張譽(yù)丹 毛劍琴 袁林 袁德培

摘要 目的：通過觀察固本健腦液對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶、生物鐘基因及海馬Aβ含量的影響，探索該方改善學(xué)習(xí)記憶和睡眠障礙的可能機(jī)制。方法：實驗大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、藥物高、中、低劑量組。自主活動分析儀檢測各組大鼠的自主活動情況;Morris水迷宮檢測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力;ELISA檢測大鼠海馬Aβ1-40和Aβ1-42含量;免疫組化檢測SCN中Bmal1和Clock的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：自主活動結(jié)果顯示模型組大鼠活動時間較空白組呈現(xiàn)出顯著的增加（P<0.01）;各給藥組出現(xiàn)活動時間減少（P<0.05）。Morris水迷宮結(jié)果顯示，模型組大鼠較空白組逃避潛伏期顯著延長，目標(biāo)象限游泳時間百分比顯著下降（P<0.01）;各觀察組逃避潛伏期顯著縮短，目標(biāo)象限游泳時間百分比顯著上升（P<0.01，P<0.05）;ELISA結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬Aβ1-40和Aβ1-42含量較空白組顯著增多（P<0.01），固本健腦液中、高劑量組海馬Aβ1-40和Aβ1-42含量顯著下降（P<0.01）。免疫組化結(jié)果：模型組大鼠SCN中Bmal1和Clock表達(dá)水平較空白組下降（P<0.01），給藥后，各組大鼠SCN中Bmal1和Clock表達(dá)上升（P<0.05）。結(jié)論：結(jié)果顯示AD大鼠存在一定程度的晝夜節(jié)律紊亂且生物鐘節(jié)律基因表達(dá)降低，固本健腦液干預(yù)后可改善癡呆大鼠的晝夜節(jié)律紊亂及海馬Aβ的異常表達(dá)，其機(jī)制則可能與固本健腦液上調(diào)Bmal1、Clock表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 固本健腦液;阿爾茲海默癥（AD）;Bmal1基因;Clock基因;β-淀粉樣蛋白（Aβ）

Effect of Root-Securing and Brain-Fortifying Liquid（RSBFL）on Bmal1，Clock in Hypothalamus and Aβ in Hippocampus of Alzheimer′s Disease Rats

ZHANG Yudan1，MAO Jianqin2，YUAN Lin2，YUAN Depei1

（1 School of Basic Medical Sciences，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China; 2 Hubei Minzu University for Medical Department/ Hubei University for Nationalities Rheumatic Disease Occurrence and Intervention Hubei Provincial Key Laboratory，Enshi 445000，China）

Abstract Objective：To explore the possible mechanisms of improving learning and memory and sleep disorders were explored by observing the effects of Root-Securing and Brain-Fortifying Liquid（RSBFL）on learning and memory，biological clock gene and the content of hippocampal Aβ in AD model rats.Methods：The rats were randomly divided into a normal group，a model group，a high，a medium and a low dose groups.The autonomic activity of rats in each group was detected by autonomic activity analysis system.Morris water maze was used to test the learning and memory ability of rats in each group.ELISA was used to detect the contents of Aβ1-40and Aβ1-42 in the hippocampus of rats.Immunohistochemistry was used to detect the protein expression levels of Bmal1 and Clock in SCN.Results：The results of autonomic activity showed that compared with the normal group，the activity time of rats in the model group increased significantly（P<0.01）; compared with the model group，the activity time of rats in each drug group decreased to different degrees（P<0.05）.Morris water maze results showed that compared with the blank control group，the escape latency period of rats in the model group was significantly prolonged，and the percentage of target quadrant swimming time was significantly decreased，with statistically significant differences（P<0.01）; compared with the model group，the evasive incubation period of each treatment group was significantly shortened，and the percentage of target quadrant swimming time was significantly increased，with statistically significant differences（P<0.01，P<0.05）.ELISA results showed that compared with the blank control group，the contents of Aβ1-40and Aβ1-42 in hippocampus were significantly increased in the model group（P<0.01）.Compared with the model group，the contents of Aβ1-40and Aβ1-42 in hippocampus of rats in the medium and high dose RSBFL groups decreased significantly（P<0.01）.Immunohistochemical detection results：the expression levels of Bmal1 and Clock in SCN of rats in the model group decreased（P<0.01）compared with that in the blank control group.After administration，HE expression levels of Bmal1 and Clock in SCN of rats in each group increased（P<0.05）.Conclusion：The results of this study show the AD model rats had a certain degree of circadian rhythm disorder and the expression of circadian rhythm gene was decreased.The intervention of RSBFL can improve circadian rhythm disorders and abnormal expression of Aβ in hippocampus of dementia rats，and the mechanism may be related to the upregulation of Bmal1 and Clock expression of RSBFL.

Keywords Root-Securing and Brain-Fortifying Liquid（RSBFL）; Alzheimer′s disease（AD）; Bmal1gene; Clock gene; β-amyloid（Aβ）

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.23.016

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s Disease，AD）又叫老年性癡呆，是一種退行性腦部疾病，普遍認(rèn)為是海馬型遺忘綜合征，是癡呆癥最常見的病因，在全球范圍內(nèi)占癡呆病例的50%～75%[1-2]。隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加快，老年性癡呆的發(fā)病率呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢，不僅成為一個廣泛關(guān)注的社會問題，同時也為家庭帶來異常沉重的負(fù)擔(dān)，研究表明[3]，不同程度的晝夜節(jié)律紊亂在AD患者和相關(guān)AD動物模型中均有體現(xiàn)，其中就表現(xiàn)為睡眠-覺醒節(jié)律紊亂以及靜息-活動節(jié)律紊亂，同時也表現(xiàn)出機(jī)體的一些激素方面的晝夜節(jié)律紊亂;同時也有研究指出存在于AD患者中的長期晝夜節(jié)律紊亂也可導(dǎo)致AD的病理進(jìn)程加快，已證實約有44%的阿爾茨海默病患者伴有睡眠障礙[4]。而導(dǎo)致這一結(jié)果的發(fā)生正是由于隨著機(jī)體的衰老進(jìn)程加快，往往最先表現(xiàn)出的病理狀態(tài)就是晝夜節(jié)律的受累，因此這種與AD伴發(fā)的睡眠障礙在AD的發(fā)病過程中表現(xiàn)尤為突出[5]。因此，實驗基于生物鐘基因Bmal1、Clock的生物學(xué)效應(yīng)，建立AD大鼠模型，并通過中藥固本健腦液予以干預(yù)，以期探討固本健腦液改善AD模型大鼠的晝夜節(jié)律紊亂與調(diào)節(jié)生物鐘節(jié)律基因有密切關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 50只SPF級雄性SD大鼠（海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK（瓊）2019-0006），體質(zhì)量220～250 g。在常規(guī)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。該實驗經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：2019-009）。

1.1.2 藥物 固本健腦液是由板橋黨參15 g、枸杞子15 g、茯苓15 g、酸棗仁12 g、山楂12 g組成，加入6倍量水后煎煮2次，濾出藥液后將2次藥液混合，加熱濃縮成藥液濃度分別含生藥2.5、1.25、0.625 g/mL的水煎液，保存于4 ℃冰箱，備用。

1.1.3 試劑與儀器 Aβ1-40（Sigma公司，美國，貨號：A9810-0）、ELISA檢測試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，貨號：SE0105-96]、Bmal1、Clock均為兔抗鼠抗體（購自Santa公司，美國，批號分別為：sc365645、sc271603）;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1054），ZH-ZH型自主活動測試儀（安徽淮北正華，型號：ZH0065）、電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號：BS110S）、冷凍離心機(jī)（Beckman公司，美國，型號：CS-15R）、BCD冰箱（深圳市寶安區(qū)沙井廣氏電器廠，型號：BCD-629WDEYU1）、

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 50只實驗用SPF級雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為空白對照組、模型組、固本健腦液低、中、高劑量組。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白對照組外，其余各組建立AD模型，具體方法如下：大鼠稱重后，用100%異氟醚吸入麻醉大鼠，然后將其置于腦立體定向儀上，用外科剪刀刮掉頭頂?shù)拿?，并用碘伏消毒，再把一次性手術(shù)毛巾蓋在頭上。用手術(shù)刀和剪刀沿顱骨正中切開一道口子，分離皮下組織和筋膜，用無菌干棉擦拭頭蓋骨止血，并用記號筆在前庭作記號。以腦立體定位儀為參照，零點標(biāo)記在前囟“十”字縫中心，矢狀線左右各3 mm處，正中線后4 mm處，做好位置標(biāo)記，鉆孔后使用微量進(jìn)樣器吸取2 μL Aβ1-42，注射進(jìn)孔后留針2 min，后緩慢拔出針頭，對側(cè)操作相同。操作結(jié)束后，縫合創(chuàng)口并用碘伏消毒，后涂抹紅霉素軟膏，此后連續(xù)3 d肌注10萬單位青霉素預(yù)防感染，記錄造模日期。空白對照組同上位置注射0.9%氯化鈉溶液，其余操作相同。

1.2.2 給藥 固本健腦液低、中、高劑量組以上述配制的水煎液濃度，給予各組大、鼠10 mL/kg/d灌胃;空白對照組和模型組用給予等體積的生理鹽水。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 Morris水迷宮行為學(xué)測定 用幾滴食用色素使池水變黑，然后將水深保持在31.5 cm，溫度保持在（23±1）℃，在水面以下設(shè)置1.5 cm圓形透明有機(jī)玻璃平臺，確保水迷宮周圍的所有空間信號在水迷宮測試期間保持不變，用虛線將池劃分為4個相等的象限，以進(jìn)行描述性數(shù)據(jù)收集，將隱藏平臺放置在水迷宮的第三象限（Q3），提捏大鼠尾部將其面向池壁分別從4個象限的固定位置進(jìn)入水中，通過攝像機(jī)在連接到基于計算機(jī)的圖形分析軟件的水迷宮上捕捉大鼠的游泳行為，記錄小鼠尋找平臺的逃避潛伏期，并計算其平均隱藏潛伏期。

自主活動時間檢測：最后一次灌胃之后，用自主活動監(jiān)測儀觀察各組大鼠自主活動時間6 min，前3 min為適應(yīng)性訓(xùn)練，不計入最后統(tǒng)計，后3 min納入統(tǒng)計分析。

1.2.3.2 ELISA檢測大鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42含量 行為學(xué)檢測結(jié)束后，用100%異氟醚吸入麻醉大鼠，拉頸法處死大鼠，迅速取腦組織，分離皮層和海馬組織，用pH值7.4的PBS制成含30%海馬組織的懸液，3 000 r/min離心15 min，離心半徑13.8 cm。取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測，酶標(biāo)儀450 nm處檢測吸光度。

1.2.3.3 免疫組化檢測下丘腦SCN中Bmal1、Clock表達(dá) 將多聚甲醛溶液浸泡的腦組織行石蠟包埋，后切片，厚度為5 μm，然后將切片進(jìn)行脫蠟處理，脫蠟處理完成的切片使用3%H2O2浸泡15 min，后用PBS沖洗切片3，操作重復(fù)3次，3 min/次;沖洗完成后在切片表面滴加一抗Bmal1（1∶100）和Clock（1∶200），室溫孵育1 h;PBS沖洗切片3次，3 min/次;后滴加二抗（1∶1 000），室溫孵育15 min;再一次用PBS沖洗切片3次;以上步驟完成后滴加DAB顯色液孵育5 min;最后對切片進(jìn)行水洗、復(fù)染、脫水和透明。鏡下觀察切片，從每組切片中分別選取5個高倍（×400）視野，用Image Pro Plus 6.0對圖像進(jìn)行處理并獲取IOD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 固本健腦液對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，目標(biāo)象限游泳時間百分比顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各觀察組逃避潛伏期顯著縮短，目標(biāo)象限游泳時間百分比顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。說明固本健腦液可以改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見表1。

2.2 自主活動時間檢測結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠表現(xiàn)為活動時長的顯著延長（P<0.01）;與模型組比較，各給藥組大鼠的活動時長表現(xiàn)為顯著減少（P<0.05）。見表2。

2.3 固本健腦液對大鼠海馬組織中Aβ1-40和Aβ1-42含量的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠海馬Aβ1-40和Aβ1-42含量顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，固本健腦液中、高劑量組大鼠海馬Aβ1-40和Aβ1-42含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

2.4 免疫組化實驗結(jié)果 空白組大鼠SCN中Bmal1和Clock表達(dá)水平較高，造模后，模型組大鼠SCN中Bmal1和Clock表達(dá)水平下降（P<0.01），給藥后，各組大鼠SCN中Bmal1和Clock表達(dá)上升（P<0.05）。各組大鼠SCN中Bmal1和Clock的IOD（累積光密度）值見圖1、圖2、圖3。

3 討論

研究表明，睡眠節(jié)律紊亂與AD的發(fā)生發(fā)展存在十分密切的聯(lián)系，二者有著緊密的交互作用。有實驗表明，對AD模型鼠的慢性睡眠剝奪可加速AD鼠腦內(nèi)的β-淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積，從而使得學(xué)習(xí)記憶障礙加重[6-8]。這種睡眠障礙與AD之間的關(guān)聯(lián)性也為研究AD的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。

而本研究方固本健腦液能補(bǔ)脾腎之虛，固人體精氣血之本，從而健腦安神，結(jié)合古今醫(yī)家對失眠發(fā)生病因病機(jī)的認(rèn)識，認(rèn)為老年失眠主要是脾腎等臟腑虛衰，氣血不足所致[9-10]。所以其治療也當(dāng)以補(bǔ)腎健脾，以養(yǎng)精氣血之本，使健腦神安為主，故用本方以達(dá)固本健腦之功。該方的前期研究證實了固本健腦液能有效改善老年大鼠的失眠狀態(tài)，改善下丘腦細(xì)胞異變狀態(tài)，并通過上調(diào)GABAARα1、GABAARγ2、降低NKCC1加強(qiáng)GABA與其受體的結(jié)合改善睡眠剝奪大鼠的睡眠障礙從而達(dá)到改善睡眠的作用[11-12]。

本研究的實驗結(jié)果顯示AD模型大鼠存在一定程度的晝夜節(jié)律紊亂，生物鐘節(jié)律基因Bmal1、Clock表達(dá)降低，而使用固本健腦液干預(yù)后可改善癡呆大鼠的晝夜節(jié)律紊亂，改善了海馬Aβ的異常表達(dá)，其機(jī)制則可能與固本健腦液上調(diào)Bmal1、Clock表達(dá)有關(guān)。自從Clock基因被發(fā)現(xiàn)以后，陸續(xù)有更多的與晝夜節(jié)律相關(guān)的生物鐘基因被發(fā)現(xiàn)，包括Clock、時鐘管理基因Bmal1、系列周期基因Per1、Per2、Per3等[13-15]其中，生物鐘基因Clock可以與Bmal1的產(chǎn)物相結(jié)合，形成Clock/Bmal1異二聚體，又可激活Per以及Cry的轉(zhuǎn)錄，這一系列的節(jié)律基因和他們的蛋白產(chǎn)物相互作用，這種分子機(jī)制，對于保證晝夜節(jié)律正常運轉(zhuǎn)有著重要意義[16-17]。也有研究證明隨著機(jī)體的逐漸衰老，SCN中Clock、Bmal1、Per及Cry等一系列節(jié)律基因的表達(dá)也有所降低，且研究還發(fā)現(xiàn)AD患者腦中Bmal1的表達(dá)也會失去節(jié)律性[18-19]。除此之外，Aβ的異常沉積也會使SCN出現(xiàn)損害，發(fā)生明顯萎縮，體積減小[20]。本實驗結(jié)果也證明了通過固本健腦液的干預(yù)可降低癡呆大鼠海馬Aβ的表達(dá)的同時改善睡眠障礙。

因此可以得知在對AD的預(yù)防和治療的研究中同時進(jìn)行對于晝夜節(jié)律與AD的交互作用的研究具有非常重要的意義，這種晝夜節(jié)律系統(tǒng)紊亂和阿爾茨海默病的病因機(jī)制中的共同的特征，也揭示了將它們作為一條相互依賴的途徑進(jìn)行研究的前景，將來也有可能為AD提供新的治療思路?；謴?fù)AD患者的晝夜節(jié)律改善睡眠可能不再僅僅只是對癥治療，在今后極有可能成為針對AD的病因從而進(jìn)行預(yù)防的有效措施。

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（2020-03-16收稿 責(zé)任編輯：王明）