張世派 李君宇 鄒小紅 黃凱斌 鐘思梅 傅宇翔 夏利剛

1 暨南大學第二臨床醫(yī)學院(深圳市人民醫(yī)院)胃腸外科 廣東 深圳 518020；2 深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院藥學部

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)在全球范圍內(nèi)是發(fā)病率和死亡率均排名前三的惡性腫瘤[1]。雖然近年來隨著醫(yī)療技術(shù)和輔助療法的進一步發(fā)展，患者的生活質(zhì)量得到了極大的提高，但由于其早期無明顯癥狀，致使多數(shù)患者診斷時已為中晚期，導致其5年生存率低于12%[2]。因此，開展CRC早期篩查對于患者的早診早治以及改善患者的預后有極其重要的意義。目前血清腫瘤標志物檢測和腸鏡是應(yīng)用最為廣泛的CRC癌篩查手段，但由于敏感度低、特異性差及患者依從性差等問題，制約了CRC患者的早期診斷[3]。近年來，隨著“液體活檢”技術(shù)的發(fā)展，從血液中尋找新的CRC無創(chuàng)標志物已成為廣大科研工作者關(guān)注的熱點領(lǐng)域[3-4]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸，且不具備編碼蛋白能力的RNA[5]。大量的研究證實lncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥等多個過程中均發(fā)揮著重要的作用[6]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)多種lncRNA在腫瘤患者血漿中的表達出現(xiàn)異常，且與腫瘤的不良預后密切相關(guān)[7]。在本研究中，采用熒光定量PCR技術(shù)對入組的結(jié)腸息肉和CRC患者血漿中l(wèi)inc00673水平進行檢測，并結(jié)合患者早期病變不同分期及腫瘤臨床病理分析linc00673水平差異與臨床的相關(guān)性，旨在為血漿linc00673在CRC早期篩查中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集某院2018年6月至2018年12月期間收治的結(jié)腸息肉、CRC住院患者，入組情況見表1。其中結(jié)腸息肉患者42例，男性28例，女性14例，年齡26～76歲，平均年齡(51.6±16.1)歲；患者按病變性質(zhì)分類，其中炎性/增生性息肉21者例，非進展期腺瘤者11例，進展期腺瘤者10例。CRC患者66例，男性39例，女性27例，年齡39～82歲，平均年齡(55.3±13.9)歲；CRC患者按UICC/AJCC第7版標準進行分期，其中Ⅰ期10例，Ⅱ期21例，Ⅲ期28例，Ⅳ期7例。上述腫瘤分期及病理分型均經(jīng)過病理組織學和細胞學檢查證實。所有研究對象排除近期大手術(shù)、放化療、長期慢性炎癥、嚴重感染等情況，且已簽署知情同意書。

表1 入組患者情況

1.2 試劑及儀器 miRNeasy Serum/Plasma kit購于Qiagen公司；Reverse transcription kit、EmeraldAmp?PCR Master Mix、TB Green qPCR kit 購于Takara公司；Qubit RNA BR Assay Kits購于Bio-rad公司，-80℃超低溫冰箱，Qubit 3.0熒光計，Bio-rad CFX Connect熒光定量PCR儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本血漿 分離抽取外周血樣本2 mL，置于含EDTA的抗凝管中，低溫運輸至實驗室。4℃，1 000 g，離心10 min。將血漿(上清)轉(zhuǎn)移至凍存管中，于-80℃保存。

1.3.2 血漿總RNA提取參照miRNeasy Serum/Plasma kit試劑盒說明書。血漿溶解后，4℃，12 000 g離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新EP管內(nèi)。加入血漿RNA裂解液1 mL，渦旋震蕩，室溫孵育5 min。加入等體積氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫孵育3 min后，4℃，12 000 g，離心15 min。移取上清液至新EP管中，加入1.5倍體積的無水乙醇，反復吹打混勻后。轉(zhuǎn)移至RNA分離柱，室溫，8 000 g，離心15 s，將RNA吸附至柱膜上。向上述RNA分離柱中加入RNA洗滌緩沖液I，室溫，8 000 g，離心15 s后，加入RNA洗滌緩沖液II，室溫，8 000 g，離心15 s。加入500 uL 80%乙醇，室溫，8 000 g，離心2 min。將柱子轉(zhuǎn)移至新的2 mL收集管，以最大的離心力離心5 min。打開管蓋，干燥15 min后，用15 uL RNase-free H2O洗脫RNA。

1.3.3 RNA定量參照Qubit?RNA BR Assay Kits進行RNA定量。配制工作液，將工作液分裝標準液和樣本測定Qubit管中，標準液管中分別加入對應(yīng)的標準液10 uL，樣本測定管中，加入1～20 uL測定樣品，使管內(nèi)總體積達到200 uL?；靹?，室溫孵育2 min，上機檢測。

1.3.4 引物序列 Actin上游引物5′-GTACGCCAACACAGTGCTG-3′，下游引物5′-GCCATGCCAATCTCATCTTG-3′。Linc00673上游引物5′-TACCACACCCTTTCTTGCCC-3′，下游引物5′-ACACTGGCCTCTTTACACGG-3′。

1.3.5 熒光定量PCR檢測逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如表2，反應(yīng)程序為37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃∞。

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

熒光定量PCR反應(yīng)體系如表3，反應(yīng)程序為95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。

表3 熒光定量PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果

2.1 Linc00673在結(jié)腸息肉和結(jié)直腸癌患者中的水平 采用相對定量PCR法檢測入組樣本血漿中l(wèi)inc00673的表達水平，結(jié)直腸癌患者血漿中l(wèi)inc00673表達水平明顯高于結(jié)腸息肉患者(P<0.05)，為結(jié)腸息肉患者的3.7倍，如圖1A所示。而炎性/增生性息肉、非進展期腺瘤和進展期腺瘤結(jié)腸息肉患者組間差異無統(tǒng)計學意義(圖1B)。此外，結(jié)直腸癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者血漿中l(wèi)inc00673水平差異無統(tǒng)計學意義(圖1C)。

2.2 Linc00673與結(jié)直腸癌臨床病理相關(guān)性分析 結(jié)直腸癌患者在年齡、性別、TNM腫瘤分期、腫瘤部位、大體形態(tài)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面與血漿linc00673水平組間比較差異無統(tǒng)計學意義(表4)，但linc 0067水平與腫瘤體積大小呈正相關(guān)(r=0.535 4，P<0.01)。

3 討論

CRC屬于消化道常見腫瘤。據(jù)《2016中國腫瘤登記年報》顯示，我國CRC占全部惡性腫瘤發(fā)病率的第三位，死亡率居第五位。絕大多數(shù)患者在確診時已為晚期，致使CRC患者5年生存率較低，因此“早發(fā)現(xiàn)、早治療”成為提高CRC患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵。由于目前臨床使用的早期篩查方式都存在著各自的缺點，使得無創(chuàng)、快捷、準確可重復的檢測技術(shù)成為腫瘤早期篩查研究領(lǐng)域的熱點?！耙后w活檢”技術(shù)在2015年被《麻省理工大學科技評論》評為最可能改變世界的十大科技，被認為有助于盡早發(fā)現(xiàn)癌癥。越來越多的證據(jù)表明lncRNA不僅在CRC的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[8]，同時還能穩(wěn)定存在于體液中(例：血液，血漿，血清等)[7]。基于以上特點，血漿lncRNA有望成為CRC早期診斷、預后判斷和療效預測的無創(chuàng)分子標志物。

基因間長鏈非編碼RNA 00673(linc00673)隸屬于lncRNA，定位于染色體 17q24.3 區(qū)域，在多種腫瘤中發(fā)揮著癌基因的作用[9]。研究證實其在肺癌[10]、乳頭狀甲狀腺癌[11]、胰腺癌[12]、乳腺癌[13]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[9]、肝癌[14]等腫瘤組織中高表達。但其在CRC早期診斷中的研究還未見報道。

表4 CRC臨床病理與血漿linc00673相關(guān)性

我們采用相對定量PCR法檢測結(jié)腸息肉和CRC患者血漿中l(wèi)inc00673的表達水平后，發(fā)現(xiàn)CRC患者血漿中l(wèi)inc00673表達水平明顯高于結(jié)腸息肉患者(P<0.05)，而在結(jié)腸息肉不同病理組間和CRC不同分期組間卻無顯著性差異，提示血漿linc00673可能與CRC的發(fā)生密切相關(guān)。經(jīng)與CRC病理進行相關(guān)性分析，CRC患者血漿中l(wèi)inc00673水平與患者年齡、性別、TNM腫瘤分期、腫瘤部位、大體形態(tài)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，僅與患者腫瘤大小呈正相關(guān)，說明血漿中l(wèi)inc00673表達水平與CRC腫瘤的發(fā)展有緊密聯(lián)系。因此，綜合分析血漿linc00673在不同病理階段下的表達水平，及與腫瘤病理之間的關(guān)系，血漿linc00673有可能是CRC早期診斷的潛在標志物。