付 暢，趙 勇，謝 敏，肖紅慧，李會敏，楊哲昀，左新河，△

(1.湖北中醫(yī)藥大學，武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院，武漢 430074)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)具有傳染性強、流行性廣等特點，屬于中醫(yī)學“疫病”范疇[1]。自其發(fā)生以來治療方案得到不斷更新，但還沒有特效藥，目前多采用中西醫(yī)結(jié)合治療方式，中醫(yī)藥的參與對于改善癥狀、防止惡化、促進康復等起到重要作用[2]。COVID-19以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)，初期患者中可見納呆嘔惡、大便黏膩不爽、苔白厚或白膩等濕濁之象[3]。熊繼柏[4]認為此乃邪犯胃腸所致，可以運用藿樸夏苓湯進行治療。藿樸夏苓湯由廣藿香、厚樸、半夏、茯苓、苦杏仁、薏苡仁、豆蔻、豬苓、淡豆豉、澤瀉、通草等芳香化濕、苦溫燥濕、淡滲利濕藥物組成，具有宣通肺氣、健脾化濕、通利小便之效，在濕溫發(fā)熱中得到運用，取得了良好療效[5]。藿樸夏苓湯在多個新型冠狀病毒肺炎診療方案中被推薦使用，在四川省中醫(yī)藥管理局開展的《醫(yī)院制劑“新冠2號、3號”推廣暨臨床療效評價研究》科研應急專項中，“新冠2號”是由銀翹散合藿樸夏苓湯加減而成，“新冠3號”也是由荊防敗毒散合藿樸夏苓湯加減而成[6]。故本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學方法，分析藿樸夏苓湯的組方成分、靶點及潛在作用機制，探討其對COVID-19的治療作用，為進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藿樸夏苓湯活性成分篩選

本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，依次以藿樸夏苓湯的組成廣藿香、厚樸、半夏、茯苓、苦杏仁、薏苡仁、豆蔻、豬苓、淡豆豉、澤瀉、通草等為關(guān)鍵詞進行檢索，并設置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為條件進行篩選，得到各味中藥的活性成分。

1.2 活性成分靶點的獲取及藥物-成分-靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

通過TCMSP獲取活性成分對應的靶點，使用Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)設置物種為人，將得到的靶點名稱轉(zhuǎn)換為對應的基因名稱，使用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

將獲取的藿樸夏苓湯組方藥物活性成分靶點輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)進行靶點PPI分析，將PPI數(shù)據(jù)導入到Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建網(wǎng)絡，并運用MCODE及CentiScaPe插件進行模塊化、拓撲學分析，篩選關(guān)鍵靶點。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將篩選的關(guān)鍵靶點導入到DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)，進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并用在線繪圖網(wǎng)站Omicshare(https://www.omicshare.com)將得到的結(jié)果進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 藿樸夏苓湯活性成分及靶點

通過TCMSP獲取到符合篩選條件的藿樸夏苓湯活性成分，其中查詢到靶點的活性成分為廣藿香9種，厚樸2種，半夏12種，茯苓7種，苦杏仁16種，薏苡仁6種，豆蔻12種，豬苓7種，淡豆豉1種，澤瀉7種，通草3種，合并后共有71種不同成分對應235個靶點。

2.2 藿樸夏苓湯藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖

圖1示，運用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖，網(wǎng)絡中共有316個節(jié)點1146條邊，包含11個藥物71個成分235個靶點。按節(jié)點度值排序，排名在前的活性成分有槲皮素、豆甾醇、木犀草素、黃芩素和β-谷甾醇等成分。

圖1 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.3 PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點篩選

圖2示，將藿樸夏苓湯作用的235個靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI分析。運用Cytoscape 3.6.0軟件處理，在網(wǎng)絡中有231個節(jié)點4164條邊。圖3示，使用MCODE插件對網(wǎng)絡進行模塊化分析，設定K-Core為4，得到4個模塊K-Core大于4。其中模塊1得分46.677分，包含63個節(jié)點1447條邊；模塊2得分13.000，包含13個節(jié)點78條邊；模塊3得分5.714分，包含8個節(jié)點20條邊；模塊4得分5.385分，包含27個節(jié)點70條邊。表1示，運用CentiScaPe插件對網(wǎng)絡進行拓撲學分析，網(wǎng)絡中度平均值36.052，中介中心性平均值248.442，緊密中心性平均值為0.002，篩選得到41個關(guān)鍵靶點。

圖2 靶點PPI圖

圖3 PPI網(wǎng)絡MCODE模塊化圖

2.4 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

圖4、5示，運用DVAID對篩選的關(guān)鍵靶點進行GO功能富集分析(P<0.05)，得到72個條目，其中生物過程44條，細胞組成7條，分子功能21條，按P值排序前20條。對篩選的靶點進行KEGG通路富集分析(P<0.05)，得到73個信號通路，按P值排序前20條。

表1 靶點網(wǎng)絡拓撲數(shù)據(jù)比較

圖4 GO功能富集分析氣泡圖

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

COVID-19是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引發(fā)的疾病。SARS-CoV-2屬于β型冠狀病毒[7]，它能通過其表面的棘突蛋白與人體細胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)受體結(jié)合而進入到細胞中[8]。SARS-CoV-2棘突蛋白與ACE2受體的結(jié)合下調(diào)ACE2的表達，導致血管緊張素Ⅱ水平升高，血管緊張素Ⅱ通過結(jié)合其受體Ⅰ型和Ⅱ型發(fā)揮血管活性作用，增加肺血管通透性，誘導急性肺損傷[9]。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2受體除在Ⅱ型肺泡上皮細胞和呼吸道上皮細胞高表達外，還在心肌細胞、腎近曲小管上皮細胞、膀胱上皮細胞、食道和回腸上皮細胞均有表達[10]，提示SARS-CoV-2對心臟、腎臟等其他器官也具有殺傷力。COVID-19除引起典型的呼吸系統(tǒng)癥狀外，對心血管、消化、泌尿系統(tǒng)也都有影響，能造成多臟器衰竭，嚴重者導致死亡[11-12]。

通過網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，藿樸夏苓湯的11味中藥含有71種活性成分，在網(wǎng)絡中度值高的活性成分有槲皮素、豆甾醇、木犀草素、黃芩素、β-谷甾醇等成分。槲皮素、木犀草素、黃芩素為黃酮類化合物。槲皮素具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)的作用[13]，實驗發(fā)現(xiàn)其能夠降低脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠TNF-α、IL-6水平，抑制過氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性，即通過抑制炎癥與氧化應激的方式來防治急性肺損傷[14]，同時槲皮素對心臟也有保護作用[15]。木犀草素在體內(nèi)外具有很強的抗炎活性[16]，能夠減少MAPL和NF-κB途徑的激活，抑制ICAM-1、TNF-α分泌，減弱肺部炎癥反應[17]；木犀草素對于甲型流感病毒誘導的肺內(nèi)皮屏障功能障礙也有改善作用，能夠降低過高的肺通透性[18]。黃芩素具有抗菌、抗病毒的作用，能夠降低TNF-α、IL-6、MCP-1水平，增高IFN-γ、IL-10水平，從而治療甲型流感病毒誘導的急性肺損傷[19]。豆甾醇、β-谷甾醇都是植物甾醇類化合物，豆甾醇能減少嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的增殖，減輕細支氣管、肺泡炎性細胞的浸潤[20]。β-谷甾醇能夠抑制TGF-β1誘導的肺泡上皮細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，具有抗肺纖維化的作用[21]。

藿樸夏苓湯的作用靶點PPI網(wǎng)絡模塊化分析結(jié)果顯示，其主要涉及4個模塊。免疫細胞大量分泌細胞因子及趨化因子，能夠?qū)е录毎蜃语L暴的啟動[22]，模塊1中的靶點包含促炎性因子TNF、IL-1B、IL-2、IL-6[23-24]，趨化因子CCL2、CXCL8、CXCL10[25]及抗炎性因子IL-4、IL-10[26-27]，通過對其調(diào)節(jié)能夠改善體內(nèi)的細胞因子風暴。MMP2、MMP3、MMP9等基質(zhì)金屬蛋白酶在白細胞的遷延中起重要作用，能夠介導細胞因子的分泌，加劇細胞因子風暴[28]。細胞因子風暴還能加劇肺組織上皮細胞和肺血管內(nèi)皮細胞損傷，EGF、EGFR、VEGFA等生長因子能夠促進細胞增殖，加之VCAM1的黏附作用有助于內(nèi)皮屏障的重建，改善急性肺損傷[29]。PPARG能夠改善流感病毒誘導的細胞因子風暴中炎癥反應[30]；模塊2的靶點主要為阿片受體、乙酰膽堿受體、多巴胺受體等。阿片類受體激動能夠減輕脂多糖誘導的肺損傷，改善急性呼吸窘迫綜合征[31]。乙酰膽堿受體功能的降低會增加乙酰膽堿的釋放和氣道高反應性，加強炎癥因子的刺激[32]。多巴胺受體激動能夠通過抑制YAP/TAZ治療肺纖維化[33]；模塊3的靶點主要為腎上腺素能受體、胺氧化酶。腎上腺素能受體激動能夠抑制炎性因子經(jīng)氣道釋放，減輕肺部炎癥，改善肺組織微循環(huán)障礙[34]。胺氧化酶能夠調(diào)節(jié)白細胞滾動速度及遷移效率，減緩肺纖維化損傷[35]；模塊4的靶點包含多種酶與轉(zhuǎn)錄因子，能夠參與細胞周期的調(diào)控。

關(guān)鍵靶點的GO功能富集分析顯示，生物過程涉及RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、脂多糖介導的信號通路、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、脂多糖的細胞反應、炎癥反應、蛋白激酶B信號傳導等，細胞組成涉及核質(zhì)、頂端質(zhì)膜等，分子功能涉及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)序列特異性結(jié)合活性等。KEGG通路富集分析顯示，涉及甲型流感、百日咳、非小細胞肺癌等疾病通路，腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、NOD樣受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等信號通路。SARS-CoV-2作為RNA病毒，通過調(diào)控RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄，能夠影響病毒RNA的復制[36]。脂多糖是常見的炎癥觸發(fā)因素[37]，能夠引起內(nèi)皮細胞凋亡，誘發(fā)肺組織炎癥、肺間質(zhì)水腫，出現(xiàn)呼吸困難和低氧血癥造成急性肺損傷[38]，因此通過對脂多糖相關(guān)因素的調(diào)控，能夠改善肺炎癥反應及減少肺損傷。通路富集分析發(fā)現(xiàn)，前20條通路中肺相關(guān)疾病的條目較多,顯示靶點對肺相關(guān)疾病的作用較明顯。Toll樣受體作為信號分子模式識別受體，主要參與非特異性免疫，是對抗病毒的第一道防線，其還參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[39]。NOD樣受體信號通路同樣作為機體固有免疫系統(tǒng)的一部分，參與免疫應答，介導炎癥反應[40]。腫瘤壞死因子信號通路是炎癥反應中的重要通路，對抑制細胞因子風暴起著重要作用[41]。HIF-1信號通路在機體低氧的應答中起重要作用，能夠改善缺氧表現(xiàn)[42]，對于該信號通路的調(diào)控還能抑制肺纖維化[43]。MAPK信號通路在急性肺損傷、肺纖維化進程中也起到調(diào)節(jié)作用[44-45]。

綜上所述，本次研究通過網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，藿樸夏苓湯通過多成分、多靶點發(fā)揮著抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗肺纖維化的作用，通過腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、HIF-1信號通路等多通路起到對COVID-19的治療作用，這為藿樸夏苓湯更廣泛地應用于治療COVID-19提供了理論依據(jù)。