楊新瑤, 閆馨予, 唐 章, 陳芳敏

(沈陽大學(xué) a. 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, b. 城市有害生物治理遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽 110044)

砷(As)是一種自然界中普遍存在的劇毒類金屬元素[1-2],它主要產(chǎn)生于地質(zhì)作用[3],但是近年來由于人類活動的干預(yù),如化石燃料的燃燒、含砷礦物的開采、冶金廢物的排放,以及不適當(dāng)?shù)霓r(nóng)業(yè)或醫(yī)療用途等加劇了砷對環(huán)境的污染[4-6].砷與其他重金屬一樣,一旦進(jìn)入環(huán)境后長期存在,且會四處擴(kuò)散,對人類、動物和其他有機(jī)體造成有害的影響.當(dāng)前,土壤、水及空氣中的砷污染已成為一個全球性的環(huán)境問題,受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,其中水環(huán)境中砷的污染問題尤為嚴(yán)重.世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國環(huán)境保護(hù)署(USEPA)規(guī)定飲用水中As質(zhì)量濃度不得高于10 μg·L-1[6-7],但許多國家都達(dá)不到規(guī)定標(biāo)準(zhǔn),一些污染較為嚴(yán)重的國家如印度、孟加拉國,其局部地下水砷質(zhì)量濃度可高達(dá)3 200 μg·L-1,遠(yuǎn)超出規(guī)定的限值[8].據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),世界上有70多個國家、超過230個地區(qū)均存在高砷水污染現(xiàn)象[9],且有超過1.5億人遭受砷污染水體的威脅,我國也有230多萬人受砷污染地下水的影響[10].長期接觸高砷污染水體會引發(fā)一系列人類疾病[11-12],如皮膚癌、高血壓、心血管疾病等,甚至?xí)斐芍旅{,因此解決水體砷污染問題十分迫切.

砷的毒性與它的存在形態(tài)有關(guān),單質(zhì)砷對人體和生物體無毒[4],無機(jī)砷比有機(jī)砷毒性大,其中,無機(jī)亞砷酸鹽(As(Ⅲ))和砷酸鹽(As(Ⅴ))的毒性最強(qiáng),同時(shí)也是水環(huán)境最主要的存在形式[11-12].水體中的砷雖不能像有機(jī)污染物一樣被降解成無害的化學(xué)物質(zhì)[13],但它可以被固定或轉(zhuǎn)化為毒性較小的形式[1].目前,常用的高砷水修復(fù)技術(shù)主要有吸附法、混凝沉淀法、氧化法、離子交換法、膜分離法、植物法和微生物法等[14].由于傳統(tǒng)的物化處理方法存在著能耗高、產(chǎn)生二次污染的特點(diǎn),微生物法修復(fù)砷因其高效、環(huán)保且成本低等優(yōu)勢而具有較大的應(yīng)用前景.

微生物法修復(fù)砷是指通過具有耐砷、抗砷及轉(zhuǎn)化砷價(jià)態(tài)功能的微生物對砷的吸附、積累和轉(zhuǎn)化作用,來降低或消除砷的毒性[13,15-16].有研究表明,一些微生物在高砷環(huán)境中可以生存,它們在對砷產(chǎn)生抗性的同時(shí),也會進(jìn)化出各種耐砷機(jī)制,在砷的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用[17].例如,Katsoyiannis等[18]發(fā)現(xiàn)球衣細(xì)菌、纖維菌和鐵細(xì)菌等一些地下水中的土著微生物,可以把溶液中的As(Ⅲ)氧化為As(Ⅴ),并通過與Fe3+的共沉淀作用來去除水體中的砷.Prasad等[19]發(fā)現(xiàn)一種紅球菌(Rhodococcussp.WB-12)可以對砷進(jìn)行吸附,當(dāng)pH值為7.0時(shí),其對As(Ⅲ)的最大吸附量可達(dá)77.3 mg·g-1.

而谷氨酸棒桿菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032)作為一種工程模式菌用于工業(yè)生產(chǎn)氨基酸和核苷酸,已有研究報(bào)道其可在含亞砷酸鹽和砷酸鹽的培養(yǎng)基(富營養(yǎng)環(huán)境)中生長[1,20],表明該菌具備砷修復(fù)潛力.但該細(xì)菌在水環(huán)境(即貧營養(yǎng)環(huán)境)中對砷的修復(fù)應(yīng)用尚未見報(bào)道,本文以谷氨酸棒桿菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032)為研究對象,探索了其在培養(yǎng)基中對不同質(zhì)量濃度砷(As(Ⅴ))的耐受性及在含砷水中(即貧營養(yǎng)環(huán)境中)對砷的去除效果,旨在為微生物修復(fù)砷技術(shù)提供數(shù)據(jù)參考.

1 試 驗(yàn)

1.1 儀器與材料

臺式全溫振蕩器(TQZ-31,精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,上海),pH計(jì)(PB-10,Sartorius,德國),高壓滅菌鍋(SX-500,TOMY,日本),紫外可見分光光度計(jì)UV(U-2910,Hitachi,日本),臺式高速離心機(jī)(H/T16MM,赫西儀器裝備有限公司,湖南),電感耦合等離子體質(zhì)譜儀ICP-MS(7700ce,Agilent,美國);牛肉膏(BR,Solarbio,北京),蛋白胨(BR,Solarbio,北京),氯化鈉(AR,恒興試劑,天津),谷氨酸棒桿菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032,工程模式菌, BNCC 185926,北納生物,北京),砷酸鈉NaAsO3(AR,艾科試劑,成都),亞砷酸鈉NaAsO2(AR,艾科試劑,成都).

1.2 谷氨酸棒桿菌對砷(As(V))的耐受性

液體培養(yǎng)基制備:在250 mL超純水中加入7.5 g蛋白胨、0.75 g牛肉膏和1.25 g氯化鈉,使用pH計(jì)通過氫氧化鈉調(diào)整pH值為7.0后,在高壓滅菌鍋中(121 ℃)滅菌20 min.

將谷氨酸棒桿菌接種在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),在37 ℃恒溫振蕩器中以120 r·min-1轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2 h,用紫外可見分光光度計(jì)(UV)測試OD600值表示細(xì)菌的濃度,此時(shí)細(xì)菌OD600值為0.25,設(shè)為此試驗(yàn)中細(xì)菌的初始濃度.將含培養(yǎng)基的菌液分裝在5個錐形瓶中(每瓶30 mL),在錐形瓶中加入NaAsO3(As(Ⅴ))溶液使砷質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、10.0 mg·L-1,再繼續(xù)進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng),分別在7 h和24 h后用紫外可見分光光度計(jì)(UV)測各錐形瓶中細(xì)菌濃度,計(jì)算細(xì)菌的增長率和相對增長率,增長率計(jì)算方法如式(1)所示,相對增長率計(jì)算方法如式(2)所示,從而比較不同質(zhì)量濃度的砷(As(V))對細(xì)菌生長狀態(tài)的影響.

1.3 谷氨酸棒桿菌對砷的去除

將谷氨酸棒桿菌接種在液體培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫?fù)u床中以120 r·min-1轉(zhuǎn)速培養(yǎng)10 h,細(xì)菌OD600=1.05(一般認(rèn)為細(xì)菌OD600值為1左右時(shí)細(xì)菌處于穩(wěn)定期或?qū)?shù)生長后期,此時(shí)細(xì)菌數(shù)量較穩(wěn)定),然后取10 mL菌液在5 000 r·min-1下離心5 min,分離得到細(xì)菌沉淀,在細(xì)菌沉淀中分別加入10 mL質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的NaAsO2(As(Ⅲ))溶液和NaAsO3(As(Ⅴ))溶液,2種砷溶液的離子強(qiáng)度均用NaCl溶液調(diào)至10 mmol·kg-1,混勻后在37 ℃全溫振蕩器中培養(yǎng)1 h.對培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行離心分離(5 000 r·min-1,5 min),對離心后上清液中砷質(zhì)量濃度采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀ICP-MS進(jìn)行測試,記為未被菌攝入的砷;在離心后得到的細(xì)菌沉淀中加入超純水后超聲3 min,以洗下可能吸附在細(xì)菌表面的砷,然后再一次離心分離,測離心的上清液中砷質(zhì)量濃度,記為吸附在細(xì)菌表面的砷,吸附率計(jì)算方法如式(3)所示.取細(xì)菌沉淀測砷質(zhì)量濃度,記為攝入細(xì)菌體內(nèi)的砷,攝取率計(jì)算方法如式(4)所示.通過分離測試與細(xì)菌共同作用1 h 后的溶液中砷的質(zhì)量濃度,以砷的去除率來評價(jià)細(xì)菌對砷的去除效果,去除率計(jì)算方法如式(5)所示.

2 結(jié)果與討論

表1為培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度砷(As(Ⅴ))溶液中谷氨酸棒桿菌生長狀態(tài)參數(shù),圖1為培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度砷(As(Ⅴ))溶液中谷氨酸棒桿菌相對增長率隨時(shí)間的變化.從表1可以看出,加入砷后培養(yǎng)7 h、24 h后,細(xì)菌OD600檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)菌均能生長.對照表1和圖1,可知加入質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1的As(Ⅴ)溶液中細(xì)菌濃度相對不加砷的對照組中7 h相對增長率有明顯減少(7 h相對增長率為-28.80%),表示此質(zhì)量濃度下的As(Ⅴ)在7 h內(nèi)會對細(xì)菌生長起到明顯的抑制作用;而加入As(Ⅴ)質(zhì)量濃度為0.5和1.0 mg·L-1對細(xì)菌生長有一定的促進(jìn)作用,均表現(xiàn)出7 h相對增長率為正值(5.7%、4.3%);加入As(Ⅴ)質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1溶液則對細(xì)菌生長影響很小(7 h相對增長率為-0.2%).加砷培養(yǎng)24 h后,發(fā)現(xiàn)加入As(Ⅴ)質(zhì)量濃度為10.0 mg·L-1溶液對細(xì)菌生長起到促進(jìn)作用(24 h相對增長率為4.8%),加入As(Ⅴ)質(zhì)量濃度為0.5和1.0 mg·L-1溶液對細(xì)菌生長仍有一定的促進(jìn)作用(24 h相對增長率分別為1.6%、7.0%),而加入As(Ⅴ)質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1溶液對細(xì)菌生長影響依然很小(24 h相對增長率為0.1%).

表1 培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度砷(As(Ⅴ))溶液中谷氨酸棒桿菌生長狀態(tài)參數(shù)

圖1培養(yǎng)基中不同質(zhì)量濃度砷(As(Ⅴ))溶液中谷氨酸棒桿菌相對增長率隨時(shí)間的變化

Fig.1VariationofrelativegrowthrateofCorynebacteriumglutamicumunderdifferentmassconcentrationsofarsenic(As(Ⅴ))inculturemediumwithtime

由此可見,加入0.1 mg·L-1As(Ⅴ)溶液對谷氨酸棒桿菌生長幾乎沒有影響,加入0.5、1.0 mg·L-1As(Ⅴ)溶液對谷氨酸棒桿菌生長有一定的促進(jìn)作用,這可能是由于砷作為一種類重金屬元素有著與重金屬元素類似的性質(zhì),低質(zhì)量濃度下會促進(jìn)細(xì)菌生長[21-22].加入10.0 mg·L-1As(Ⅴ)溶液在7 h對細(xì)菌生長有明顯的抑制作用,而24 h后則有一定的促進(jìn)生長的作用,這可能是由于在反應(yīng)前期(7 h)高質(zhì)量濃度砷會破壞細(xì)菌的結(jié)構(gòu),阻礙細(xì)菌的繁殖,而隨著反應(yīng)時(shí)間延長,細(xì)菌逐漸進(jìn)化出抵抗重金屬的機(jī)制,使得細(xì)菌適宜在高砷環(huán)境中生長,從而獲得一定的促進(jìn)生長作用,在另一方面,可能是由于反應(yīng)器中有機(jī)質(zhì)的營養(yǎng)物質(zhì)有限,在反應(yīng)進(jìn)行到24 h后已經(jīng)沒有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)供細(xì)菌繼續(xù)生長,導(dǎo)致24 h后不同質(zhì)量濃度As(Ⅴ)溶液中細(xì)菌OD600值均為2左右.

這一方面證實(shí)了谷氨酸棒桿菌在培養(yǎng)基中對砷有很高的耐受性,另一方面發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長的砷濃度效應(yīng),即加入0.5、1.0 mg·L-1的As(Ⅴ)溶液會促進(jìn)細(xì)菌的生長,加入10.0 mg·L-1As(Ⅴ)溶液在反應(yīng)前期會對細(xì)菌生長起抑制作用,但反應(yīng)時(shí)間延長后則能在一定程度上促進(jìn)細(xì)菌的生長.

表2為谷氨酸棒桿菌在含砷水(即貧營養(yǎng)環(huán)境)中對砷的去除效果.對比在細(xì)菌OD600值同為1.05的細(xì)菌中加入質(zhì)量濃度均為1.0 mg·L-1的NaAsO2(As(Ⅲ))溶液和NaAsO3(As(Ⅴ))溶液,結(jié)果表明相同細(xì)菌濃度下,谷氨酸棒桿菌對2種不同價(jià)態(tài)的砷均有一定去除效果,細(xì)菌對As(Ⅴ)的攝入質(zhì)量濃度為7.58 μg·L-1,高于As(Ⅲ)的2.78 μg·L-1,這表明OD600=1.05的細(xì)菌對As(Ⅴ)及As(Ⅲ)均有攝入能力.谷氨酸棒桿菌能攝入砷是由于砷與磷同為第VA族的元素,砷酸鹽與磷酸鹽結(jié)構(gòu)類似,可通過磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞,會通過替換細(xì)胞磷酸鹽而干擾正常的磷酸化過程,對細(xì)菌產(chǎn)生毒害作用[23];亞砷酸鹽通過細(xì)菌的水甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞,能通過結(jié)合蛋白質(zhì)中半胱氨酸殘基的巰基使其失活,從而對細(xì)菌產(chǎn)生毒害作用[20].與此同時(shí),細(xì)菌表面還能吸附砷,主要通過細(xì)菌產(chǎn)生的胞外聚合物(EPS)等對砷產(chǎn)生絡(luò)合作用[19],吸附質(zhì)量濃度分別為33.00和35.02 μg·L-1.對比發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌對As(Ⅴ)的攝入能力強(qiáng)于As(Ⅲ),這可能是由于As(Ⅲ)的生物毒性強(qiáng)于As(Ⅴ)[24]導(dǎo)致細(xì)菌對As(Ⅲ)的攝取更低,相同細(xì)菌濃度下的谷氨酸棒桿菌對2種價(jià)態(tài)的砷的去除率則相差很小,分別為4.06%和3.78%.

表2 谷氨酸棒桿菌在含砷水中(即貧營養(yǎng)環(huán)境)中對砷的去除效果

對比不同濃度的細(xì)菌對As(Ⅲ)的去除效果,發(fā)現(xiàn)低濃度細(xì)菌(OD600=0.35)對As(Ⅲ)的攝入量(34.83 μg·L-1)要遠(yuǎn)高于高濃度細(xì)菌(OD600=1.05)的攝入量(2.78 μg·L-1),這可能由于較低的OD600值代表細(xì)菌處于對數(shù)生長期,細(xì)菌活性相對更高,更早適應(yīng)砷的毒性.細(xì)菌對As(Ⅲ)的吸附效果則相反,高濃度細(xì)菌其吸附量(35.02 μg·L-1)高于低濃度細(xì)菌吸附量(19.59 μg·L-1),這可能是由于低濃度的細(xì)菌數(shù)量相對較少,所提供的有效吸附面積小,同時(shí),細(xì)菌還未生長至成熟狀態(tài),吸附能力也較差.總的去除效果表現(xiàn)為低濃度細(xì)菌對As(Ⅲ)的去除率更高(5.44%>3.78%).

因此, 細(xì)菌對砷去除效果與細(xì)菌濃度有關(guān), 本試驗(yàn)數(shù)據(jù)是在貧營養(yǎng)環(huán)境中所得, 而相對營養(yǎng)豐富的環(huán)境下細(xì)菌的生長狀態(tài)會更好, 細(xì)菌濃度會更大, 去除率會更高; 另一方面,細(xì)菌生長狀態(tài)會影響其對砷的攝取, 因此可以考慮使用生長狀態(tài)更好、細(xì)胞活性更高的細(xì)菌來提高砷的去除率.

3 結(jié) 論

1) 谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum,ATCC 13032)對砷有良好的耐受性.在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中,低質(zhì)量濃度砷(As(Ⅴ))會一直促進(jìn)細(xì)菌的生長,高質(zhì)量濃度砷(As(Ⅴ))在反應(yīng)開始階段會抑制生長,而反應(yīng)時(shí)間延長后高質(zhì)量濃度砷(As(Ⅴ))對細(xì)菌生長也有促進(jìn)作用.

2) 在貧營養(yǎng)的水環(huán)境中,細(xì)菌通過將As(Ⅲ)和As(Ⅴ)攝入體內(nèi)及吸附在表面以達(dá)到去除砷的效果.

3) 在相同細(xì)菌濃度(OD600=1.05)下,谷氨酸棒桿菌對As(Ⅴ)的攝入強(qiáng)于As(Ⅲ);在不同細(xì)菌濃度(OD600=1.05)和(OD600=0.35)下,低細(xì)菌濃度(OD600=0.35)的谷氨酸棒桿菌對As(Ⅲ)的攝入遠(yuǎn)高于高細(xì)菌濃度(OD600=1.05)條件,低細(xì)菌濃度的谷氨酸棒桿菌對As(Ⅲ)的去除率也高于高細(xì)菌濃度條件.