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

1.4.4 心肌細(xì)胞的外流實(shí)驗(yàn) 體外培養(yǎng)新生大鼠原代心肌細(xì)胞，加入18F-MyoZone(約37 kBq)500 μl，孵育30 min后棄去上清液并清洗，再加入500 μl培養(yǎng)基后置培養(yǎng)箱中孵育。依照各時(shí)間點(diǎn)(0、10、20、30、60、90、120、150 min)依次收集細(xì)胞上清液及裂解液，測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞外流的放射性占比。數(shù)據(jù)分析以細(xì)胞上清液中的放射性計(jì)數(shù)為細(xì)胞外流的藥物，細(xì)胞裂解液中的放射性計(jì)數(shù)為細(xì)胞內(nèi)的藥物，兩者之和為放射性總量。按以下公式計(jì)算細(xì)胞的胞內(nèi)及胞外放射性占比。每組數(shù)據(jù)3個(gè)復(fù)孔。采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。胞內(nèi)占比(%)=[CPM裂解/(CPM上清+CPM裂解)]× 100%；胞外占比(%)=[CPM上清/(CPM上清+CPM裂解)]× 100%。其中，CPM裂解=細(xì)胞裂解液的計(jì)數(shù)率；CPM上清=細(xì)胞上清液的計(jì)數(shù)率。

2 結(jié) 果

2.118F-MyoZone的制備 制備的18F-MyoZone注射液無色澄清，制備總時(shí)長為70 min，校正的放射化學(xué)產(chǎn)率為47%～58%，產(chǎn)物的放射化學(xué)純度＞98%。

2.2 抑制線粒體呼吸鏈酶活性機(jī)制的研究19F-MyoZone對(duì)線粒體呼吸鏈酶活性的抑制結(jié)果顯示，19F-MyoZone可作用于線粒體MC-I，影響線粒體呼吸鏈酶活性?？装?-5中，線粒體酶活性受到不同程度的抑制；隨著加入19F-MyoZone濃度的增高，抑制程度加重；孔板6-12中較低濃度的19F-MyoZone對(duì)線粒體酶活性的抑制不明顯(表1)。19F-MyoZone對(duì)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物的酶活性抑制曲線(圖1)顯示，隨著19F-MyoZone濃度的增高，線粒體呼吸鏈酶活性呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，兩者之間存在劑量依賴性；19F-MyoZone抑制線粒體復(fù)合物酶活性的IC50為229.9 nmol/L。

2.318F-MyoZone與MC-Ⅰ結(jié)合的放射自顯影研究 ①4種抑制劑的競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未加任何抑制劑的對(duì)照組大鼠心肌組織切片上均有明顯的放射性濃聚，表明18F-MyoZone可與心肌組織結(jié)合。而加抑制劑組(不同的抑制劑+18F-MyoZone孵育)均出現(xiàn)了放射性攝取的減少，4種抑制劑均可競爭18F-MyoZone與MC-Ⅰ的結(jié)合，抑制率為13.2%～52.2%(圖2)。②魚藤酮及19F-MyoZone劑量依賴性的競爭抑制結(jié)果顯示，改變魚藤酮或19F-MyoZone的濃度，心肌組織切片上的放射性攝取隨著抑制劑濃度的升高而減少，魚藤酮對(duì)18F-MyoZone與心肌組織結(jié)合的抑制率隨著濃度的增加而增大(0%～51.5%)，19F-MyoZone對(duì)18F-MyoZone與心肌組織結(jié)合的抑制率也隨著濃度的增加而增大(0%～40.2%)，均呈劑量依賴關(guān)系(圖3)。

表1 19F-MyoZone反應(yīng)斜率及線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物活性Tab.1 Slopes of 19F-MyoZone reaction and activities of mitochondrial respiratory chain enzyme complex

圖1 19F-MyoZone對(duì)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物的酶活性抑制曲線Fig.1 The enzyme activity inhibition curves of 19F-MyoZone on mitochondrial respiratory chain enzyme complex

2.4 魚藤酮抑制心肌細(xì)胞對(duì)18F-MyoZone的攝取研究 魚藤酮對(duì)心肌細(xì)胞攝取18F-MyoZone的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未加抑制劑的心肌細(xì)胞中有較高的放射性攝取值，隨著抑制劑濃度的升高，心肌細(xì)胞中的放射性攝取值逐漸減少(表2)，表明18F-MyoZone可被大鼠心肌細(xì)胞攝取，該攝取可被魚藤酮所抑制，并且呈劑量依賴性。計(jì)算得出抑制劑的IC50為7 nmol/L (圖4)。

表2 魚藤酮對(duì)心肌細(xì)胞攝取18F-MyoZone的抑制作用Tab.2 Inhibition effect of rotenone on uptake of 18F-MyoZone in cardiomyocytes

2.518F-MyoZone心肌細(xì)胞的外流實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，18F-MyoZone可被大鼠心肌細(xì)胞快速攝取，并可在心肌細(xì)胞內(nèi)滯留。在0～30 min，大鼠心肌細(xì)胞中的18F-MyoZone有持續(xù)外流現(xiàn)象，隨著時(shí)間的延長而增加，隨后在60～150 min，心肌細(xì)胞內(nèi)的放射性組分保持穩(wěn)定，約為總攝取量的20%(圖5)。

3 討 論

圖2 18F-MyoZone大鼠心肌組織切片放射自顯影圖Fig.2 Autoradiography of 18F-MyoZone in myocardial tissue sections of neonatal rat

圖3 魚藤酮及19F-MyoZone抑制心肌組織對(duì)18F-MyoZone的攝取圖像Fig.3 Inhibition effect of rotenone on uptake of 18F-MyoZone in cardiomyocytes

圖4 魚藤酮競爭曲線Fig.4 The rotenone competition curve CPM. 每分鐘放射性計(jì)數(shù)

理想的心肌灌注顯像劑需要滿足注射后心肌細(xì)胞攝取快且滯留時(shí)間長、心臟外組織器官攝取低且本底清除快、顯像圖像清晰、時(shí)間及空間分辨率高、不需要現(xiàn)場(chǎng)加速器生產(chǎn)等條件。無論是傳統(tǒng)的SPECT心肌灌注顯像劑(如99mTc-MIBI、201Tl等)，還是目前常用的PET心肌灌注顯像劑(如15O-H2O、13N-NH3·H2O及82Rb)均不具備這些特性，研發(fā)18F標(biāo)記的正電子顯像劑才能最大程度地滿足理想心肌灌注顯像劑的要求。

圖5 18F-MyoZone在大鼠心肌細(xì)胞的外流Fig.5 Outflow rates of 18F-MyoZone in rat cardiomyocytes

目前國內(nèi)外研究較多的18F標(biāo)記心肌血流灌注顯像劑主要分為兩大類：第一類是以18F-TPP[15]、18F-FBnTP[16]、18F-FERhB[17]為代表的親脂性陽離子類顯像劑，該類顯像劑主要通過跨膜被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入心肌細(xì)胞內(nèi)[18]，心肌細(xì)胞攝取特異性較差，攝取率相對(duì)較低，顯像效果并不十分理想。另一類是以心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)MC-Ⅰ為靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合顯像的MC-Ⅰ抑制劑類顯像劑。線粒體為心臟提供大量動(dòng)力，占心肌細(xì)胞內(nèi)體積的20%～30%。MC-Ⅰ位于線粒體內(nèi)膜，其結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，有40多個(gè)亞基，分子量約為1000 kD，因此，針對(duì)MC-Ⅰ的分子可在心肌中富集[19-20]。這類顯像劑主要包括18F-FPOP、18F-FDHR、18F-RP1003/04/05、18F-Flurpiridaz[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，MyoZone是一種強(qiáng)效的MC-Ⅰ抑制劑。酶活性抑制實(shí)驗(yàn)顯示，隨著加入19F-MyoZone溶液濃度的增加，MC-Ⅰ酶活性受抑制程度亦隨之增大，其IC50為229.9 nmol/L。 然而在實(shí)驗(yàn)過程中，不同19F-MyoZone濃度組中3個(gè)平行孔，2號(hào)孔皆顯示出比1、3號(hào)孔較低的測(cè)量數(shù)值，導(dǎo)致平行樣本間實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差，其原因可能是實(shí)驗(yàn)過程中的儀器對(duì)于2號(hào)孔數(shù)據(jù)讀取偏差，考慮在未來的研究中，應(yīng)該重復(fù)該部分實(shí)驗(yàn)，以獲得樣本組間差異較小、均勻性較高的一致性結(jié)果。魚藤酮、噠螨靈是MC-Ⅰ的經(jīng)典抑制劑，而18F-Flurpiridaz是目前最成功的MC-Ⅰ抑制劑類心肌灌注顯像劑，三者的IC50相似，分別為(18.2±6.7) nmol/L、(19.8±2.6) nmol/L、 (16.6±3.0) nmol/L[20]。本文通過細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，18F-MyoZone與心肌細(xì)胞的結(jié)合受到魚藤酮的抑制，且抑制效應(yīng)隨魚藤酮濃度的增高而增大。組織學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)，心肌攝取18F-MyoZone的程度受到魚藤酮、噠螨靈、19F-Flurpiridaz的競爭性抑制。由此可知，18F-MyoZone與心肌細(xì)胞內(nèi)MC-Ⅰ的結(jié)合為特異性結(jié)合，18F-MyoZone屬于MC-Ⅰ抑制劑類顯像劑，其結(jié)合位點(diǎn)與已知的MC-Ⅰ抑制劑魚藤酮、噠螨靈、19F-Flurpiridaz一致。由于MC-Ⅰ在線粒體能量生成中起重要作用，18F-MyoZone作為新型MC-Ⅰ抑制劑類顯像劑是否會(huì)影響心肌細(xì)胞能量代謝需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。既往研究顯示，濃度為0.2～1.0 μmol/L的不同MC-I抑制劑(包括魚藤酮、噠螨靈、19F-Flurpiridaz)孵育細(xì)胞45 min～18 h，細(xì)胞活力未受明顯影響[24]。然而在高濃度(1.0 mmol/L)魚藤酮的長時(shí)間(48～72 h)孵育下，大鼠心肌細(xì)胞活性受到明顯影響[25-26]。本研究中的MyoZone亦作用于心肌MC-I位點(diǎn)，屬于MC-Ⅰ抑制劑，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中采用的MyoZone濃度在20 nmol/L～20 μmol/L，孵育時(shí)間約30 min，此濃度范圍的MyoZone是否會(huì)影響線粒體酶活性進(jìn)而影響心肌細(xì)胞活力，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。

心肌細(xì)胞的外流實(shí)驗(yàn)被廣泛用于研究顯像劑的心肌細(xì)胞滯留情況。本研究結(jié)果顯示，在0～30 min，大鼠心肌細(xì)胞中的18F-MyoZone有持續(xù)外流現(xiàn)象，隨后在60～150 min，心肌細(xì)胞內(nèi)的放射性組分保持穩(wěn)定。18F-MyoZone可以在心肌細(xì)胞中穩(wěn)定保留超過150 min，具備的優(yōu)良心肌灌注顯像劑的條件。

綜上所述， 本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)18F-MyoZone為一種MC-Ⅰ抑制劑類顯像劑，通過與線粒體內(nèi)MC-Ⅰ特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)心肌攝取。18F-MyoZone在150 min的較長時(shí)間內(nèi)均有比較穩(wěn)定的心肌細(xì)胞滯留，具有良好的心肌灌注顯像潛能。