劉穎，張鵬，王鐵桿*，任鵬

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江 溫州 325005； 2.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點實驗室，浙江 溫州 325005)

壇紫菜(Pyropiahaitanensis)屬于紅藻門(Rhodophyta)，紅藻綱(Rhodophyceae)，紅毛菜目(Bangiales)，紅毛菜科(Bangiaceae)，法紫菜屬(Pyropia)[1]。主要棲息在潮間帶，是我國特有暖溫帶性種類，分布于浙江、福建和廣東三省沿海[2]，其產(chǎn)量約占全國紫菜總產(chǎn)量的75%[3]。浙江壇紫菜產(chǎn)業(yè)位居全國第二，壇紫菜是浙江省第一大經(jīng)濟海藻，栽培面積6 667 hm2，養(yǎng)殖品種主要以原有的野生型為主。近年來氣候變化明顯加劇，本地養(yǎng)殖品系連續(xù)發(fā)生嚴(yán)重病爛，養(yǎng)殖減產(chǎn)，所以推廣具有優(yōu)良性狀的新品系對壇紫菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。然而對于篩選推廣的新品系的遺傳多樣性水平及其與傳統(tǒng)的本地養(yǎng)殖品系壇紫菜的遺傳多樣性差異尚不清楚。遺傳多樣性是生物對復(fù)雜環(huán)境適應(yīng)能力的一種反應(yīng)[4]，是評價生物資源狀況的重要依據(jù)。因此,對壇紫菜新品系遺傳多樣性水平的研究具有重要意義。

擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是迄今最有效的分子標(biāo)記之一，已被大量運用在大型海藻的種質(zhì)鑒定[5-6]、遺傳多樣性分析[7-8]、連鎖圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域[9]，因此，本研究選用AFLP標(biāo)記技術(shù)對不同品系的壇紫菜進(jìn)行遺傳多樣性分析，以了解其遺傳多樣性和遺傳特征等信息，為壇紫菜種質(zhì)資源的遺傳背景信息積累提供參考[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用壇紫菜樣品浙南3號和玉環(huán)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖種于2017年11月8日隨機采自浙江省臺州市玉環(huán)市箬笠礁海域中的養(yǎng)殖網(wǎng)簾，各取30株用于AFLP分析。

1.2 基因組DNA的提取

使用“DN14-植物基因組DNA快速提取試劑盒”(北京艾德萊生物科技有限公司，DN1401)按照操作說明提取壇紫菜基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，利用微量分光光度計(Nano-400)測定DNA的質(zhì)量與濃度，將DNA濃度調(diào)至20 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AFLP分析

用于AFLP分析的內(nèi)切酶(EcoRⅠ和MseⅠ)和T4 DNA連接酶為Fermentas公司生產(chǎn)；實驗所用的接頭和引物由英濰捷基(上海)公司合成，序列見表1。毛細(xì)管電泳檢測由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。反應(yīng)步驟和反應(yīng)體系如下：

表1 AFLP引物與接頭序列

酶切體系：模板DNA(20 ng·μL-1)5 μL，EcoRⅠ(10 U·μL-1)0.1 μL，MseⅠ(10 U·μL-1)0.1 μL，10×Tango Buffer 4 μL，滅菌純凈水補齊至20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃酶切4 h，接著65 ℃酶切4 h，80 ℃滅活20 min。

連接體系：酶切產(chǎn)物5 μL，T4連接酶0.5 μL，10×T4 Buffer 1 μL，50% PEG4000 1 μL，EcoRⅠ接頭(5 μmol·L-1)0.5 μL，MseⅠ接頭(50 μmol·L-1)0.5 μL，滅菌純凈水補齊至10 μL，22 ℃連接1 h，70 ℃滅活5 min。

預(yù)擴增：連接產(chǎn)物1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2 μL，EcoRⅠ preamp primer(10 μmol·L-1)0.5 μL，MseⅠ preamp primer(10 μmol·L-1)0.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.4 μL，滅菌雙蒸水補齊至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；進(jìn)行20個循環(huán)(94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃延伸10 min。

選擇擴增：將預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋10倍進(jìn)行選擇性擴增。預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋液2 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2 μL，EcoRⅠ引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，MseⅠ引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)0.4 μL，滅菌雙蒸水補齊至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；以每個循環(huán)降1 ℃的梯度從65 ℃退火到56 ℃退火(94 ℃變性30 s，65 ℃～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；然后進(jìn)行27個循環(huán)(94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)；72 ℃延伸10 min。

選擇性擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳。用ABI 3730XL自動測序儀(Applied Biosystems, USA)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因分型，用GeneMapper Software 5進(jìn)行等位基因大小分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果選取片段大小在0～500 bp的片段進(jìn)行統(tǒng)計，構(gòu)建“0、1”矩陣，運用PopGen 3.2軟件計算種群內(nèi)部的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、 Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)以及Shannon’s多樣性信息指數(shù)(I)、種群總遺傳變異(Ht)、種群內(nèi)遺傳變異(Hs)、種群間遺傳分化系數(shù)(Gst)、種群間基因流動系數(shù)(Nm)。用AFLP data analyzer[11]計算各群體間的相似系數(shù)和遺傳距離，根據(jù)遺傳距離，采用MEGA 7.0分析2個品系之間的聚類關(guān)系，構(gòu)建UPGMA和NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴增多態(tài)性

用16對引物組合對壇紫菜樣品進(jìn)行擴增，共篩選出以下8對多態(tài)性好的引物組合：E-AAC/M-CAG、E-AAC/M-CTC、E-AAC/M-CTG、E-AAG/M-CAG、E-AAG/M-CTC、E-AAG/M-CTG、E-AGG/M-CAA、E-ACC/M-CTG。用篩選出的8對引物對2個群體ZN3(n=30)和YH(n=30)進(jìn)行AFLP分析(圖1)，共得到964個有效位點。每對引物擴增位點在53～181個，平均每對引物擴增出120.5個AFLP位點。擴增位點最多的引物對是E-AAG/M-CTC。每對引物擴增的多態(tài)位點比例均大于97%(表2)。

圖1 壇紫菜部分AFLP選擇性擴增結(jié)果

表2 AFLP選擇性引物的擴增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物對復(fù)雜環(huán)境適應(yīng)能力的一種反應(yīng)，是評價生物資源狀況的重要依據(jù)。本實驗中8對引物在ZN3和YH群體中檢出多態(tài)位點數(shù)及比例(PPL)分別是665個(69.0%)和786個(81.5%)，其中ZN3的多態(tài)位點數(shù)低于YH群體，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s信息指數(shù)(I)也低于YH群體(表3)，因此,認(rèn)為YH本地壇紫菜具有較高的遺傳多樣性。

表3 2個壇紫菜品系的遺傳多樣性參數(shù)

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)

2個壇紫菜群體的種群總遺傳變異(Ht)和群體內(nèi)遺傳變異(Hs)分別為0.240 2和0.177 8，群體間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.252 6，即群體間遺傳變異占總變異的25.3%，群體內(nèi)遺傳變異占總變異的74.7%，表明不同品系的群體間遺傳分化程度較低。2個壇紫菜群體間基因流動系數(shù)(Nm)為1.593 0，表明壇紫菜不同品系間存在一定的基因交流。壇紫菜群體間遺傳相似度和遺傳距離見表4。

2.4 2個品系壇紫菜聚類分析

基于個體間的遺傳距離構(gòu)建UPGMA和NJ聚類圖(圖2)。聚類分析表明，60個壇紫菜個體分成 2支，ZN3號的30個個體聚成一支，YH的30個個體聚成另外一支。

表4 群體間遺傳相似度和遺傳距離

注：對角線上為遺傳相似度；對角線下為遺傳距離。

圖2 基于遺傳距離的壇紫菜UPGMA(A)和NJ(B)聚類樹

3 討論

3.1 壇紫菜的遺傳多樣性

物種或群體通過長期的進(jìn)化積累豐富的遺傳變異，這些遺傳變異的總和構(gòu)成了物種或群體的遺傳多樣性[12]。國內(nèi)已有多位學(xué)者利用分子標(biāo)記技術(shù)探討壇紫菜種質(zhì)資源多樣性和遺傳差異[13-16]，這些研究結(jié)果表明，壇紫菜的種質(zhì)資源多樣性是極為豐富的。而相對于其他DNA標(biāo)記技術(shù)，AFLP標(biāo)記多態(tài)帶比例高、實驗結(jié)果穩(wěn)定，不受基因組來源和復(fù)雜程度影響，重復(fù)性好并呈孟德爾遺傳的標(biāo)記，且在生物基因組信息未知的條件下，就能夠檢測親緣關(guān)系非常近的材料之間的差異[17-18]。

本實驗利用AFLP技術(shù)分析了ZN3和YH 2個群體共60個樣本，結(jié)果顯示，2個群體的多態(tài)位點百分率分別是69.0%和81.5%；其中YH群體的多態(tài)位點比例高于ZN3群體，這可能是因為YH本地傳統(tǒng)養(yǎng)殖品系的種菜來源多樣且范圍大，而ZN3選育品系的種菜來源范圍較小，所以YH群體的遺傳多樣性較高。

3.2 壇紫菜群體的遺傳結(jié)構(gòu)

壇紫菜的遺傳結(jié)構(gòu)是由基因流和遺傳漂變2因素綜合決定的，基因流動程度會對群體的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響，理論上，若Nm>1，則說明群體間有一定程度的基因流動；若Nm<1，則說明群體間分化明顯[12]。本研究中，2個壇紫菜群體間基因流動系數(shù)Nm為1.593 0，表明其群體間存在一定的基因交流。目前紫菜養(yǎng)殖品種(系)間相互混雜，海區(qū)風(fēng)浪較大，這都增加了品種(系)間基因交流的機會[7]。從UPGMA和NJ聚類圖中可以看出，ZN3和YH 2個群體明顯分為2大支，群體之前并沒有個體混雜情況出現(xiàn)，說明本次樣品采集有效合理，實驗結(jié)果可靠。

綜上所述，本研究結(jié)果揭示了浙南傳統(tǒng)養(yǎng)殖壇紫菜和選育壇紫菜品系間的遺傳多樣性差異，為了解浙南周圍壇紫菜資源提供了一定的理論支持。后續(xù)的實驗將會對更多浙南地區(qū)不同品系的壇紫菜樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。