李秀翠，周玉博△，司可藝，李宏田，張 樂，張亞黎，劉菊芬，劉建蒙△

(1. 北京大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，北京 100191； 2. 北京大學生育健康研究所，國家衛(wèi)生健康委員會生育健康重點實驗室，北京 100191)

維生素A(vitamin A，VitA)是人體必需脂溶性維生素，參與胎兒視覺和骨骼發(fā)育、免疫系統(tǒng)維持等多種生理功能[1-2]。孕期VitA缺乏可增加胎兒出生體質量降低[3]和骨骼發(fā)育不良[4]的發(fā)生風險。新生兒VitA營養(yǎng)水平影響體格發(fā)育[5]、呼吸系統(tǒng)[6]和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[7]及嬰兒期死亡風險[8]等。探討孕晚期VitA水平與新生兒VitA水平的關系對于改善新生兒營養(yǎng)狀況，降低不良出生結局具有重要公共衛(wèi)生和臨床意義。既往有小樣本研究提示了孕晚期母血與新生兒臍帶血VitA水平有相關性[9-10]，但未見有定量分析兩者之間是否存在劑量-反應關系的研究，也少有定性分析孕婦VitA缺乏對新生兒VitA缺乏影響的研究。此外，臍帶血VitA是由母血VitA經(jīng)胎盤主動轉運而來[11]，然而胎盤主動轉運能力是否受孕婦VitA水平影響也未見報道。

本研究分析了688對孕晚期婦女和新生兒血漿VitA水平，評價兩者間的劑量-反應關系，分析孕晚期VitA缺乏對新生兒VitA水平的影響，并探討母血VitA水平與胎盤轉運能力的關聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2009年5月至6月在河北省元氏縣和樂亭縣募集孕婦，隨訪觀察至分娩。孕婦納入標準：募集時妊娠<20周，并建立圍產(chǎn)保健手冊；年齡≥20周歲；本次懷孕為單胎；無生育史；妊娠結局為娩出活產(chǎn)兒；本地長期居住者；生活能夠自理且自愿參加本項目。共募集到817例孕婦，排除未采集臨產(chǎn)前靜脈血或分娩時臍帶血樣本(n=2)、樣本溶血或采集不足(n=120)、基本信息缺失(n=4)、或VitA測定值異常者(n=3)，最終納入分析688對孕婦和新生兒資料。本研究項目經(jīng)北京大學生物醫(yī)學倫理委員會審查通過后實施(批準號：IRB00001052-11024)。

1.2 基本信息收集

由經(jīng)統(tǒng)一培訓的醫(yī)院產(chǎn)科項目人員收集孕婦及新生兒的基本信息。孕婦信息包括年齡、募集孕周、分娩孕周、職業(yè)、文化程度、募集時體重指數(shù)和血紅蛋白濃度。新生兒信息包括性別、早產(chǎn)、出生體重和出生身長。

1.3 樣本采集與測定

樣本采集：采用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝管采集臨產(chǎn)前靜脈血和分娩時臍帶血5 mL，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，分離出血漿并短期儲存于-20 ℃冰箱。冷鏈運輸樣本至國家衛(wèi)生健康委員會生育健康重點實驗室，于-80 ℃冰箱凍存待測。

樣本測定：采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測血漿中視黃醇，以視黃醇濃度代表VitA水平。檢測所用儀器主要包括高效液相色譜儀(Alliance 2690)、雙通道紫外分光檢測器(Waters 2489)、C18反向色譜柱(填料HSS T3，5 μm，4.6×150 mm)，均購自美國Waters公司。所用試劑包括視黃醇標準液(0.1 g/L，Cerilliant公司，美國)、視黃醇乙酸酯(Sigma公司，美國)，其他試劑如色譜純級別的無水乙醇、甲醇、乙腈等購自美國Fisher公司。檢測過程為：在25 μL待測血漿中，加入50 μL視黃醇乙酸酯內標溶液和125 μL乙腈，充分震蕩后，25 ℃室溫下15 000 r/min離心3 min，吸取80 μL上清液至有蓋的自動采樣瓶中進樣檢測。流動相為乙腈 ∶水(85 ∶15)，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣溫度20 ℃，檢測波長325 nm。每20個樣本進行一次盲樣質控，每輪測定前后放入高、中、低質控。樣本處理與檢測均在國家衛(wèi)生健康委員會生育健康重點實驗室BSL-2黃光實驗室內進行，檢測過程嚴格避光。

1.4 VitA營養(yǎng)狀況及相關指標判定

孕婦VitA營養(yǎng)狀態(tài)判定：采用世界衛(wèi)生組織的判定標準[12]，定義孕婦血漿視黃醇濃度<0.70 μmol/L為缺乏(VitA deficiency，VAD)， 0.70～<1.05 μmol/L為邊緣性缺乏(marginal VitA deficiency，MVAD)，≥1.05 μmol/L為充足。新生兒VitA營養(yǎng)狀態(tài)判定：由于尚無臍帶血VitA分類標準，本研究采用兩種方法判定：一是根據(jù)標準人群維生素A缺乏篩查方法(WS/T 553—2017)中6歲以下兒童VitA營養(yǎng)狀態(tài)的判定方法，定義臍帶血血漿視黃醇濃度<0.35 μmol/L為VAD，0.35～<0.70 μmol/L為MVAD，≥0.70 μmol/L為充足[13]；二是將臍帶血血漿視黃醇濃度低于第10百分位數(shù)(0.62 μmol/L)定義為新生兒VitA相對缺乏，高者定義為充足。VitA胎盤轉運系數(shù)(VitA placental transport ratio，VitA-PTR)：新生兒與孕婦血漿視黃醇濃度比值[14]，作為衡量胎盤主動轉運VitA效率的指標。

1.5 統(tǒng)計學分析

孕婦及新生兒的視黃醇濃度等連續(xù)變量采用均數(shù)±標準差描述其平均水平，孕婦及新生兒VitA營養(yǎng)狀態(tài)等分類變量采用頻數(shù)和百分比描述。采用單因素和多因素Pearson相關探討孕婦與新生兒血漿VitA水平的相關性，采用多元分式多項式(multivariable fractional polynomials, MFP)模型探討兩者的劑量-反應關系，采用單因素和多因素Logistic回歸模型探討孕婦VitA營養(yǎng)狀態(tài)對新生兒VitA營養(yǎng)狀態(tài)的影響。采用MFP模型及單因素和多因素Spearman相關探討孕婦VitA水平與VitA-PTR的關系。多因素模型中調整的因素包括孕婦年齡、體重指數(shù)、貧血狀態(tài)、地區(qū)、職業(yè)、文化程度、分娩孕周和新生兒性別。數(shù)據(jù)分析使用R 3.5.0 統(tǒng)計軟件完成，雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基本情況

孕婦平均年齡為(23.7±3.7)歲，平均分娩孕周為(39.5±1.7)周，職業(yè)以農民為主(88.0%)，文化程度多為初中及以下 (80.4%)。孕晚期婦女視黃醇平均濃度為(1.15±0.30) μmol/L，VAD率為4.5%(31/688)， MVAD率為37.8%(260/688)。新生兒中男性占45.6%，早產(chǎn)兒占 4.2%。新生兒視黃醇平均濃度為(0.78±0.13) μmol/L，約為孕晚期婦女視黃醇濃度的68.0%，無VAD，MVAD率為28.2%(194/688)， 詳見表1。

表1 孕婦及新生兒的基本特征和血漿VitA水平

2.2 孕晚期婦女和新生兒血漿VitA水平的相關性

孕婦和新生兒VitA水平總體相關系數(shù)r=0.14(P<0.001)， 孕婦處于VAD狀態(tài)時二者相關性增強，呈中度相關(r=0.34，P=0.05，表2)。經(jīng)多因素調整后，總體相關系數(shù)變化不大(radj=0.13，P<0.01)， VAD孕婦與新生兒VitA水平相關系數(shù)進一步增大(radj=0.45，P=0.03)。

表2 孕晚期婦女和新生兒VitA水平Pearson相關分析

a,rdenotes Pearson correlation coefficient; b,radjdenotes Pearson correlation coefficient adjusted by multi-variables, including maternal age, body mass index at enrollment, hemoglobin level, county, occupation, education, gestational age at delivery and neonatal gender. VitA, vitamin A.

調整孕婦年齡等協(xié)變量后，孕婦與新生兒血漿VitA水平的MFP擬合模型為一階MFP，冪參數(shù)等于1，模型公式為：FP1=0.71+0.06X，其中X表示孕婦血漿視黃醇濃度(P<0.05)，其余變量均未能納入模型(P>0.05)。

模型提示孕婦與新生兒VitA水平呈正向線性劑量-反應關系(圖1)，孕婦視黃醇濃度每增加1 μmol/L，新生兒視黃醇濃度相應增加0.06 μmol/L(P<0.001)。

依據(jù)6歲以下兒童VitA缺乏的判定標準，與VitA充足組孕婦相比，VAD組(crudeOR=2.20，95%CI：1.04～4.66)和MVAD組孕婦(crudeOR=1.43，95%CI：1.01～2.02)分娩MVAD新生兒的發(fā)生風險顯著升高，經(jīng)多因素調整后，上述效應不具有統(tǒng)計學意義。以新生兒視黃醇濃度的第10百分位數(shù)為標準，與VitA充足組孕婦相比，VAD組孕婦分娩VitA相對缺乏新生兒的風險增加(crudeOR=3.02，95%CI：1.21～7.50)，多因素調整后該風險仍顯著增加(adjustedOR=2.76，95%CI：1.05～7.22)；孕婦MVAD組新生兒VitA相對缺乏風險未見顯著增加，詳見表3。

表3 孕婦VitA營養(yǎng)狀態(tài)對新生兒VitA缺乏的影響

a, marginal VitA deficiency was defined according to method for vitamin A deficiency screening (WS/T 553—2017) for children at or younger than 6 years; b,relative VitA deficiency was defined as values of cord blood plasma retinol concentration below the 10th percentile. VitA, vitamin A.

2.3 孕晚期婦女VitA水平和VitA-PTR的相關性

單因素(rs=-0.84，P<0.001)和多因素(rsadj=-0.82，P<0.001)Spearman相關分析結果均顯示VitA-PTR與孕婦VitA水平呈高度負相關。按孕婦VitA營養(yǎng)狀態(tài)分層分析發(fā)現(xiàn)，在孕婦VitA充足組和MVAD組，VitA-PTR與孕婦VitA水平呈負相關；在孕婦VAD組，兩者不再有顯著相關性。按新生兒VitA營養(yǎng)狀態(tài)分層分析發(fā)現(xiàn)，無論新生兒處于何種VitA營養(yǎng)狀態(tài)，孕婦VitA水平與VitA-PTR均存在高度負相關(表4)。

表4 孕晚期婦女VitA水平與VitA-PTR的Spearman相關

a,rsdenotes Spearman correlation coefficient; b,rsadjdenotes Spearman correlation coefficient adjusted by multi-variables, including maternal age, body mass index at enrollment, hemoglobin level, county, occupation, education, gestational age at delivery and neonatal gender.; c, first definition method was defined according to method for vitamin A deficiency screening (WS/T 553—2017) for children at or younger than 6 years; d, second definition method was defined as values of cord blood plasma retinol concentration below the 10th percentile. VitA, vitamin A; VitA-PTR, VitA placental transport ratio.

MFP模型進一步分析顯示，調整孕婦年齡等協(xié)變量后，孕婦血漿VitA水平與VitA-PTR的最佳FP擬合模型為一階FP，冪參數(shù)等于-0.5，模型公式為：FP1=-0.59+1.37X-0.5，其中X表示孕婦血漿視黃醇濃度(P<0.05)，其余變量均未能納入模型中(P>0.05)。

模型表明孕婦VitA水平與VitA-PTR呈負向非線性劑量-反應關系(圖2)，即VitA-PTR隨孕婦視黃醇濃度升高而下降，且下降速率逐漸變慢。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)中國北方農村地區(qū)孕晚期婦女和新生兒VitA缺乏率低，而邊緣性缺乏率較高；孕晚期婦女與新生兒的血漿VitA水平呈正向線性劑量-反應關系，孕晚期VitA缺乏可增加新生兒VitA相對缺乏的發(fā)生風險；孕婦血漿VitA水平與胎盤對VitA主動轉運能力呈負向非線性劑量-反應關系。

研究顯示孕晚期婦女視黃醇平均濃度為(1.15±0.30) μmol/L，VitA缺乏率近5%，邊緣缺乏率高達38%；新生兒臍帶血視黃醇平均濃度為(0.78±0.13) μmol/L，無VitA缺乏，邊緣缺乏率高達28%。胡貽椿等[15]研究顯示中國農村孕婦視黃醇濃度為1.53 μmol/L，略高于本研究結果，這可能與兩項研究中孕婦所處妊娠階段不同有關。本研究孕婦處于孕晚期，因孕婦血容量增大、胎兒VitA需求增加等原因，孕婦體內VitA水平降低[16]。本研究新生兒臍血血漿視黃醇濃度占孕婦靜脈血血漿視黃醇濃度的68%，與既往報道的50%～70%一致[9, 17-18]。

研究顯示孕晚期婦女靜脈血血漿與新生兒臍帶血血漿VitA水平呈正向線性劑量-反應關系(radj=0.13，P<0.01)，孕婦VitA缺乏狀態(tài)時相關性增強(radj=0.45，P=0.03)。國內外研究也證實孕婦和新生兒VitA水平存在弱但顯著的正相關關系(r2=0.27，P<0.001)[9, 19]，與本研究結果相似，另有研究顯示二者之間存在著正相關趨勢(r=0.15，P=0.06)[20]。在既往研究結果基礎上，本研究進一步利用MFP模型明確了孕晚期母血與新生兒臍帶血VitA水平間存在正向線性劑量-反應關系，為今后通過孕婦VitA水平預測新生兒VitA營養(yǎng)狀況提供了模型支持。目前僅有一項研究報道了母親VitA缺乏可增加新生兒VitA缺乏的發(fā)生風險(OR=4.79，95%CI：2.40～9.57)[18]，但該研究中孕婦與新生兒采用相同的VitA缺乏標準(VAD定義為血清視黃醇濃度<1.05 μmol/L)。本研究以臍帶血視黃醇濃度的第10百分位數(shù)為標準定義新生兒VitA相對缺乏，發(fā)現(xiàn)與VitA充足組孕婦相比，缺乏組孕婦分娩VitA相對缺乏新生兒的風險升高；而按人群維生素A缺乏篩查方法(WS/T 553—2017)中6歲以下兒童VitA營養(yǎng)狀況判定標準，缺乏組孕婦分娩VitA邊緣缺乏新生兒的風險未見顯著增高。兩種判定標準所得結果不完全相同，可能與樣本量有關，也可能因母體VitA缺乏可使新生兒VitA處于較低水平，如判定新生兒VitA相對缺乏所用的臍帶血視黃醇濃度第10百分位數(shù)為0.62 μmol/L，低于新生兒VitA邊緣缺乏判定界值0.70 μmol/L，這部分結果也提示有必要探索評價新生兒VitA營養(yǎng)狀態(tài)的適宜標準。

孕婦血液中的視黃醇以視黃醇-視黃醇結合蛋白的形式透過胎盤轉運至胎兒[11]。本研究發(fā)現(xiàn)VitA-PTR與孕晚期婦女血漿VitA水平呈非線性負相關關系(rsadj= -0.82，P<0.001)，即當母血視黃醇處于相對高濃度時，胎盤對視黃醇的轉運效率降低，而當母血視黃醇處于相對低濃度時，胎盤對視黃醇的轉運效率增加，以保持胎兒體內VitA水平相對穩(wěn)定。此外,VitA-PTR與母血VitA水平的相關系數(shù)隨臍帶血VitA營養(yǎng)狀態(tài)不同而發(fā)生變化，提示胎盤轉運能力可能受到母體與子代VitA水平的雙調控。動物實驗發(fā)現(xiàn)胎盤既能將母體視黃醇轉運給胎兒，亦能使胎兒視黃醇通過胎盤分泌進入母體循環(huán)[21]。胎盤VitA轉運能力受母子雙向調節(jié)利于維持胎兒體內VitA水平相對穩(wěn)定，以保障其正常生長發(fā)育。VitA-PTR僅體現(xiàn)胎盤轉運效率，有必要進一步收集胎盤標本并輔以動物實驗，明確VitA胎盤轉運和雙向調控的具體機制。

本研究定量分析了孕晚期婦女和新生兒血漿VitA水平的劑量-反應關系，定性分析了孕婦VitA營養(yǎng)狀態(tài)對新生兒VitA缺乏的影響，并探討了胎盤轉運效率在其中的可能機制，為相關后續(xù)研究和政策制定提供了數(shù)據(jù)支撐。本研究也有不足之處，樣本儲存時間略長，盡管在-80 ℃儲存條件下，視黃醇至少在5年內保持相對穩(wěn)定[22]，但不排除少量視黃醇分解的可能性。若母血和臍帶血視黃醇等量分解，則不會實質影響本研究的主要結果。