張凱，劉玉林，胡佳麗，郭飛，薛鳳霞

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是全世界女性生殖系統(tǒng)腫瘤中預(yù)后最差、死亡率最高的婦科惡性腫瘤之一，文獻報道預(yù)計2019年美國卵巢癌新發(fā)病例數(shù)將達(dá)22 530例，其中13 980例患者因罹患卵巢癌而死亡[1]。與其他許多實體腫瘤一樣，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多因素、多種基因改變的復(fù)雜分子過程[2]。因此，尋找與卵巢癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，揭示關(guān)鍵基因在卵巢癌發(fā)病過程中的作用機制，為提供新的靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。近年伴隨著高通量測序和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，腫瘤相關(guān)的數(shù)據(jù)庫成為挖掘腫瘤相關(guān)基因的工具，而Oncomine（www.oncomine.org）數(shù)據(jù)庫則是目前世界上最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫整合了GEO、TCGA和已發(fā)表文獻來源的RNA和DNA-seq數(shù)據(jù)，旨在用于探究腫瘤相關(guān)基因信息的數(shù)據(jù)挖掘平臺。癌癥和腫瘤基因圖譜（Cancer Genome Atlas，TCGA）計劃也是一種在線的腫瘤基因數(shù)據(jù)庫，通過更好地了解癌癥疾病的遺傳基礎(chǔ)，以期提高診斷、治療和預(yù)防癌癥的能力。

拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅡA（topoisomeraseⅡA，TOP2A）基因編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα，它是一種在轉(zhuǎn)錄過程中控制和改變DNA拓?fù)錉顟B(tài)的酶，參與染色體的分離、DNA復(fù)制、染色質(zhì)濃縮等細(xì)胞生物學(xué)行為過程[3]。目前有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌[4]、膀胱癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]等多種實體腫瘤中均存在TOP2A基因的異常表達(dá)，但是關(guān)于該基因在卵巢癌中表達(dá)情況的研究較少，作用和功能仍不明確。因此，探究TOP2A基因在卵巢癌中的表達(dá)情況，及其與卵巢癌患者的臨床預(yù)后情況，幫助婦科腫瘤醫(yī)生更好地從分子生物學(xué)水平理解其發(fā)生、發(fā)展的機制，具有非常重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù) Oncomine數(shù)據(jù)庫是一個基因芯片集合的數(shù)據(jù)分析平臺，本研究從中篩選并提取出卵巢癌相關(guān)的數(shù)據(jù)，設(shè)定的篩選條件如下：①Cancer Type:ovarian cancer；②Gene:TOP2A；③Analysis Type:Cancer vs Normal Analysis；④Data Type:mRNA或DNA；⑤臨界值設(shè)定為：P-value ＜10－4，fold change ＞2，gene rank=top 10%。

1.2 TOP2A基因在上皮性卵巢癌中的突變情況 通過cBioPortal（www.cbioportal.org）網(wǎng)站獲得的TCGA數(shù)據(jù)庫中的606例上皮性卵巢癌樣本，其中311例具有完整的基因序列和拷貝變異資料，應(yīng)用oncoprint選項功能分析TOP2A基因變異情況。

1.3 TOP2A基因相關(guān)蛋白及其功能分析 利用STING數(shù)據(jù)庫分析TOP2A基因和相關(guān)蛋白，構(gòu)建TOP2A相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)樹狀圖，并進行基因功能富集分析。

1.4 Kaplan-Meier Plotter對卵巢癌患者進行生存分析通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線檢索卵巢癌患者的總體生存時間和無瘤進展生存時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，正常卵巢組織和卵巢癌組織間比較采用t檢驗，生存分析用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOP2A基因在不同腫瘤中的表達(dá)情況 對Oncomine數(shù)據(jù)庫進行檢索分析后共納入涉及TOP2A基因相關(guān)性研究結(jié)果462項，挑選出高表達(dá)125項和低表達(dá)7項差異有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果進一步分析。在膀胱癌中高表達(dá)6項，低表達(dá)0項；在腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中高表達(dá)10項；在乳腺癌中高表達(dá)18項，低表達(dá)1項；宮頸癌中高表達(dá)4項，低表達(dá)0項；在肺癌中高表達(dá)17項，低表達(dá)0項；其他腫瘤中高表達(dá)4項，低表達(dá)1項；卵巢癌中高表達(dá)的4項，低表達(dá)0項。見圖1（見后插二）。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TOP2A基因在不同類型腫瘤中的表達(dá)情況

2.2 TOP2A基因在卵巢癌中的表達(dá) 通過挖掘分析Oncomine數(shù)據(jù)庫涉及的TOP2A基因在卵巢癌組織和正常卵巢組織中有差異表達(dá)的7項研究，文章分別發(fā)表在《British Journal of Cancer》、《Cancer Research》、《ClinicalCancerResearch》、《ProceedingsoftheNational Academy of Sciences of USA》和《Cancer Science》。綜合分析發(fā)現(xiàn)，與對照組（正常卵巢組織）相比，TOP2A基因在所有差異表達(dá)基因中的中位數(shù)值排名為218.0，P=8.03×10-6，表明卵巢癌組織中TOP2A的表達(dá)量高于正常卵巢組織。見圖2（見后插二）。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TOP2A基因在卵巢癌中的表達(dá)情況

2.3 TOP2A基因在不同卵巢癌研究芯片中的表達(dá) 在 Adib Ovarian[7]、Bonome Ovarian[8]、Lu Ovarian[9]、Welsh Ovarian[10]、Yoshihara Ovarian[11]和 TCGA Ovarian 7項芯片中研究發(fā)現(xiàn)，有4項研究揭示在卵巢癌組織中TOP2A表達(dá)高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分別是芯片研究 WelshOvarian（t=8.728，P＜0.05），LuOvarian（t=5.727，P＜0.05），TCGAOvarian（t=16.571，P＜0.05）和 Bonome Ovarian（t=11.064，P＜0.05）。Oncomine數(shù)據(jù)庫中TOP2A基因在不同卵巢癌芯片中的表達(dá)情況見圖3。綜合比較，TOP2A基因在卵巢癌組織與正常卵巢組織表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且在卵巢癌組織中高表達(dá)（P＜0.05）。

圖3 TOP2A基因在不同卵巢癌芯片中的表達(dá)情況

2.4 TOP2A基因在上皮性卵巢癌中的突變情況 在311例上皮性卵巢癌樣本中有12例發(fā)生TOP2A基因變異，突變率為4%，包括擴增3例，深度缺失3例，截短突變3例，框內(nèi)突變1例，錯義突變2例，見圖4（見后插二）。

圖4 TOP2A基因在上皮性卵巢癌中的變異情況

2.5 TOP2A基因相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系及其功能分析 利用STING數(shù)據(jù)庫分析TOP2A基因主要相關(guān)蛋白，主要蛋白包括Discs大同源物關(guān)聯(lián)蛋白5（DLGAP5）、細(xì)胞分裂周期基因 20（CDC20）、泛素結(jié)合酶 E2C（UBE2C）、PDZ 結(jié)合激酶（PBK）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1（TOP1）、非染色體結(jié)構(gòu)維護凝縮蛋白Ⅰ復(fù)合體G亞基（NCAPG）、非洲爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白2靶蛋白（TPX2）、紡錘體檢測點絲/蘇氨酸激酶（BUB1）、細(xì)胞周期蛋白B2（CCNB2），構(gòu)建獲取TOP2A相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5（見后插二）。并將以上蛋白進行生理過程富集分析，可發(fā)現(xiàn)其主要富集在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、P53信號通路等，見表1。

圖5 TOP2A相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系圖

2.6 TOP2A表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存分析 通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對卵巢癌患者進行生存分析，在線檢索TOP2A與卵巢癌患者的總體生存時間和無瘤進展生存時間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)TOP2A高表達(dá)的卵巢癌患者的總體生存時間和無瘤進展生存時間明顯短于TOP2A低表達(dá)的卵巢癌患者（P＜0.05）。不同病理類型的卵巢癌亞組分析顯示，卵巢漿液性囊腺癌患者中TOP2A高表達(dá)組的總體生存時間與低表達(dá)組比較偏低，而2組無瘤進展生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌患者中TOP2A高表達(dá)組的無瘤進展生存時間較低，總體生存時間與低表達(dá)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6（見后插二）。

圖6 TOP2A的表達(dá)與卵巢癌預(yù)后之間的關(guān)系

3 討論

卵巢癌是最常見的三大惡性腫瘤之一，其病死率為婦科生殖道腫瘤之首[12]。中國每年新發(fā)病例約52 100例，且逐年增加，死亡病例約22 500例[13]。由于早期卵巢癌隱蔽性高，缺乏特異性的篩查指標(biāo)，許多患者發(fā)現(xiàn)時腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移和腹腔擴散，失去了最佳治療時期，目前晚期（Ⅲ～Ⅳ期）上皮性卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類為基礎(chǔ)的化療，但是晚期患者很快出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且產(chǎn)生了對化療藥物的耐藥，導(dǎo)致了晚期卵巢癌患者的5年生存率低于30%，預(yù)后極差。因此，探究有效的卵巢癌基因生物標(biāo)志物對于了解腫瘤形成機制、患者預(yù)后和靶向藥物的治療起到關(guān)鍵作用。

表1 與TOP2A基因密切相關(guān)的基因及基因功能富集分析

TOP2A基因是位于人類17號染色體長臂12～21區(qū)域上，編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα，該核酶參與染色體濃縮，染色單體分離和催化雙鏈DNA鏈的瞬時斷裂和重新結(jié)合，使2條鏈可以彼此穿過，從而改變了DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，達(dá)到降低DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)生扭轉(zhuǎn)應(yīng)力，避免打結(jié)和纏繞[14-15]。研究顯示，TOP2A基因在多種惡性實體瘤中異常高表達(dá)，且TOP2A高表達(dá)者通常惡性程度更高，預(yù)后更差。Ma等[16]研究發(fā)現(xiàn)TOP2A可以作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后指標(biāo)，并且其可能通過與TPX2基因蛋白共同調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展。Labbé等[17]對原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌進行了全基因檢測分析，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌中TOP2A、果蠅Zeste基因增強子人類同源物2（EZH2）mRNA水平和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，強調(diào)了前列腺癌細(xì)胞中的TOP2A和EZH2是驅(qū)動致癌基因的關(guān)鍵，通過聯(lián)合檢測TOP2A和EZH2基因，以早期識別可能受益于輔助或新輔助靶向治療方法的轉(zhuǎn)移潛力增加的患者。研究已發(fā)現(xiàn)與TOP2A陰性表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者相比，TOP2A過度表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者的總生存期和無病生存期更短，預(yù)后更差[18-19]。蒽環(huán)類藥物常被用作乳腺癌患者的術(shù)后輔助治療，研究發(fā)現(xiàn)TOP2A被認(rèn)為是這些藥物的分子靶點，因此，TOP2A擴增和過表達(dá)在蒽環(huán)類藥物治療乳腺癌患者中具有潛在的預(yù)測價值[20]。Oncomine數(shù)據(jù)庫擁有全世界最全的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)以及臨床信息，有利于研究者探索和發(fā)現(xiàn)新的癌癥生物標(biāo)志物和新的治療靶點。通過Oncomine數(shù)據(jù)分析可以得到不同腫瘤中癌基因的表達(dá)差異，還可以進行富集和Meta分析，因其整合了大量數(shù)據(jù)的優(yōu)勢，避免了因為樣本量的問題而導(dǎo)致的誤差，分析結(jié)果也因此具有較高的可信度。本研究發(fā)現(xiàn)TOP2A基因在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌以及肺癌等不同類型腫瘤中的表達(dá)，總共132項研究存在TOP2A的差異表達(dá)，其中包括125項高表達(dá)和7項低表達(dá)。

TOP2A基因在腫瘤中的作用及其機制尚不明確，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫中相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其在卵巢癌患者中的總體突變率為4%，且變異以擴增、深度缺失和截短突變?yōu)橹?。通過STRING蛋白分析工具篩選出與TOP2A蛋白發(fā)生相互作用的10種蛋白DLGAP5、CDC20、UBE2C、PBK、CDK1、TOP1、NCAPG、TPX2、BUB1和CCNB2，對這些蛋白進行通路途徑的富集分析可知，主要參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、P53信號通路和泛素介導(dǎo)的蛋白水解等生理過程。Xiong等[21]認(rèn)為TOP2A可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和p53信號通路，從而影響吸煙相關(guān)性腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。宮頸癌常由人乳頭瘤病毒（HPV）引起，病毒感染人體之后導(dǎo)致p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白分別被病毒腫瘤蛋白E6和E7滅活，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期的紊亂，TOP2A和ki-67等核蛋白由于細(xì)胞分裂增加而表達(dá)也明顯增加，因此聯(lián)合TOP2A抗體和ki-67抗體檢測可應(yīng)用于宮頸癌的免疫組織化學(xué)進行篩查[22-23]。Zhang等[24]研究顯示TOP2A在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，體外實驗通過轉(zhuǎn)染特異性小干擾RNA，使結(jié)腸癌細(xì)胞中TOP2A基因沉默，從而導(dǎo)致TOP2A蛋白的表達(dá)缺失，進而抑制細(xì)胞增殖和侵襲能力，而這一現(xiàn)象可能的潛在機制為敲除TOP2A不僅影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（bcl-2和bax）和侵襲相關(guān)蛋白（MMP-2和MMP-9）的表達(dá)，還降低了細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和蛋白激酶B（AKT）的磷酸化水平。

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫是用來預(yù)測基因與腫瘤預(yù)后相關(guān)的在線分析平臺。本研究發(fā)現(xiàn)TOP2A與卵巢癌患者的總體生存率和無瘤進展率存在負(fù)相關(guān)，即高表達(dá)TOP2A卵巢癌患者的總體生存時間和無瘤進展生存時間要短于TOP2A低表達(dá)者。進一步分層分析發(fā)現(xiàn)，TOP2A表達(dá)水平對卵巢漿液性囊腺癌患者的總體生存時間的影響較卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌的總體生存時間影響更為顯著，相反，TOP2A對卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌患者的無瘤進展生存時間影響較卵巢漿液性囊腺癌患者的無瘤進展生存時間影響大。Ferrandina等[25]研究表明在高級別卵巢癌和晚期疾病中觀察到TOP2A mRNA表達(dá)顯著升高，并且核TOP2A蛋白過表達(dá)的患者總體生存時間明顯降低。此外，F(xiàn)aggad等[26]也發(fā)現(xiàn)TOP2A在卵巢癌組織中高表達(dá)，并且表達(dá)量越高預(yù)后越差。TOP2A基因編碼的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα與細(xì)胞的分裂增殖密切相關(guān)，而拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα的異常高表達(dá)則加快了斷裂卵巢腫瘤細(xì)胞中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)鏈，促進DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的進行，從而增加了腫瘤細(xì)胞的分裂增殖能力，導(dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后不良[27-28]。

綜上，基于Oncomine數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)TOP2A在卵巢癌組織中高表達(dá)，且與卵巢癌患者的預(yù)后有關(guān)，術(shù)前評估卵巢癌患者中TOP2A表達(dá)，這可能有助于評估患者的風(fēng)險狀況、預(yù)后和預(yù)測價值。同時為TOP2A作為腫瘤治療的新靶點提供新的依據(jù)，也為卵巢癌的治療提供新的方向。