王 偉，郭 雯，董海北，許猛軍，馬高磊，吳小進(jìn)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的80%，盡管對(duì)其治療取得了一定的進(jìn)步，但晚期NSCLC患者的預(yù)后仍然很差[1-2]。自靶向治療出現(xiàn)以來(lái)，晚期NSCLC的治療方法可能會(huì)發(fā)生變化，但基于順鉑的雙線藥物仍然是大多數(shù)晚期NSCLC患者治療的基礎(chǔ)，肺腺癌在NSCLC中占比最高。而對(duì)順鉑藥物的抗性已經(jīng)成為影響肺癌治療效果的主要因素。為了克服耐藥性，已采用二線或聯(lián)合化療方案，但NSCLC中各種化療的總體生存獲益尚不令人滿意[3-4]。靈芝孢子提取物含有大量多糖、三萜類化合物、黃酮類化合物、香豆素、醌、類胡蘿卜素、氨基酸，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗癌等作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子提取物具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，是結(jié)腸癌、早幼粒細(xì)胞白血病、胃癌等各種癌細(xì)胞的體外抑制劑[5-6]。具有PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ)是Hippo途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，該途徑是器官大小、干細(xì)胞維持和腫瘤發(fā)生的重要調(diào)節(jié)劑。TAZ主要通過TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族來(lái)刺激促進(jìn)細(xì)胞增殖和控制器官大小基因的表達(dá)[7]。最近的研究一致表明，TAZ和(或)其旁系同源YAP的上調(diào)賦予了對(duì)多種細(xì)胞毒劑如抗微管蛋白、抗代謝物和DNA破壞劑的抗性[8]。已有研究證明，TAZ在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)誘導(dǎo)對(duì)紫杉醇和阿霉素的耐藥性，其靶基因CYR61和CTGF的上調(diào)有助于耐藥性的發(fā)展[9]。本研究擬探討靈芝孢子提取物對(duì)肺腺癌H1299細(xì)胞順鉑化療敏感性及TAZ表達(dá)的影響，為肺腺癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 10%胎牛血清、Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：R6081、R2078)；靈芝孢子提取物、DMEM培養(yǎng)基、RIPA緩沖液、聚偏氟乙烯膜(美國(guó)sigma公司，批號(hào)：S05167、S10262、S11825、S09156)；順鉑、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)、結(jié)晶紫染液(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：181026、181022、181103)；4%多聚甲醛、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(德國(guó)默克公司，批號(hào)：DM4419、DM5013)；Annexin V-Alexa Fluor 647/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京福麥斯生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：M0917)；Transwell室(美國(guó)Chemicon公司，批號(hào)：CA55671)；SYBR?PrimeScript?PLUS RT-RNA PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司，批號(hào)：B0816)；10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(美國(guó)賽默飛世爾科技公司，批號(hào)：MS66179)；抗TAZ抗體、抗GAPDH抗體(美國(guó)CST公司，批號(hào)：C6317、C7059)；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab09486)。ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；奧林巴斯BX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；AS-90流式細(xì)胞儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；ABI7500實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)通用公司)；Molecular Imager系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌H1299細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃以及5% CO2。

1.3細(xì)胞分組 H1299細(xì)胞組如前所述常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理；順鉑組的培養(yǎng)方法同H1299細(xì)胞組，加入順鉑，使順鉑最終濃度為40.0 μg/ml(預(yù)實(shí)驗(yàn)順鉑對(duì)H1299細(xì)胞的半數(shù)致死濃度為80.0 μg/ml，以1/2半數(shù)致死濃度為作用劑量)；靈芝孢子提取物組培養(yǎng)方法同H1299細(xì)胞組，加入靈芝孢子提取物，使靈芝孢子提取物最終濃度為80.0 μg/ml(預(yù)實(shí)驗(yàn)靈芝孢子提取物對(duì)H1299細(xì)胞的半數(shù)致死濃度為160.0 μg/ml，以1/2半數(shù)致死濃度為作用劑量)；聯(lián)合組的培養(yǎng)方法同H1299細(xì)胞組，加入順鉑40.0 μg/ml以及靈芝孢子提取物80.0 μg/ml；上述各組細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、2% O2、93% N2)培養(yǎng)。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.4細(xì)胞增殖及單克隆形成數(shù)目測(cè)定 CCK-8檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞增殖，根據(jù)試劑說明書的操作方法，收集培養(yǎng)結(jié)束時(shí)各組H1299細(xì)胞，使用ELx800酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量OD值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。細(xì)胞克隆形成測(cè)定，收集培養(yǎng)結(jié)束的各組H1299細(xì)胞接種在6孔板(1×103個(gè)/孔)中，并培養(yǎng)10 d。每3天更換1次培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞克隆形成數(shù)目。

1.5細(xì)胞凋亡測(cè)定 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，各組H1299細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用膠原酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞并將其重懸于結(jié)合緩沖液中，將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V-Alexa Fluor 647和PI染色，然后在室溫下孵育15 min，使用AS-90流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.6細(xì)胞侵襲遷移能力測(cè)定 ①細(xì)胞侵襲測(cè)定通過使用帶有8 μm孔徑插入物的Transwell室進(jìn)行。在200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基中將各組H1299細(xì)胞(2×104個(gè))接種到頂室中，并將600 μl完全培養(yǎng)基添加到底室。培養(yǎng)12及24 h后，分別將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色。從5個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，然后取平均值。②傷口愈合試驗(yàn)測(cè)定遷移率，將各組H1299細(xì)胞接種在6孔板上，加入無(wú)血清培養(yǎng)基再孵育24 h，用200 μl移液器鈍頭在每個(gè)孔中進(jìn)行一次刮擦，使用倒置顯微鏡在12 h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。使用Image J 1.47軟件計(jì)算傷口閉合的百分比(遷移率)。

1.7細(xì)胞TAZ mRNA水平的檢測(cè) 使用Trizol試劑提取培養(yǎng)結(jié)束時(shí)H1299細(xì)胞的總RNA。實(shí)時(shí)PCR分析使用SYBR?PrimeScript?PLUS RT-RNA PCR試劑盒，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算TAZ的總倍數(shù)變化。應(yīng)用ABI7500實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)，QRT-PCR在95℃進(jìn)行15 s，然后在95℃進(jìn)行5 s，在60℃進(jìn)行34 s，共40個(gè)循環(huán)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所用的引物序列如下，TAZ正向：5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，TAZ反向：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'；U6正向：5'-ATGCGAGTTGTTCTCCGTCT-3'，U6反向：5'-TATCTGCGGTTTCCTCAAGC-3'。

1.8細(xì)胞TAZ蛋白水平的檢測(cè) 在含有新鮮蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中裂解細(xì)胞。蛋白質(zhì)通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。將膜在5%脫脂奶中封閉，并加入抗TAZ抗體(1∶1000稀釋)，抗GAPDH抗體(1∶2000稀釋)，在4℃下孵育過夜。GAPDH用作內(nèi)源對(duì)照。然后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶1000稀釋)，在室溫下孵育2 h，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑對(duì)蛋白印跡進(jìn)行顯影，并使用Molecular Imager系統(tǒng)進(jìn)行掃描。通過數(shù)字圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus版本6.0)對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1OD值和存活率比較 與H1299細(xì)胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯(lián)合組的OD值和存活率明顯降低(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯(lián)合組的OD值和存活率明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組肺腺癌H1299細(xì)胞的OD值和存活率比較

注：與H1299細(xì)胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，cP<0.05；與靈芝孢子提取物組比較，eP<0.05

2.2細(xì)胞克隆形成數(shù)目比較 H1299細(xì)胞組、順鉑組、靈芝孢子提取物組和聯(lián)合組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別為(1698.49±213.32)個(gè)、(654.36±98.36)個(gè)、(642.32±59.69)個(gè)和(263.36±54.65)個(gè)。與H1299細(xì)胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯(lián)合組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯降低(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯(lián)合組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 4組肺腺癌H1299細(xì)胞克隆形成數(shù)目(結(jié)晶紫染色 ×200)

A.H1299細(xì)胞組；B.順鉑組；C.靈芝孢子提取物組；D.聯(lián)合組

2.3細(xì)胞凋亡率比較 H1299細(xì)胞組、順鉑組、靈芝孢子提取物組和聯(lián)合組的細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別為(0.84±0.54)%、(2.56±0.65)%、(2.34±0.63)%和(5.47±0.54)%。與H1299細(xì)胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。

2.4細(xì)胞侵襲遷移能力比較 與H1299細(xì)胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯(lián)合組的穿膜細(xì)胞數(shù)和遷移率明顯降低(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯(lián)合組穿膜細(xì)胞數(shù)和遷移率明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

2.5TAZ mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 與H1299細(xì)胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯(lián)合組TAZ mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯(lián)合組TAZ mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表3、圖3。

表2 4組肺腺癌H1299細(xì)胞侵襲遷移能力的比較

注：與H1299細(xì)胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，cP<0.05；與靈芝孢子提取物組比較，eP<0.05

圖2 4組肺腺癌H1299細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)(結(jié)晶紫染色 ×200)

A.H1299細(xì)胞組；B.順鉑組；C.靈芝孢子提取物組；D.聯(lián)合組

表3 4組肺腺癌H1299細(xì)胞TAZ mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

注：TAZ為具有PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共激活因子；與H1299細(xì)胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，cP<0.05；與靈芝孢子提取物組比較，eP<0.05

圖3 4組肺腺癌H1299細(xì)胞TAZ蛋白表達(dá)水平

A.H1299細(xì)胞組；B.順鉑組；C.靈芝孢子提取物組；D.聯(lián)合組；TAZ為具有PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共激活因子

3 討論

在晚期NSCLC患者中常單獨(dú)使用鉑類化療或與其他藥物聯(lián)合使用作為第一線療法，但對(duì)順鉑的耐藥性仍然是主要的臨床問題。目前，對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制尚不完全清楚，但研究認(rèn)為其本質(zhì)上是多因素的，包括DNA結(jié)合不足，解毒和DNA修復(fù)增加，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)失調(diào)，以及涉及細(xì)胞死亡途徑的基因(例如p53、Bcl-2和AKT/mTOR)表達(dá)和活化改變。在上述途徑中，AKT/mTOR途徑的激活在順鉑耐藥性中起重要作用。靈芝孢子提取物具有多種功能，如阻止組胺釋放和抑制過度激活的免疫系統(tǒng)，并具有調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫的作用。靈芝孢子提取物具有多種有效成分，包括多糖、三萜、生物堿、酶和蛋白質(zhì)[10]。有研究人員發(fā)現(xiàn)，來(lái)自靈芝的三萜類化合物抑制了脂多糖-刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子-α、白介素-6、炎性一氧化氮和前列腺素E2。此外靈芝孢子提取物對(duì)肝癌、肺癌均有明顯的抑制作用[11-12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與H1299細(xì)胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯(lián)合組的OD值、存活率、細(xì)胞克隆形成數(shù)目、侵襲遷移能力均明顯降低，凋亡率明顯升高；與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯(lián)合組的OD值、存活率、細(xì)胞克隆形成數(shù)目、侵襲遷移能力均明顯降低，凋亡率明顯升高。該結(jié)果與上述討論一致，同時(shí)說明靈芝孢子提取物能明顯抑制肺腺癌H1299細(xì)胞的增殖、侵襲，并促進(jìn)其凋亡；而當(dāng)靈芝孢子提取物與順鉑聯(lián)合使用時(shí)，順鉑的抗腫瘤作用更強(qiáng)，這提示靈芝孢子提取物對(duì)肺腺癌H1299細(xì)胞順鉑化療具有增敏作用。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，TAZ是肺癌的致癌基因，對(duì)肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移具有重要作用。臨床肺癌研究報(bào)告顯示，TAZ在60%以上的NSCLC中過表達(dá)，其表達(dá)與腺癌分化不良、轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后和生存密切相關(guān)[13]。此外，TAZ可增強(qiáng)口腔鱗狀細(xì)胞癌、尿路上皮細(xì)胞癌和卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性[14]。最近多項(xiàng)研究均表明，TAZ的上調(diào)可以增強(qiáng)對(duì)多種細(xì)胞毒性劑的抗性，如人乳腺癌細(xì)胞可通過TAZ-TEAD-Cyr61/CTGF信號(hào)通路對(duì)紫杉醇產(chǎn)生抗性；基因表達(dá)譜研究將TAZ鑒定為原發(fā)性乳腺癌干細(xì)胞系活化、致瘤、轉(zhuǎn)移的中心介體[15-16]。順鉑耐藥的口腔鱗癌細(xì)胞核TAZ表達(dá)量明顯高于非順鉑耐藥的口腔鱗癌細(xì)胞。此外，TAZ敲低還能通過增加DNA損傷和細(xì)胞凋亡使尿路上皮癌細(xì)胞對(duì)化療和放射治療的敏感性增加；TAZ信號(hào)可能通過增加細(xì)胞自噬通量來(lái)調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞中的順鉑耐藥性[17-18]。本研究結(jié)果顯示，與H1299細(xì)胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯(lián)合組的TAZ mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯(lián)合組的TAZ mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。這說明順鉑或靈芝孢子提取物單獨(dú)作用時(shí)，均能明顯抑制H1299細(xì)胞的TAZ mRNA和蛋白表達(dá)；而順鉑聯(lián)合靈芝孢子提取物治療對(duì)H1299細(xì)胞TAZ mRNA和蛋白表達(dá)的抑制更加強(qiáng)烈。提示靈芝孢子提取物能增強(qiáng)順鉑對(duì)H1299細(xì)胞TAZ mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用。

綜上所述，靈芝孢子提取物對(duì)肺腺癌H1299細(xì)胞順鉑化療具有增敏作用；其機(jī)制與靈芝孢子提取物能增強(qiáng)順鉑對(duì)H1299細(xì)胞TAZ mRNA和蛋白表達(dá)的抑制有關(guān)。