郭 紅 邱 月 魏建平 張宇翔 袁亞宏 岳田利,

(1.西北大學食品科學與工程學院， 西安 710069； 2.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院， 陜西楊凌 712100)

0 引言

細胞暴露于非理想的生長條件及任何降低細胞活力或適應性的環(huán)境都可以被認為是壓力[1]。高滲壓力是一大類主要的非生物壓力[2]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是一種溫和耐滲酵母，已成為研究滲透壓耐受性的模型菌株。目前，對于釀酒酵母耐滲機理的研究主要集中在高滲透性甘油促分裂原活化蛋白激酶(High-osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase, HOG-MAPK)途徑[2-4]，通過甘油的產(chǎn)生調節(jié)滲透壓平衡[5-6]。HOG-MAPK途徑中的細胞膜傳感器感知壓力信號，將壓力信號傳輸至Hog1激酶，Hog1磷酸化(Hog1-PP)后進入細胞核，進而調節(jié)轉錄反應[4]。在0.2 g/mL糖脅迫下的轉錄反應表明，釀酒酵母誘導了與壓力反應途徑、修復途徑和HOG途徑有關的基因[7]。在0.4 g/mL糖壓力下，釀酒酵母增加了糖酵解和戊糖途徑等相關基因的表達[8]。在0.6 g/mL的糖脅迫下，釀酒酵母誘導了半胱氨酸蛋白酶和線粒體依賴性凋亡[9]，但是在此條件下，釀酒酵母細胞壁(膜)的變化與分子機制尚不清楚。此外，釀酒酵母還是一種可揭示與高滲壓力變化有關的病理特征(例如缺血和糖尿病昏迷)的模型菌株[4,9]，高滲應激也能誘導人細胞系凋亡[10]。

細胞壁是細胞在壓力下存活所必需的。在高滲壓力下，一方面，酵母轉向更低滲透壓環(huán)境會增加細胞體積，從而破壞細胞膜的完整性，為了抵消這種壓力，酵母細胞壁具有保護細胞膜免于被爆裂的作用。另一方面，高滲透壓會導致酵母細胞內的水流出和細胞收縮，且會造成多種細胞生物過程的破壞，例如破壞細胞骨架結構、觸發(fā)細胞周期停滯和凋亡[6]。然而，釀酒酵母細胞表面響應在極端高糖壓力的應對機制尚不清楚。為此，本文比較研究釀酒酵母細胞壁(膜)在高糖壓力下的變化，并通過全局轉錄文件對其進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母(ATCC38531)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；幾丁質酶和β-葡聚糖降解酶購自上海源葉公司；D-葡糖胺、4-二甲基氨基苯甲醛、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH值 7.2～7.4)、卡爾科弗盧爾熒光增白劑(Calcofluor white stain, CFW)、碘化丙啶(PI)和赫斯特熒光燃料33342(Hoechst 33342)購自美國Sigma-Aldrich公司；酵母提取物、蛋白胨、D-(+)-葡萄糖和多肽購自當?shù)毓獭?/p>

1.2 細胞培養(yǎng)

釀酒酵母ATCC38531在YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖)肉湯中30℃培養(yǎng)，直至培養(yǎng)物處于指數(shù)后期(菌體濃度約1×108CFU/mL)。然后使用YPD培養(yǎng)基(0.02 g/mL葡萄糖)作為基礎和無應激培養(yǎng)基，使用60%YPD(0.6 g/mL葡萄糖)作為高糖培養(yǎng)基[11]。取20 mL培養(yǎng)至指數(shù)后期的釀酒酵母(菌體濃度約2×109CFU/mL)接種到60%YPD培養(yǎng)基中，至菌體濃度為2×107CFU/mL，然后30℃適應4 h。將分別在YPD培養(yǎng)基和60%YPD培養(yǎng)基中適應4 h的釀酒酵母細胞洗滌并重懸于PBS中，并作為對照組的樣品和高滲脅迫處理組的樣品。

1.3 細胞壁特性變化分析

1.3.1細胞壁中幾丁質和β-葡聚糖含量測定

根據(jù)文獻[12]報道的方法分離對照組和處理組釀酒酵母的細胞壁并定量測定細胞壁幾丁質和β-葡聚糖的含量。

1.3.2細胞壁染色

根據(jù)文獻[13]報道的方法進行酵母細胞的CFW染色試驗。將2 μL CFW染色的細胞上樣到載玻片上，在頂部添加蓋玻片，使用Andor CSU-W型共聚焦顯微鏡拍攝圖像。

1.3.3細胞壁酶解

根據(jù)文獻[14]報道的方法，選擇葡聚糖特異性降解酶對對照組細胞和高濃度葡萄糖處理組的細胞進行細胞壁的降解試驗，從而對細胞壁的靈敏性進行分析。將對照組和高濃度葡萄糖處理組的細胞用超純水洗滌，分別在NaH2PO4(0.1 mol/L)、0.04%NaN3和40 μg/mL降解酶的緩沖液中稀釋至細胞在660nm處OD值為0.73。每小時監(jiān)測細胞濃度的變化并測定對照組和高濃度葡萄糖處理組的酵母細胞酶解后的OD值，重復3次。

1.4 細胞膜的PI和Hoechst 33342雙染試驗

根據(jù)文獻[15]報道的方法并做了一些改進，進行釀酒酵母細胞膜完整性分析的雙染試驗。染色試驗需要添加至少0.1 μg/μL PI和10 μg/μL Hoechst 33342。細胞染色處理后在熒光顯微鏡(德國Lecia公司)下觀察酵母細胞。

1.5 RNA提取的樣品制備

RNA提取的樣品為分別在YPD培養(yǎng)基和60%YPD培養(yǎng)基中適應4 h的釀酒酵母細胞，即對照組的樣品和高滲脅迫處理組的樣品。每個樣品重復3次，收集所有樣品，隨后用液氮快速冷凍并在-80℃下儲存，用于RNA提取。

1.6 轉錄組分析

RNA的提取準備、RNA質量檢測、cDNA文庫構建和RNA測序在北京諾禾公司進行。按照TRIzol試劑的說明書提取細胞總RNA并用無RNase的DNA酶I處理。使用NanoDrop型分光光度計(美國Thermo Scientific公司)、Qubit 2.0型熒光計(美國Life Technologies公司)、瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100型生物分析儀(美國Agilent Technologies公司)測定RNA樣品的濃度、純度和完整性[11，16]。根據(jù)文獻[17-18]構建cDNA文庫，并在Illumina Hiseq 2000平臺(美國San Diego公司)上測序。

1.7 差異表達基因鑒定

從對照組和處理組樣品中測序并產(chǎn)生原始讀數(shù)。通過過濾銜接子序列獲得高質量的RNA-Seq純凈序列讀數(shù)。通過HISAT 2.0將釀酒酵母的純凈序列讀數(shù)與釀酒酵母S288C的參考基因組比對。通過HTSeq v0.6.1量化基因表達值。DESeq v1.10.1用于確定對照組和處理組樣品之間的差異表達基因(DEG)。如果基因變化倍數(shù)以2為底的對數(shù)值大于0且顯著性p<0.05，則認為基因顯著差異表達。根據(jù)文獻[11]，通過GOSeq Release 2.12進行DEG的GO富集分析。本試驗測定的RNA-seq數(shù)據(jù)已經(jīng)存入國家生物技術信息中心，登錄號為PRJNA437612。

2 結果及分析

2.1 極端高糖壓力對釀酒酵母細胞壁的影響

為探索釀酒酵母在極端高糖條件下細胞壁特性的變化，測定了對照組和高糖壓力處理組釀酒酵母細胞壁中幾丁質和葡聚糖的含量。如圖1a所示，釀酒酵母細胞壁在高糖壓力下適應4h后幾丁質含量(質量比，以每毫克干細胞壁質量計)從6 μg/mg增加到6.9 μg/mg，葡聚糖含量從128 μg/mg增加到138 μg/mg。如圖1b、1c所示，相比對照組細胞，處理組的釀酒酵母細胞對CFW染料的結合顯示出高靈敏性，并且CFW染色的高靈敏性主要富集在芽頸的區(qū)域。此外，如圖1d所示，處理組的細胞在降解酶處理3 h后細胞濃度(660 nm處OD值)有49%的下降，而對照組僅有25%的下降，這說明了經(jīng)過高糖壓力處理的釀酒酵母的細胞壁更易受到葡聚糖特異性降解酶的降解。以上的現(xiàn)象可能是因為釀酒酵母在高糖壓力下細胞壁葡聚糖-幾丁質層遭到了損傷或者破壞。

2.2 極端高糖壓力對釀酒酵母細胞膜的影響

為研究極端高糖壓力對釀酒酵母細胞膜的影響，進行雙染試驗來區(qū)分細胞膜完整的細胞和細胞膜損傷的細胞[13,15]。PI染料不可滲入具有完整細胞膜的細胞，但它可以容易地滲入到細胞膜受損的細胞中并使該細胞染色，而留下具有完整細胞膜的細胞未被染色。而細胞膜完整和細胞膜受損的細胞都可以被細胞穿透性染料Hoechst 33342染色。熒光圖像結果顯示，經(jīng)過0.6 g/mL高糖壓力分別處理4 h和8 h的部分細胞能被PI染料染成紅色而對照組的細胞未被PI染料染色，這說明高濃度葡萄糖處理的細胞細胞膜受到了損傷(圖2)，而對照組細胞的細胞膜未受到損傷。

圖2 高滲脅迫對釀酒酵母細胞膜完整性的影響Fig.2 Effects of high sugar stress on integrity of cell membrane

2.3 釀酒酵母細胞的RNA測序結果

為解釋以上發(fā)現(xiàn)，對對照組細胞和處理組細胞進行了全局的RNA-seq測序。差異基因火山圖如圖3所示，有顯著性差異表達的基因用紅色點(上調)和綠色點(下調)表示，無顯著性差異表達的基因用藍色點表示。本試驗中鑒定出釀酒酵母在適應0.6 g/mL極端高糖壓力下上調表達的1 959個和下調表達的1 955個基因(DEGs)(圖3)。這個基因數(shù)量要顯著多于釀酒酵母在應對0.2 g/mL糖質量濃度下獲得的294個差異基因[7]和釀酒酵母在應對0.4 g/mL糖質量濃度條件下獲得的589個差異基因[8]。由此可以看出，釀酒酵母隨著環(huán)境糖濃度的增加，差異表達的基因也增加。這可能是因為隨著環(huán)境壓力的增加，細胞應對環(huán)境壓力的調節(jié)機制變得更復雜。為此，本文著重關注與表型結果相關的細胞膜和細胞壁的DEGs。

圖3 差異基因火山圖Fig.3 Volcano diagram of DEGs

2.4 極端高糖壓力對釀酒酵母細胞膜代謝途徑的影響

本研究觀察到與細胞膜相關的脂肪酸/不飽和脂肪酸合成、脂肪酸代謝、脂肪酸降解、脂肪酸延長等途徑在極端高糖壓力下均發(fā)生了顯著變化(表1、圖2)。這說明0.6 g/mL高糖壓力可能通過干預脂肪酸的組成和含量來影響膜的流動性或滲透性。文獻[19]表明脂肪酸通過改變膜的流動性或滲透性來參與對外部應激的反應。

2.5 極端高糖壓力對釀酒酵母細胞壁完整性(CWI)信號傳導途徑的影響

極端高糖壓力誘導了釀酒酵母一系列與細胞壁組成和生物發(fā)生相關的基因的差異表達(表2)。細胞壁完整性(CWI)信號通路相關基因顯著的差異表

表1 與細胞膜相關的差異表達基因Tab.1 Differentially expressed genes associated with plasma membrane compartments and functions

達進一步支持了從圖1中觀察到的細胞壁變化。釀酒酵母在高糖壓力下與細胞壁有關的一些關鍵信號基因(ROM1、PIR3、YGP1和CWP1)和主要轉錄因子RLM1被下調(表2、圖4d)。此外，RLM1的22個靶標基因中有6個基因過表達，有6個基因被抑制，這些靶標基因編碼與細胞壁組織和細胞壁生物發(fā)生相關的蛋白質(圖4d)。

表2 與細胞壁相關的差異表達基因Tab.2 Differentially expressed genes associated with cell wall compartments and functions

3 討論

膜外排泵在假單胞菌耐滲過程中起關鍵作用。細菌外排泵(AcrAB-TolC)在大腸桿菌中的過表達導致其對環(huán)境壓力的耐受性增加[14]。與細菌泵系統(tǒng)類似，酵母細胞的排毒功能主要由多效藥物抗藥性(PDR)泵驅動，PDR泵是酵母細胞膜上ABC轉運蛋白(ATP-binding cassette)的一個子家族[20]。ABC轉運蛋白通過釋放細胞有害分子來應對環(huán)境壓力[21]。在真菌擴展青霉中，ABC轉運蛋白基因的下調表達降低了耐藥性[18]。釀酒酵母的ABC轉運蛋白基因(YOR1和PDR15)在高糖脅迫下分別下調表達了2.8倍和2.0倍(表1)，這表明本研究使用的極端高滲壓力(0.6 g/mL糖)可能降低了釀酒酵母的排毒功能。0.6 g/mL高糖壓力還影響了釀酒酵母細胞膜上碳水化合物、異源蛋白和氨基酸轉運蛋白的活性(表1)，這個結果與檸檬醛壓力對釀酒酵母細胞膜轉運蛋白的影響類似[14]。麥角固醇是真菌細胞膜的主要成分之一，它被認為對調節(jié)細胞的結構、滲透、生長和增殖至關重要[18]。在本研究中，參與麥角固醇生物合成的大多數(shù)基因(ERG1～4)的表達水平被上調(表1)，這說明釀酒酵母在0.6 g/mL高糖壓力下可能增加合成麥角固醇，這與文獻[2]報道的魯氏接合酵母通過上調麥角固醇合成的相關基因來應對高滲壓力類似。麥角固醇與脂肪酸兩者比例的變化已被報道影響細胞膜的流動性[2]，這也進一步說明0.6 g/mL高糖壓力影響細胞膜流動性，但是細胞膜流動性對細胞響應高滲壓力的具體作用機制尚待進一步研究。此外，如圖5所示，GO分析前30條下調的GO分類，縱坐標表示GO術語，橫坐標表示每個GO術語的差異基因數(shù)量，“*”顯示顯著性，觀察到多達393個DEGs富集在膜組分GO分類上且均被下調(圖5)，這些DEGs可能在膜上發(fā)揮功能。上述細胞膜基因的顯著變化，結合試驗中發(fā)現(xiàn)的脂肪酸、麥角固醇等成分的基因在高滲脅迫下的差異表達，支持了雙染試驗中發(fā)現(xiàn)的細胞膜損傷的現(xiàn)象(圖2)。

圖4 細胞壁完整性(CWI)信號通路在不同壓力下的轉錄表達Fig.4 Cell wall integrity signaling pathway with transcriptomic expression changes during different stresses

圖5 GO功能分類分析下調的差異基因Fig.5 GO functional classification of down-regulated DEGs

細胞壁對細胞存活至關重要[14]。它的晶格結構通過纖維素和幾丁質鏈之間強大的氫鍵網(wǎng)絡以及3個壁成分(葡聚糖、甘露糖蛋白和幾丁質)之間的共價糖苷鍵緊密地結合在一起。CFW是一種熒光染料，通過與幾丁質和多糖之間的氫鍵結合到細胞壁[14]，但是在真菌中，CFW優(yōu)先結合位于細胞壁發(fā)芽頸中的幾丁質[22]。在圖1b、1c的細胞壁CFW染色試驗中，每個處理組的細胞數(shù)量相同，但是有更多的CFW染料與處理組的細胞結合，說明高糖壓力處理的釀酒酵母對CFW敏感性增加。文獻[23-24]表明白色念珠菌、黑曲霉和許多其它真菌對CFW的敏感性增加表明細胞壁受損。以前的報道還表明幾丁質聚合物的晶格結構破裂會削弱細胞壁，從而導致細胞停滯和幾丁質在釀酒酵母細胞中的積累[24]，這種機制與結果中細胞幾丁質含量增加(圖1a)和CFW敏感性增加(圖1c)的結果一致，而且與已報道的0.6 g/mL高糖壓力抑制釀酒酵母生長的結果一致[2,9]。此外，在用極端高糖壓力處理釀酒酵母后，細胞壁對葡聚糖特異性裂解酶的降解更敏感，這表明釀酒酵母在極端高糖壓力下可能發(fā)生了去結晶作用(圖1)，推測釀酒酵母細胞壁相關的基因可通過調節(jié)細胞壁多糖-幾丁質層[25]的交聯(lián)程度來應對高滲壓力。

釀酒酵母在極端高糖壓力下的轉錄結果進一步表明細胞壁正在承受壓力。在這項研究中發(fā)現(xiàn)的13個差異表達基因(HSP12、CWP1、PIR3、CRH1、GFA1、PST1、SLT2、SRL3、MLP1、YPL0882、PRM5、YHR097C和FBP26)同屬于文獻[26]報道的一個包含20個特征基因的基因簇，這20個特征基因代表了細胞壁正在承受壓力的轉錄指紋圖譜，其中有一些特征基因直接參與細胞壁完整性(CWI)信號通路(圖4d)。在極端高糖壓力下，釀酒酵母抑制了細胞表面?zhèn)鬟f壓力信號的鳥嘌呤核苷酸交換因子ROM1(表1)，然后它下游的RLM1被抑制(表1)。RLM1的6個靶標基因(PIR1、CWP1、PIR3、SPS100、FIT2和YGP1)下調表達，特別是細胞壁組織和穩(wěn)定性所必需的PIR3和YGP1分別下調了12.6倍和5.8倍(圖4d和表2)。研究表明RLM1是編碼負責輸出CWI大部分轉錄基因的關鍵轉錄因子[21]。圖4還顯示了釀酒酵母依賴RLM1調節(jié)的CWI信號傳導途徑在不同壓力因子下的差異調節(jié)。釀酒酵母在0.6 g/mL高糖壓力下生長受到抑制甚至開始凋亡[2,9]，在試驗中(0.6 g/mL糖壓力下)RLM1轉錄因子下調表達，同時也造成由RLM1轉錄的靶標基因發(fā)生改變。釀酒酵母在0.2 g/mL 和0.4 g/mL糖質量濃度下均生長良好，并沒有發(fā)生RLM1轉錄因子的改變以及大多數(shù)由RLM1轉錄的靶標基因的改變[7-8]，這些結果說明了釀酒酵母在進一步的糖壓力下RLM1被抑制并失去了維持細胞穩(wěn)定的能力。

4 結束語

本研究測定了在0.6 g/mL極端高糖壓力下釀酒酵母細胞壁組分的變化，采用染色試驗和酶降解試驗研究了細胞壁(膜)的結構變化，并通過全局轉錄文件對發(fā)現(xiàn)的表型結果進行分析討論。結果表明,在0.6 g/mL極端高糖壓力下，通過下調釀酒酵母與細胞壁完整性(CWI)信號傳導途徑、細胞膜成分相關的基因(ROM1、RLM1、PIR3、YGP1、CWP1、PDR15、YOR1等)，進行細胞壁(膜)高滲損傷的應激反應，0.6 g/mL極端高糖壓力改變了釀酒酵母細胞壁特性和細胞膜流動性。本文為進一步研究釀酒酵母的高滲脅迫應對機制奠定了基礎。