翟 取，孫明杰，崔海峰，武 乾，石曉路

(中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京市中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700)

糖尿病心肌病(DCM)是獨(dú)立于心臟微血管病變的原發(fā)性心肌損害，主要表現(xiàn)為心臟收縮和舒張功能異常，與心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)，是糖尿病患者死亡和致殘的重要因素[1]。DCM的發(fā)生機(jī)制包括心肌重構(gòu)、心肌細(xì)胞代謝障礙、氧自由基生成異常、興奮收縮偶聯(lián)功能障礙、Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)異常等[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，生脈散可以調(diào)節(jié)壓力負(fù)荷型心肌肥厚大鼠肌漿網(wǎng)鈣泵功能及Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)異常[5]，改善DCM造成的心室重構(gòu)并提高左心室射血分?jǐn)?shù)[6-7]，而針對生脈散影響DCM Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)主要探討生脈散對糖尿病大鼠心臟收縮功能及心肌Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響，為DCM的臨床治療提供新參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量(160±10)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006/動(dòng)物合格證號(hào)11400700257071]。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，溫度20～22 ℃，相對濕度40%～60%。本實(shí)驗(yàn)已通過中國中醫(yī)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器

鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，貨號(hào)S-0130)；曲美他嗪 Trimetazidine(施維雅制藥)；生脈散(人參、麥冬、五味子組分比例為1∶2∶1，委托吉林天強(qiáng)制藥股份有限公司加工為無糖型生脈散溶液，每毫升相當(dāng)于人參原料 0.1 g，經(jīng)檢測符合2015版本《中國藥典》生脈飲制備要求)；One Step Western Kit HRP(康為世紀(jì)公司，貨號(hào)CW2029)；PLB抗體(Abcam公司，貨號(hào)ab2865)；PLBSer16+Thr17抗體(Abcam公司，貨號(hào)ab6210)；SERCA2a抗體(Abcam公司，貨號(hào)ab2861)；NCX1抗體(Abcam公司，貨號(hào)ab2869)；RyR phospho S2808抗體(Abcam公司，貨號(hào)ab59225)；CACNA1C抗體(Abcam公司，貨號(hào)ab84814)；全蛋白提取試劑盒(solarbio公司，貨號(hào)BC3710-100T)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(solarbio公司，貨號(hào)PC0020)；Vevo770高分辨率超聲影像系統(tǒng)(加拿大Visual Sonics)；Western Blot凝膠電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；ChemiDoc 凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；羅氏卓越精采型血糖儀(羅氏血糖儀公司)。

2 方法

2.1 造模與分組

60只大鼠適應(yīng)性1周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)選出10只作為對照組，實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)采用普通飼料喂養(yǎng)。剩余50只大鼠使用高脂飼料喂養(yǎng)4周(江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，貨號(hào)MD12032，45%fat Kcal%)。大鼠禁食8 h，腹腔注射無菌鏈脲佐菌素檸檬酸鈉緩沖液45 mg/kg，之后繼續(xù)高脂飼料飼養(yǎng)。注射結(jié)束后在2周內(nèi)每3天檢測大鼠空腹8 h血糖，血糖值≥16.7 mmol·L-1,并穩(wěn)定2周即為造模成功。將上述成模大鼠按照體質(zhì)量、血糖隨機(jī)分為模型組、曲美他嗪組(TMZ)、生脈散組(SMS)。曲美他嗪組灌胃曲美他嗪7 mg·kg-1·day-1，生脈散組灌胃生脈散溶液(折合人參原料1050 mg·kg-1·day-1)，灌胃給藥12周，自給藥起計(jì)為本研究第0周。對照組和模型組給予等體積等時(shí)長的純凈水。

2.2 體質(zhì)量及血糖檢測

定期監(jiān)測大鼠體質(zhì)量及空腹8 h鼠尾血糖。

2.3 心臟超聲檢測心功能

采用Vevo 770高分辨率小動(dòng)物超聲心動(dòng)檢測系統(tǒng)，超聲頻率17.5 MHz。異氟烷麻醉，于大鼠左側(cè)胸骨旁左室乳頭肌水平獲取M-mode圖像，測量大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短率(FS)。

2.4 Western Blot技術(shù)檢測心肌肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白

大鼠左心室心肌組織提取總蛋白，BCA法定量，依據(jù)不同蛋白分子量制備相應(yīng)分離膠?？贵w稀釋比例：GAPDH稀釋1∶5000，SERCA2a 1∶1000，其余抗體PLB、PLBSer16+Thr17、NCX1、CACNA1C、RyR phosphoS2808稀釋比例均為1∶500)，洗膜，ECL發(fā)光檢測。采用ChemiDoc 凝膠成像分析系統(tǒng)曝光及掃描。Image Lab 軟件進(jìn)行圖像分析，結(jié)果以內(nèi)參GAPDH校正。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 生脈散對糖尿病大鼠體質(zhì)量及空腹血糖的影響

圖1、2顯示，注射鏈脲佐菌素(STZ)后大鼠體質(zhì)量在給藥后12周內(nèi)呈下降趨勢。第8、10、12周明顯降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。12周內(nèi)血糖監(jiān)測顯示，與對照組比較，STZ造模后3組大鼠血糖顯著增高(P<0.01，P<0.01，P<0.01)，且給藥組與模型組間血糖比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：與空白組比較：**P<0.01

注：與空白組比較：**P<0.01

3.2 生脈散對糖尿病大鼠心臟收縮功能影響

為檢測生脈散對糖尿病大鼠心臟收縮功能的影響。本實(shí)驗(yàn)通過超聲心動(dòng)系統(tǒng)監(jiān)測給藥后12周內(nèi)大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)和短軸縮短率(FS)。EF為搏出量占心室末期容積百分比，F(xiàn)S為左室舒張，收縮末期直徑之差與舒張末期直徑之比。圖3 A為各組大鼠在左心室M-mode下第12周超聲下心臟收縮形態(tài)。結(jié)果顯示，正常組室間隔及后壁搏動(dòng)有力，收縮明顯；模型組室壁搏動(dòng)明顯減弱，心室內(nèi)徑增大；曲美他嗪組和生脈散組心臟收縮有所改善。圖3B、C顯示，STZ注射后第4周各組大鼠EF、FS值并無明顯差異；伴隨糖尿病病程與正常組比較，模型組第8周、12周 EF、FS顯著降低(P<0.05，P<0.01)。與正常組比較，生脈散及曲美他嗪給藥組第8周EF、FS顯著降低(P<0.01，P<0.05)，但與模型組比較有增高趨勢。而第12周與模型組比較，2給藥組EF、FS顯著增高(P<0.05，P<0.05)。

注：A.大鼠在M-Mode下超聲心動(dòng)二維圖像;B.各組大鼠EF值 C為各組大鼠FS值。與空白組比較：*P<0.05, **P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

注：與對照組比較：*P<0.05, **P<0.01；與模型組比較：#P<0.05, ##P<0.01

3.3 生脈散對心肌肌漿網(wǎng)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的影響

圖4示，與對照組比較，STZ注射后糖尿病大鼠左心室心肌組織受磷蛋白(PLB)表達(dá)顯著增高(P<0.05)；肌漿網(wǎng)鈣泵ATP酶(SERCA2a)、磷酸化PLB(PLBSer16+Thr17)、鈉鈣交換體(NCX1)蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05，P<0.01)，表明發(fā)揮鈣回?cái)z和消除作用的相關(guān)蛋白活性減弱。與模型組大鼠比較，曲美他嗪組和生脈散組PLBSer16+Thr17、SERCA2a、NCX1表達(dá)顯著增加(P<0.05，P<0.01)，表明發(fā)揮鈣回?cái)z和消除作用的相關(guān)蛋白活性增強(qiáng)。各組大鼠雷諾丁受體(RyR)、電壓門控鈣通道α1C亞基(CACNA1C)表達(dá)無差異。

圖5示，與對照組比較，糖尿病大鼠SERCA2a/PLB、PLBSer16+Thr17/PLB比值降低表明，SERCA2a活性降低；與模型組大鼠比較，TMZ組和SMS組PLBSer16+Thr17/PLB、SERCA2a/PLB比值增加，表明心肌SERCA2a活性增加。

注：將各組SERCA2a，PLB，p-PLB均值間進(jìn)行比較：A為SERCA2a與PLB的相對蛋白表達(dá)含量及比值; B為PLB Ser16+Thr17與PLB的相對蛋白表達(dá)含量及比值

4 討論

生脈散具有益氣滋陰的作用，臨床常用其治療脈微自汗、心悸氣短的氣陰兩虛證?，F(xiàn)代臨床及藥理學(xué)研究均表明，生脈散具有保護(hù)DCM受損心肌的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，生脈散可以改善db/db小鼠心臟的舒張功能[8]。也有研究認(rèn)為，生脈散合丹參湯可以延緩STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心室重構(gòu)[9]，而生脈散對心肌細(xì)胞Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)作用鮮見報(bào)道。

心肌細(xì)胞正常的收縮活動(dòng)基于胞內(nèi)Ca2+的正常轉(zhuǎn)運(yùn)。Ca2+通過電壓依賴性L型Ca2+通道進(jìn)入細(xì)胞，與肌漿網(wǎng)(SR)上的雷諾丁受體(RyR)結(jié)合，RyR開放后大量Ca2+自肌漿網(wǎng)釋放到胞漿內(nèi)與肌鈣蛋白結(jié)合后引起肌絲滑行和心肌細(xì)胞收縮，隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+的減少而收縮終止。大鼠心肌舒張期胞質(zhì)內(nèi)約90%的Ca2+被肌漿網(wǎng)上Ca2+-ATP酶(SERCA2a)泵回到肌漿網(wǎng)內(nèi)，其活性與受磷蛋白(PLB)的磷酸化密切相關(guān)，PLB磷酸化會(huì)增加SERCA2a Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)能力，去磷酸化則會(huì)抑制SERCA2a活性。剩余的Ca2+會(huì)通過肌細(xì)胞膜上的Na+-Ca2+交換體(NCX1)和Ca2+-ATP酶排出細(xì)胞外[10]。當(dāng)SERCA2a、PLB、NCX表達(dá)降低或功能障礙時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+無法正常轉(zhuǎn)運(yùn)，造成Ca2+超載、肌漿網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存減少和鈣瞬變幅值降低，最終引發(fā)心臟機(jī)械活動(dòng)障礙以及心律失常等問題。

以往研究表明，糖尿病狀態(tài)下小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)PLB 表達(dá)增加[11]，磷酸化水平下降，對SERCA2a的抑制作用增加，且高糖狀態(tài)導(dǎo)致SERCA2a表達(dá)下降[12-14]，因此將Ca2+泵回肌漿網(wǎng)的能力大大減弱。肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+含量減少，鈣瞬變幅值減少，導(dǎo)致小鼠心臟收縮功能受損。體內(nèi)誘導(dǎo)SERCA2a表達(dá)增加可以糾正Ca2+處理異常，并改善小鼠收縮功能障礙[15]。晚期糖尿病狀態(tài)下NCX1的表達(dá)與活性降低，泵出細(xì)胞外的Ca2+變少，增加其表達(dá)可以補(bǔ)償因SERCA2a活性降低導(dǎo)致的鈣瞬變幅值降低，NCX表達(dá)減少與糖尿病狀態(tài)下鈣超載密切相關(guān)，增加其表達(dá)有助于恢復(fù)小鼠心功能[16-18]。但也有研究表明，抑制NCX可以抗小鼠心律失常[19]。

在本研究中模型組糖尿病大鼠PLB表達(dá)升高；PLB磷酸化水平、SERCA2a、NCX1表達(dá)降低，與上述研究較為一致。說明模型組出現(xiàn)心肌細(xì)胞鈣超載以及鈣轉(zhuǎn)運(yùn)異常，這將導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣庫容量不足及鈣瞬變幅值降低，心肌收縮能力受損。本研究超聲心動(dòng)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)降低以及短軸縮短率降低，印證上述鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白改變導(dǎo)致糖尿病大鼠心臟收縮功能發(fā)生障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，生脈散可以顯著減少STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌組織中PLB的過表達(dá)，增加PLB磷酸化，增加SERCA2a表達(dá)以及SERCA2a/PLBSer16+Thr17、SERCA2a/PLB比值。SERCA2a/PLB可用于評估肌漿網(wǎng)鈣泵功能[20]，比值越小證明可以用于將Ca2+回?cái)z入肌漿網(wǎng)的SERCA2a越少。因此生脈散可能通過增加PLB磷酸化、SERCA2a、NCX1的表達(dá)，減少舒張期Ca2+超載，同時(shí)增加肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+儲(chǔ)備來保護(hù)糖尿病大鼠心臟的收縮功能。此外本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，曲美他嗪組改善SERCA2a表達(dá)的作用更為顯著。DCM狀態(tài)下ROS和晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)可擾亂蛋白質(zhì)折疊，影響心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白合成。曲美他嗪是一種3-酮脂酰輔酶A硫解酶抑制劑，可抑制游離脂肪酸氧化的最后一個(gè)酶促步驟，增加糖尿病狀態(tài)下的葡萄糖氧化，將底物利用向葡萄糖轉(zhuǎn)移，減少ROS和AGEs聚集[21]。曲美他嗪有可能通過干預(yù)能量底物保護(hù)心肌細(xì)胞代謝，阻止ATP下降，減少有害氧化產(chǎn)物對蛋白合成的影響，進(jìn)而影響SERCA2a、NCX1的表達(dá)，保護(hù)因能量代謝障礙引起的收縮功能障礙。

綜上，生脈散可能通過抑制PLB過表達(dá)，增加PLB磷酸化、SERCA2a、NCX1表達(dá)來增加鈣回?cái)z與鈣消除，從而保護(hù)糖尿病大鼠心臟收縮功能，本研究為DCM的治療及藥物研究提供了理論依據(jù)。