林 輝，張 錦，原倩宇，2，葉 靜，孫萬春，虞軼俊，俞巧鋼，馬軍偉，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 環(huán)境資源學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 3.浙江省耕地質(zhì)量與肥料管理總站，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肥料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(杭州)，浙江 杭州 310020)

設(shè)施栽培是我國蔬菜、瓜果等經(jīng)濟(jì)作物栽培的重要方式。隨著連作年限延長，設(shè)施蔬菜土壤環(huán)境惡化，土壤微生物區(qū)系失衡，土傳病害等發(fā)生日益嚴(yán)重，連作障礙現(xiàn)象普遍。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)是典型的土傳病害真菌，可引起100多種植物發(fā)生枯萎病。隨栽培年限增加，土壤中的尖孢鐮刀菌數(shù)量一般呈上升趨勢[1]。研究顯示，致病尖孢鐮刀菌增殖已成為設(shè)施連作中較為突出的問題之一，可導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至絕收[2]。因此，尋求高效、低成本且環(huán)境友好型的方法抑制尖孢鐮刀菌，改善土壤環(huán)境，對減輕設(shè)施土壤連作障礙具有重要意義。目前，在防治連作障礙、殺滅土傳病菌方面，研究人員提出了物理防治、化學(xué)防治、生物防治等多種手段，其中用生物菌劑進(jìn)行生物防治的方法受到了廣泛關(guān)注。此外，一些土壤調(diào)理劑的使用也可以達(dá)到降低土傳病害、減輕連作障礙的目的。例如，向土壤中施用生物炭可降低土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量，改善土壤微生物區(qū)系[3-5]。

在生物菌劑方面，部分木霉、枯草芽孢桿菌、角擔(dān)子菌屬真菌等被發(fā)現(xiàn)均有較好的尖孢鐮刀菌拮抗能力，在作物栽培上應(yīng)用后減少了蔬菜發(fā)病，增加了經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量[6-7]。其中，木霉菌被公認(rèn)為是一類普遍存在并具有重要經(jīng)濟(jì)意義的生防益菌，以其高效、安全、不易引起病原菌抗藥性的特點(diǎn)，在以可持續(xù)發(fā)展為宗旨的生物防治中發(fā)揮了重要作用[8]。大量國內(nèi)外研究也報(bào)道了木霉富集型生物有機(jī)肥(Trichoderma-enriched biofertilizer)在促進(jìn)作物生長、提高養(yǎng)分利用、抑制氧化亞氮等溫室氣體排放和助力化肥減量等方面的積極作用[9-10]。據(jù)報(bào)道，部分棘孢木霉(Trichodermaasperellum)添加到有機(jī)肥或者直接施用于土壤，可以防治枯萎病等植物病害[11-12]。但總的來看，現(xiàn)有的生物防治菌劑或多或少地仍存在一些問題，篩選、開發(fā)更多的候選微生物仍顯得非常迫切。棘孢木霉T-1具有產(chǎn)孢能力較強(qiáng)、pH耐受范圍較廣等特點(diǎn)。目前，關(guān)于棘孢木霉T-1的研究主要集中在其對木質(zhì)纖維素的降解上[13-15]：在餐廚-秸稈堆肥中接種棘孢木霉T-1，提高了垃圾中有機(jī)物的降解率(纖維素降解率最高可增長10%)，降低了垃圾堆肥中氮、磷等養(yǎng)分的損失，提高了堆肥產(chǎn)物的種子發(fā)芽率[16]，但棘孢木霉T-1的生物防治能力及其對土壤微生物的影響等還未明確。

泥炭、風(fēng)化煤等礦物腐殖質(zhì)是腐殖酸肥料的重要原料，也常用作生物有機(jī)肥的載體，這些風(fēng)化煤原料的粒度往往在100目以上。風(fēng)化煤等礦物腐殖質(zhì)中腐殖酸含量豐富，含有多種活性基團(tuán)，具有吸附、絡(luò)合、交換等性能，可通過改善土壤團(tuán)聚體質(zhì)量、提高土壤腐殖酸含量、增加土壤陽離子交換量等途徑來改良土壤[17]。武俊俊等[18]研究指出，以經(jīng)過簡單微生物處理的風(fēng)化煤作為長山藥的基肥，可增加土壤疏松度、地溫、活性物質(zhì)等，改善土壤理化性質(zhì)，有效促進(jìn)長山藥的出苗和生長，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。在水稻土中使用風(fēng)化煤可促進(jìn)水稻對N、P等養(yǎng)分的吸收，增強(qiáng)根系活力，提高產(chǎn)量[19]。超微粉腐殖質(zhì)是一種利用機(jī)械化學(xué)技術(shù)將泥炭、風(fēng)化煤等礦物腐殖質(zhì)研磨加工到粒度小于1 000目的超微細(xì)顆粒，成品為深褐色超微細(xì)粉末，其中，研磨細(xì)度達(dá)到納米級(jí)的腐殖質(zhì)也被稱為烏金散。研究表明，超細(xì)粉碎改變了煤粒表面親水基和疏水基的比例、電動(dòng)電位絕對值等各種表面性質(zhì)，對水溶性組分含量、腐植酸的析出性能等也有影響[20]。筆者所在課題組的前期研究也表明，超微粉加工提高了風(fēng)化煤的游離腐殖酸含量，粉碎粒度在100目左右的原料風(fēng)化煤中可溶性腐殖酸含量為46%，而超微粉腐殖質(zhì)中可溶性腐殖酸含量增加到了76%。由此推測，超微粉腐殖質(zhì)對土壤的調(diào)理作用可能與未經(jīng)加工處理的腐殖質(zhì)原料存在差異。但無論是礦物腐殖質(zhì)原料還是超微粉腐殖質(zhì)，均未見深入探討其對土壤病原菌或微生物區(qū)系影響的研究。

針對以上背景，本文以棘孢木霉T-1和超微粉腐殖質(zhì)為對象，研究二者單一和復(fù)合使用下對連作土壤微生物區(qū)系的影響，尤其是對典型土傳病菌——尖孢鐮刀菌的影響，以期為進(jìn)一步研發(fā)蔬菜土傳病害預(yù)防、控制材料和方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(F.oxysporumf. sp.cucumberium，F(xiàn)OC)、尖孢鐮刀菌西瓜?；?F.oxysporumf. sp.niveum，F(xiàn)ON)和尖孢鐮刀菌萎蔫專化型(F.oxysporumf. sp.vasinfectum，F(xiàn)OV)，均購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。棘孢木霉T-1為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 試驗(yàn)土壤

試驗(yàn)土壤采集自寧波某設(shè)施蔬菜大棚。土壤理化性質(zhì)如下：含水率17.9%，pH值5.67，電導(dǎo)率(EC)1.40 mS·cm-1，有機(jī)質(zhì)含量6.00%，總氮含量0.442%，有效磷含量151.52 mg·kg-1，速效鉀含量11.1 mg·kg-1，陽離子交換量17.89 cmol(+)·kg-1。

1.1.3 棘孢木霉T-1菌劑

將棘孢木霉T-1菌株斜面保藏物接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板，置于28 ℃培養(yǎng)4 d，直至形成大量孢子，采用無菌水(含有0.1%吐溫80)將孢子和菌絲洗下，平板培養(yǎng)法測定活菌數(shù)，通過稀釋將活菌數(shù)保持在1×108mL-1，作為待接種的液體菌劑備用。

1.1.4 超微粉腐殖質(zhì)

超微粉腐殖質(zhì)取自浙江豐瑜生態(tài)科技有限公司，原料為風(fēng)化煤，通過機(jī)械超細(xì)粉加工技術(shù)研磨到超微細(xì)顆粒，粒度<1 000目，成品為深褐色超微細(xì)粉末，腐殖質(zhì)含水量19%，有機(jī)質(zhì)含量90%，pH值5.2，EC 1.45 mS·cm-1，總氮0.86%。將棘孢木霉T-1液體菌劑與超微粉腐殖質(zhì)按照體積質(zhì)量比1∶2混勻，低溫烘干，即為腐殖質(zhì)-T1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 平皿對峙培養(yǎng)

以尖孢鐮刀菌(含F(xiàn)OC、FON、FOV)為抑制對象，采用平板對峙試驗(yàn)，分析棘孢木霉的抑菌活性。在直徑為9 cm的PDA平板一側(cè)接種直徑為5 mm的病原真菌菌絲塊，在另一側(cè)接種棘孢木霉T-1，25 ℃共培養(yǎng)，以僅接種尖孢鐮刀菌的平板為對照，定期觀察棘孢木霉對尖孢鐮刀菌的抑制作用，記錄菌落生長直徑和相互作用情況，觀察菌株之間的拮抗效果，計(jì)算平皿抑菌率。

1.2.2 微宇宙土壤培養(yǎng)試驗(yàn)

開展室內(nèi)土壤培養(yǎng)。共設(shè)4個(gè)處理：CK-S，空白處理；TS1，超微粉腐殖質(zhì)添加量1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；TS2，棘孢木霉T-1菌劑添加量0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；TS3，腐殖質(zhì)-T1添加量1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。在250 mL培養(yǎng)瓶中裝入50 g新鮮土樣，放在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相對濕度為75%，定期補(bǔ)充水分。隔一段時(shí)間進(jìn)行1次采樣，共采樣3次。

1.2.3 黃瓜盆栽試驗(yàn)

采用圓形塑料盆開展盆栽試驗(yàn)。塑料盆直徑17 cm，高12 cm(內(nèi)尺寸)，裝干土2 kg。盆栽植物為黃瓜(銀胚99)。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理：CK-C，空白處理；TC1，超微粉腐殖質(zhì)添加量1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；TC2，腐殖質(zhì)-T1添加量1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。將不同處理的添加物與土壤混勻，裝盆，澆透水，及時(shí)補(bǔ)充水分。精選大小一致、健壯的黃瓜種子于50 ℃熱水浸泡15 min，接著在常溫水里浸泡6 h，之后放在室內(nèi)24 h，最后將露白的種子播種到育苗盤中。當(dāng)黃瓜幼苗長到三葉期時(shí)，選取大小一致的黃瓜幼苗播種于盆栽中，每盆3顆幼苗，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。盆栽放在溫室內(nèi)培養(yǎng)，溫度22～28 ℃，相對濕度為60%～70%。每天澆水1次，隔1 d拍照記錄1次，每隔幾天進(jìn)行一次土壤采樣，共采樣3次。

1.3 檢測方法

1.3.1 土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量測定

采用MP FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒提取土壤基因組DNA。引物(10 mmol·L-1)名稱及其序列如下：AFP308R，CGAATTAACGCGAGTCCCAAC；ITS1-F，CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA[21]。采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的2×EasyTaqPCR SuperMix試劑盒對土壤基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，確定片段大小與待測基因基本一致后，將獲得的PCR產(chǎn)物重組到pMD19-T質(zhì)粒上，委托生工生物工程(上海)股份有限公司對質(zhì)粒上的基因片段進(jìn)行測序驗(yàn)證。將測序驗(yàn)證正確的尖孢鐮刀菌基因片段重組質(zhì)粒作為定量PCR(qPCR)的標(biāo)準(zhǔn)品，用于建立質(zhì)?？截悢?shù)與CT值(即PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用Qubit 3.0熒光計(jì)對質(zhì)粒DNA濃度進(jìn)行測定，隨后通過計(jì)算可以獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。qPCR擴(kuò)增在ABI公司的StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，擴(kuò)增試劑采用寶生物工程(大連)有限公司(Takara)提供的MightyAmpTMfor Real-time PCR Kit試劑盒，選用20 μL的反應(yīng)體系：模板DNA 2 μL，2 ×MightyAmp for Real Time (SYBR plus) 10 μL，引物各0.4 μL(10 μmol· L-1)，ROX reference Dye (50×) 0.4 μL，超純水補(bǔ)齊至20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)采用3步法：預(yù)變性98 ℃ 2 min；變性98 ℃ 10 s，58 ℃退火15 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線(melting curve stage)。采用的qPCR方法可保證待測樣品的熔解曲線為單一峰，擴(kuò)增特異性良好，并且和標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的DNA熔解溫度(Tm)。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好(決定系數(shù)R2>0.99)，擴(kuò)增效率較高(90%～110%)。通過獲得的土壤中尖孢鐮刀菌的絕對拷貝數(shù)(以單位質(zhì)量干土計(jì))計(jì)算抑菌率。

1.3.2 土壤中棘孢木霉活菌數(shù)測定

取新鮮或冷藏土樣5 g，加入45 mL無菌水，配制成土壤懸浮液(稀釋度為10-1)，180 r·min-1振蕩60 min，使微生物均勻分散，靜置后吸取上層清液依次進(jìn)行10倍梯度的稀釋，不同稀釋度的土壤懸浮液各取100 μL，涂抹于分離棘孢木霉菌的選擇性培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)5～7 d，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，選取合適的稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)，每處理重復(fù)3次。

棘孢木霉選擇性培養(yǎng)基TSM[22-23]：MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.9 g，KCl 0.15 g，NH4NO31.0 g，孟加拉紅0.15 g，葡萄糖 3.0 g， 瓊脂20 g，115 ℃ 滅菌30 min。使用前先將培養(yǎng)基冷卻到60 ℃，加入無菌的氯霉素0.25 g、對二甲基氨基苯重氮磺酸鈉0.3 g、五氯硝基苯0.2 g。

1.3.3 土壤中真菌、細(xì)菌和放線菌數(shù)量測定

取新鮮或冷藏土樣5 g，加入45 mL無菌水，配制成土壤懸浮液(稀釋度為10-1)，180 r·min-1振蕩60 min，使微生物均勻分散，靜置后吸取上層清液依次進(jìn)行10倍梯度的稀釋，不同稀釋度的土壤懸浮液各取100 μL，涂布于不同培養(yǎng)基上。采用稀釋平板法，使用選擇性培養(yǎng)基分別測定土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量：細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌用孟加拉紅培養(yǎng)基，放線菌用高氏1號(hào)培養(yǎng)基。25 ℃ 恒溫黑暗培養(yǎng)一定時(shí)間后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，選取合適的稀釋度進(jìn)行試驗(yàn)計(jì)數(shù)，每處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，對有顯著(P<0.05)差異的，采用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘孢木霉T-1對不同尖孢鐮刀菌的拮抗效果

如圖1所示，棘孢木霉T-1的生長速度明顯快于尖孢鐮刀菌，可抑制各種類型尖孢鐮刀菌的生長。其中，T-1對FON的抑制效果最佳，培養(yǎng)7 d的平皿抑菌率為74.5%，而對FOC和FOV的抑制效果略差，培養(yǎng)7 d的平皿抑菌率分別為59.5%和68.2%。

2.2 室內(nèi)土壤培養(yǎng)下不同處理對連作土壤微生物群落的影響

2.2.1 尖孢鐮刀菌

圖1 平板對峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Plate confrontation assays of strain T-1

如圖2所示，添加超微粉腐殖質(zhì)(TS1)、棘孢木霉T-1菌劑(TS2)與腐殖質(zhì)-T1(TS3)的處理均能抑制連作障礙土壤的尖孢鐮刀菌數(shù)量，各處理組的尖孢鐮刀菌絕對拷貝數(shù)顯著(P<0.05)下降，13 d時(shí)各處理對土壤尖孢鐮刀菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率在68.7%～90.4%。相比單獨(dú)添加超微粉腐殖質(zhì)或棘孢木霉T-1，腐殖質(zhì)-T1的抑菌效果更佳，TS3處理4 d和13 d對尖孢鐮刀菌的抑制率分別為78.9%和90.4%，而相同時(shí)間點(diǎn)TS1和TS2處理的的抑菌率分別為34.9%～41.1%和68.7%～74.2%。此外，TS1和TS2處理對連作土壤尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響無顯著差異。綜上，超微粉腐殖質(zhì)和棘孢木霉T-1菌劑復(fù)配使用對尖孢鐮刀菌的抑制具有協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)。

2.2.2 可培養(yǎng)微生物

圖2 不同處理下連作障礙土壤中尖孢鐮刀菌的絕對拷貝數(shù)Fig.2 Absolute copy number of F. oxysporum in continuous cropping soil under different treatments

由表1可知，相較于對照(CK-S)，向未栽培作物的連作土壤模擬生態(tài)系統(tǒng)中添加超微粉腐殖質(zhì)(TS1)、棘孢木霉T-1菌劑(TS2)和腐殖質(zhì)-T1(TS3)均未對土壤細(xì)菌數(shù)量產(chǎn)生顯著影響，表明3種添加劑對土壤細(xì)菌生長的干擾較小。從添加后4 d的數(shù)據(jù)來看，添加超微粉腐殖質(zhì)顯著(P<0.05)降低了土壤中的真菌數(shù)量，但抑制作用較為短暫。添加棘孢木霉T-1菌劑和腐殖質(zhì)-T1的土壤中的真菌數(shù)量在27 d時(shí)顯著(P<0.05)高于對照(CK-S)土壤和單獨(dú)添加超微粉腐殖質(zhì)的土壤，該現(xiàn)象可能與TS2和TS3處理中棘孢木霉T-1在土壤中的定殖有關(guān)。此外，棘孢木霉T-1菌劑和腐殖質(zhì)-T1還短暫(3 d)促進(jìn)了土壤中放線菌的生長，但在13 d和27 d時(shí)不同處理土壤中的放線菌數(shù)量均無顯著差異。

2.2.3 棘孢木霉T-1

由圖3可知，對照(CK-S)和添加腐殖質(zhì)(TS1)的土壤中均未檢出木霉菌，而添加棘孢木霉T-1菌劑(TS2)和腐殖質(zhì)-T1(TS3)的土壤中檢出2×104g-1以上的棘孢木霉，并隨著時(shí)間延長，其數(shù)量先增加后下降，有效活菌數(shù)在13 d時(shí)達(dá)到高峰。

2.3 盆栽條件下不同處理的試驗(yàn)效果

2.3.1 對黃瓜生長及其枯萎病防治效果的影響

如表2所示，在黃瓜栽培前向土壤中施用超微粉腐殖質(zhì)(TC1)或腐殖質(zhì)-T1(TC2)均可增強(qiáng)黃瓜的抗病能力，降低病死株數(shù)量，促進(jìn)黃瓜生長，且以腐殖質(zhì)-T1的促黃瓜幼苗生長和抗病效果最佳。與施用超微粉腐殖質(zhì)相比，施用腐殖質(zhì)-T1的黃瓜葉片更強(qiáng)壯、更綠(圖4)。

表1 室內(nèi)土壤培養(yǎng)下不同處理土壤中真菌、放線菌和細(xì)菌數(shù)量

Table 1 Cultivable number of fungi， actinomycetes and bacteria in soils under soil microcosm conditions

采集時(shí)間Sampling time/d細(xì)菌Bacteria/(107CFU·g-1)CK-STS1TS2TS3真菌Fungi/(104 g-1)CK-STS1TS2TS3放線菌Actinomycetes/(106 g-1)CK-STS1TS2TS341.4 a2.0 a1.5 a1.6 a4.2 a0.7 b8.1 a5.7 a2.8 b3.2 b3.9 ab4.5 a131.9 a1.4 a1.8 a1.2 a29.4 a21.7 a20.1 a23.1 a3.7 a2.7 a2.8 a2.7 a271.5 a1.7 a1.4 a2.0 a3.0 b4.1 b9.6 a7.5 a3.0 a2.8 a2.2 a2.6 a

相同時(shí)間不同處理下同一類別微生物數(shù)量無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。表3同。

Data marked without the same letters of the same microbial community indicated significant (P<0.05) difference within treatments at the same time. The same as in Table 3.

圖3 不同處理下連作障礙土壤中棘孢木霉T-1數(shù)量Fig.3 Number of Trichoderma asperellum T-1 in continuous cropping soil under different treatments

表2 黃瓜幼苗移栽10天后的病死率

Table 2 Mortality rate of cucumber seedlings after 10 days of transplanting

處理Treatment病株(不含死株)Sick plant(no dead plants)/%死株Deadplants/%總病死率Total mortalityrate/%CK-C6.746.753.4TC113.320.033.3TC206.76.7

2.3.2 對土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量的影響

采集黃瓜苗移栽4、13、27 d的土壤樣品，其中尖孢鐮刀菌的數(shù)量變化如圖5所示?？芍?，施用超微粉腐殖質(zhì)(TC1)或腐殖質(zhì)-T1(TC2)均能有效抑制黃瓜土壤中的尖孢鐮刀菌，且腐殖酸-T1

圖4 不同處理下黃瓜幼苗移栽2周后的生長情況Fig.4 Growth of cucumber seedlings under different treatments after transplanting for 2 weeks

圖5 黃瓜盆栽下不同處理土壤的尖孢鐮刀菌數(shù)量Fig.5 Number of F. oxysporum in cucumber potting soils under different treatments

的抑菌效果優(yōu)于超微粉腐殖質(zhì)，在27 d觀察期內(nèi)，TC2處理的抑菌率穩(wěn)定在72%～80%，而TC1處理的抑菌率從59.6%降至17.3%。盆栽試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，超微粉腐殖質(zhì)和木霉T-1菌劑復(fù)配使用可以有效抑制土壤中尖孢鐮刀菌的增殖。

2.3.3 對土壤可培養(yǎng)微生物群落和棘孢木霉數(shù)量的影響

從表3可以看出，相同時(shí)間不同處理盆栽土壤的細(xì)菌數(shù)量無顯著差異，與室內(nèi)土壤培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果一致，說明施用超微粉腐殖質(zhì)或腐殖質(zhì)-T1并不會(huì)對土壤細(xì)菌產(chǎn)生顯著影響。施用超微粉腐殖質(zhì)(TC1)或腐殖質(zhì)-T1(TC2)有助于增加黃瓜栽培過程中土壤放線菌數(shù)量，其中，分別在4 d和21 d時(shí)，TC1和TC2處理與CK-C的土壤放線菌數(shù)量差異達(dá)到了顯著水平(P<0.05)。施用超微粉腐殖質(zhì)(TC1)或腐殖質(zhì)-T1(TC2)改變了土壤真菌數(shù)量的變化趨勢：對照(CK-C)的土壤真菌數(shù)量隨時(shí)間增加而下降，而TC1和TC2的土壤真菌數(shù)量卻隨時(shí)間延長先增加后下降。4 d時(shí)，施用超微粉腐殖質(zhì)的處理顯著(P<0.05)降低了土壤中的真菌數(shù)量，但抑制作用較為短暫；13 d時(shí)，施用腐殖質(zhì)-T1的土壤中真菌數(shù)量顯著(P<0.05)高于其他處理，而另2個(gè)處理的土壤真菌數(shù)量已無顯著差異；21 d時(shí)，3個(gè)處理的土壤真菌數(shù)量均無顯著差異。進(jìn)一步測定TC2處理土壤中的棘孢木霉數(shù)量，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量變化趨勢與真菌完全一致，推測栽培13 d時(shí)TC2處理土壤中真菌數(shù)量的顯著增加與外源棘孢木霉的定殖有關(guān)。

表3 盆栽條件下不同處理土壤中真菌、放線菌和細(xì)菌數(shù)量

Table 3 Number of fungi， actinomycetes and bacteria in cucumber potting soils under different treatments

采集時(shí)間Sampling time/d細(xì)菌Bacteria/(106 CFU g-1)CK-CTC1TC2真菌Fungi/(104 g-1)CK-CTC1TC2放線菌Actinomycetes/(105 g-1)CK-CTC1TC245.7 a4.0 a5.9 a7.5 a3.7 b8.9 a11.1 b19.8 a19.4 a1315.0 a13.7 a12.5 a6.0 b8.9 b18.9 a19.5 a24.6 a21.2 a2721.7 a19.3 a18.3 a2.3 a1.4 a1.2 a5.5 b10.1 a14.9 a

圖6 TC2處理土壤中棘孢木霉T-1數(shù)量變化Fig.6 Number of Trichoderma asperellum T-1 in soils under TC2 treatment

3 討論

在連作障礙土壤中，微生物種群失衡現(xiàn)象非常常見。在連作生產(chǎn)條件下，改變土壤微生物種群結(jié)構(gòu)，降低尖孢鐮刀菌等土傳病害菌數(shù)量，營造健康的土壤微生物環(huán)境是解決連作障礙的重要途徑之一。在一般情況下，細(xì)菌真菌比值較高的土壤肥力更高，抑病能力更強(qiáng)。在以往改善連作障礙的相關(guān)研究中[24-26]，尖孢鐮刀菌等病原真菌數(shù)量的顯著減少往往伴隨著土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量、比例的顯著增加，以及真菌數(shù)量比例的明顯下降。在本研究中，棘孢木霉T-1、超微粉腐殖質(zhì)及其復(fù)配物均被證實(shí)可改善連作土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)，施用于常年蔬菜連作的土壤能抑制尖孢鐮刀菌生長，增加土壤放線菌數(shù)量，且不影響土壤細(xì)菌繁殖，黃瓜盆栽試驗(yàn)和土壤培養(yǎng)試驗(yàn)的結(jié)果基本一致，其中，超微粉腐殖質(zhì)和棘孢木霉T-1復(fù)配物的效果最佳，能提高黃瓜的抗病和生長性能。

棘孢木霉對黃瓜?；图怄哏牭毒囊种菩?yīng)在以往的報(bào)道中多有涉及，如張春秋等[27]篩選的棘孢木霉525、賀字典等[7]研究的棘孢木霉菌肥等。棘孢木霉T-1在木質(zhì)纖維素降解方面具有優(yōu)勢，可作為微生物菌劑促進(jìn)農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的降解和肥料化[16]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，棘孢木霉T-1還具有防治土傳病害的能力，并發(fā)現(xiàn)其施用能夠促進(jìn)連作土壤上黃瓜的生長。棘孢木霉生物農(nóng)藥、生物殺菌劑產(chǎn)品一直受到各方面的關(guān)注和歡迎。棘孢木霉T-1的生物質(zhì)分解能力和植物病原菌拮抗功能使其具備發(fā)展成為生物有機(jī)肥生產(chǎn)菌種的潛能：一方面，T-1可以用于促進(jìn)木質(zhì)纖維素類廢棄物的降解和腐殖化；另一方面，T-1在物料中的定殖可賦予發(fā)酵產(chǎn)物一定的生物防治能力，有利于實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的高值資源化。在本研究檢索范圍內(nèi)，還未見到關(guān)于棘孢木霉防治西瓜枯萎病或棉花枯萎病的研究報(bào)道。本研究顯示，棘孢木霉T-1除了能拮抗尖孢鐮刀菌黃瓜專化型，對萎蔫專化型和西瓜?；鸵簿哂修卓鼓芰?，暗示其有望同時(shí)應(yīng)用于西瓜或棉花枯萎病的防治。

風(fēng)化煤作為土壤調(diào)理劑已被證實(shí)具有改良土壤理化性狀、增加土壤腐殖質(zhì)、提高作物產(chǎn)量品質(zhì)等作用[17-18]，與傳統(tǒng)的風(fēng)化煤原料相比，超微粉加工后的風(fēng)化煤在性質(zhì)上有一定的改變，如游離腐殖酸含量增加等。本研究發(fā)現(xiàn)，以風(fēng)化煤為原料的超微粉腐殖質(zhì)具有一定的抑制土壤尖孢鐮刀菌生長、提高黃瓜抗病能力的作用。金平等[28]研究發(fā)現(xiàn)，腐殖酸可以作為農(nóng)藥增效劑來提高黃瓜的抗病能力。我們推測，超微粉腐殖質(zhì)對土壤尖孢鐮刀菌的抑制作用及其對黃瓜的促生長能力可能與其高含量的腐殖酸有關(guān)。此外，超微粉腐殖質(zhì)施用后土壤中有機(jī)質(zhì)含量的增加可能也是其改良連作土壤微生態(tài)的重要途徑。要特別指出的是，超微粉腐殖質(zhì)呈酸性，因此更適用于堿性較強(qiáng)的土壤，如鹽堿土的改良修復(fù)。

在實(shí)際生產(chǎn)中，單獨(dú)試驗(yàn)生防菌的防治效果結(jié)果往往不穩(wěn)定，影響其推廣和應(yīng)用。目前，將生防菌同有機(jī)肥相結(jié)合使用是主要的發(fā)展趨勢。谷祖敏等[29]報(bào)道了香菇菌糠對綠色木霉防治黃瓜枯萎病的增效作用，二者混合使用提高了綠色木霉在土壤中的定殖，土壤中枯萎病菌數(shù)量減少56.9%～77.7%，增效顯著。本研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉T-1和超微粉腐殖質(zhì)復(fù)配具有協(xié)同增效作用，其對土壤尖孢鐮刀菌的抑制作用更持久，對土壤放線菌的促進(jìn)作用更強(qiáng)，添加后黃瓜的生長性能和抗病能力更高。超微粉腐殖質(zhì)對土壤真菌的抑制效果顯著，推測可能是通過廣譜性的抑菌行為降低了土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量。生防木霉對尖孢鐮刀菌的抑制效用有一定的針對性和靶向性。研究指出，生防木霉與尖孢鐮刀菌在土壤中的生長繁殖一般呈負(fù)相關(guān)，生防木霉數(shù)量的增加往往伴隨著尖孢鐮刀菌數(shù)量的下降[7]。綜合以上信息推測，超微粉腐殖質(zhì)和棘孢木霉T-1的協(xié)同增效作用與二者不同的生防機(jī)制有極大相關(guān)性。此外，我們認(rèn)為超微粉腐殖質(zhì)和棘孢木霉T-1存在明顯的互作行為，并且二者通過互作實(shí)現(xiàn)了抑菌和促生長的協(xié)同增效。在一些與微生物菌劑相關(guān)的專利中常發(fā)現(xiàn)風(fēng)化煤的添加，據(jù)此我們認(rèn)為，超微粉腐殖質(zhì)與棘孢木霉T-1復(fù)配的協(xié)同增效作用可能還與前者可以作為微生物的吸附載體，并可以提供養(yǎng)分有關(guān)。載體的存在可以增加菌種的存活率和穩(wěn)定性，而外源養(yǎng)分對于提高棘孢木霉T-1在土壤中競爭營養(yǎng)和浸染位點(diǎn)的能力具有重要作用[29]，這一推測的直接證據(jù)是，本研究發(fā)現(xiàn)超微粉腐殖質(zhì)促進(jìn)了棘孢木霉T-1在土壤中的生長和定殖。此外，微生物已被證實(shí)在風(fēng)化煤等礦物腐殖質(zhì)的降解和活化中具有重要作用[30]。Namasivayam等[31]研究表明，生防綠色木霉通過溶解褐煤釋放腐殖酸，獲得的腐殖酸添加到高粱栽培土壤中大幅促進(jìn)了高粱生長，且效果優(yōu)于人工合成的腐殖酸。因此，棘孢木霉的生長代謝還可能促進(jìn)超微粉腐殖質(zhì)中活性物質(zhì)，如腐殖酸的快速活化釋放，從而進(jìn)一步增強(qiáng)超微粉腐殖質(zhì)對土壤的改良效果和對植物的促生長作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉T-1、超微粉腐殖質(zhì)及其復(fù)配物(腐殖質(zhì)-T1)均能抑制連作土壤中尖孢鐮刀菌的生長，其中，腐殖質(zhì)-T1的抑菌作用最佳，在室內(nèi)土壤培養(yǎng)條件下，腐殖質(zhì)-T1處理的尖孢鐮刀菌抑菌率達(dá)68.7%～90.4%，在黃瓜盆栽條件下，前13 d的抑菌率均保持在70%以上。黃瓜盆栽試驗(yàn)還表明，施用腐殖質(zhì)-T1復(fù)配物有效降低了黃瓜病死株數(shù)量，表現(xiàn)出促生長效應(yīng)。研究成果可為設(shè)施連作土壤調(diào)理和土傳病害防治提供材料與技術(shù)參考，其中，棘孢木霉T-1和超微粉腐殖質(zhì)復(fù)配物具有較高的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。