王慶旭

(濮陽市油田總醫(yī)院放療科，河南 濮陽 457000)

結腸癌是一種十分常見的消化道腫瘤之一，每年導致近70萬人死亡[1]。據(jù)統(tǒng)計，結直腸癌在近幾十年來的診斷和治療中雖然有所改善，但是仍然有25%到30%的患者因未能及時做出診斷而錯過了手術切除的最佳機會，有近30%到50%的患者在手術切除后有復發(fā)和轉移的情況[2]。因此，尋找新的調控結直腸癌發(fā)生的分子機制對于結直腸癌的診斷和靶向治療具有重要的意義。

miRNA是一種小的非編碼RNA分子，可以通過與靶基因mRNA的互補結合來調節(jié)mRNA的翻譯，來阻斷蛋白質的表達，或導致mRNA的降解[3]。有大量的研究表明，miRNAs在基因表達調控中起著重要作用，miRNAs在不同的腫瘤中的表達情況不同，這引起了人們的廣泛關注[4]。miR-141-3p是一類保守性的miRNAs，在不同癌癥中均有異常表達。例如，在前列腺癌中miR-141-3p通過抑制KLF-9的表達促進前列腺癌細胞的增殖[5]。miR-141-3p通過靶向p53促進膠質母細胞瘤的進展和耐藥性[6]。此外還有研究表明miR-141-3p在乳腺癌[7]和胃癌等中也發(fā)揮作用。但miR-141-3p在結腸癌中的機制和功能少有研究。

UNC5C是一種新的受體，屬于UNC5H功能依賴性受體家族，具有誘導細胞凋亡的能力[8]。在近幾十年的研究中，UNC5C不僅在調控細胞的遷移、血管網(wǎng)絡的建成和組織發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，還參與了腫瘤發(fā)生及腫瘤的轉移等過程[9]。UNC5C在正常組織中廣泛表達，但在多種腫瘤組織中表達下調。例如，在人腎癌細胞[10]和前列腺癌細胞[11]中，UNC5C均出現(xiàn)明顯表達下調。目前，UNC5C在結腸癌組織中表達情況研究較少。

本研究通過探究miR-141-3p和UNC5C對結腸癌細胞的生物學功能的影響，為結腸癌靶向治療提供新的潛在靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生信分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載TCGA-COAD的miRNA成熟體表達數(shù)據(jù)和mRNA的測序數(shù)據(jù)，利用edgeR來鑒定差異基因(|logFC|>2，padj<0.05)，結合樣本的臨床信息對差異miRNA進行生存分析。確定miRNA之后，利用targetScan、miRDB數(shù)據(jù)庫對目標miRNA進行靶向預測，并與差異mRNA取交集，獲得與目標miRNA具有靶向結合位點的差異mRNA。

1.2 細胞培養(yǎng)

人正常結腸上皮細胞系FHC(BNCC338003)以及人結腸癌細胞系HCT-116(BNCC337692)、SW620(BNCC337664)、SW480(BNCC100604)、HT-29(BNCC337732)均購自北納生物。將所有細胞系在含有10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液(Gibco，Carlsbad，CA，UnitedStates)中培養(yǎng)，且放置于37°C下5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中。

1.3 細胞轉染

miR-141-3pmimics，miR-141-3pinhibitor及其陰性對照，購自RiboBioCo.，Ltd.(中國，廣州)。UNC5C過表達質粒(oeUNC5C)及其陰性對照(vector)購自RiboBio。根據(jù)制造商的方案，用Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)進行細胞轉染。溫育48 h后，收獲細胞，然后進行實驗。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

通過TRIzol試劑(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)從組織細胞中提取總RNA，然后用紫外分光光度計(BD，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，United States)測定RNA濃度和純度。使用qScript micro RNA cDNA合成試劑盒(Quantabio，Beverly，MA)將miRNA反轉錄為cDNA。使用cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)將mRNA反轉錄為cDNA。使用ABI Steponeplus Real-time PCR system(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，United States)進行定量PCR試驗，實驗流程為95℃ 3min，95℃ 10 s和59℃ 20 s循環(huán)40次。其中UNC5C以GAPDH作為內參，miR-141-3 p以U6為內參。引物序列如下：miR-141-3pforward：5′-CGCAGTAACACTGTCTGGT-3′；reverse：5′-GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTCCATCT-3′；U6forward：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′；reverse：5′-CGGCTGCAGATGAGATAG-3′；UNC5Cforward：5′-GCAAATTGCTGGCTAAATATCAGGAA-3′；reverse：5′-GCTCCACTGTGTTCAGGCTAAATCTT-3′；GAPDHforward：5′-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCAT-3′；reverse：5′-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′。結果用2-ΔΔCt值來比較對照組和實驗組的目的基因mRNA相對表達量的差異，實驗重復3次。

1.5 Western blot實驗

用RIPA裂解緩沖液(Beyotime，China)提取細胞裂解產(chǎn)物，采用BCA蛋白質測定試劑盒(Beyotime，China)測定蛋白濃度。高溫變性后進行SDS-PAGE。電泳結束后，以150 mA、120 min將蛋白轉移至PVDF膜，并用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4℃過夜孵育。其中一抗為：UNC5C(ab178823，1∶100，Abcam，China)以及GAPDH(ab9485，1∶2500，Abcam，China)。TBST洗膜3次，每次5 min。然后與二抗山羊抗兔IgG(ab6721，1∶5000，Abcam，China)在室溫下?lián)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。最后使用化學發(fā)光試劑盒(Millipore，Burlington，MA，UnitedStates)檢測蛋白質信號。

1.6 細胞增殖實驗

采用MTT實驗檢測細胞增殖。將結腸癌細胞以每孔10000個接種到96孔板，每孔體積200 μL。分別培養(yǎng)1 d，2 d和3 d后，每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)在37℃下孵育4 h，然后每孔加入100 μL DMSO在37℃下孵育過夜。利用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(Vircell，Spain)，在490 nm波長下測定各孔光吸收值。各組實驗均重復三次。

1.7 細胞劃痕實驗

細胞在培養(yǎng)孔中豐度達到80%時，使用200 μL移液管尖端輕輕刮擦穿過孔中心的單層。將孔用培養(yǎng)基短暫洗滌兩次以除去分離的細胞。加入新鮮培養(yǎng)基，細胞再生長24 h，后用顯微鏡觀察劃痕并拍照以分析細胞遷移情況。

1.8 細胞侵襲實驗

采用24孔Transwell室(8μm孔徑，BDBiosciences，USA)進行Transwell侵襲測定。4℃條件下將Matrigel膠稀釋后，取100 μL均勻鋪于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置1 h。分別將各處理組細胞的濃度調整至5×104個細胞/mL懸液接種于Transwell的上室內，下室加600～800μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取出小室，棉簽擦去微孔膜上室的細胞，PBS沖洗小室上下面2遍，1%的結晶紫染色15 min，PBS沖洗小室，干燥后置于100倍的倒置顯微鏡下觀察。

1.9 雙熒光素酶實驗

將表達載體pmirGLO構建野生型(WT)或突變型(Mut)3′UTRUNC5C結構。將兩種報告質粒、過表達質粒miR-141-3pmimics以及NCmimics分別共轉染至結腸癌HCT-116和SW480細胞中，轉染24 h后裂解細胞，12000 rpm離心1 min，收集上清。使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System，E1910，Promega)檢測熒光素酶活性。每個細胞樣品中加入100 μL螢火蟲熒光素酶工作液檢測螢火熒光素酶，加入100 μL海腎熒光素酶工作液檢測海腎熒光素酶，以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶作為相對熒光素酶活性。實驗重復3次。

1.10 統(tǒng)計學方法

對數(shù)據(jù)進行處理，采用SPSS 22(IBM，SPSS，Chicago，IL，USA)系統(tǒng)，計量資料采用均值±標準差的形式表示，兩組間比較為t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌細胞中miR-141-3p高表達

通過edgeR進行差異分析，共獲取299個差異miRNA(見圖1A)。其中miR-141-3p在結腸癌組織中顯著上調(見圖1B)，且生存分析結果顯示，結腸癌組織中miR-141-3p高表達患者的生存時間顯著低于低表達患者(見圖1C)。然后利用qRT-PCR檢測結腸癌細胞HCT-116、SW620、SW480、HT-29細胞系以及人正常結腸上皮細胞系FHC中miR-141-3p的表達，結果如圖1D。結果表明，與人正常結腸上皮細胞相比，結腸癌細胞系中miR-141-3p的表達水平顯著上調。之后，我們選擇結直腸癌細胞系HCT-116和SW480進行后續(xù)的功能實驗。

2.2 下調miR-141-3p抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲

為了評估m(xù)iR-141-3p在結腸癌細胞系(HCT-116和SW480)中的生物學功能，將miR-141-3pinhibitor和miR-141-3p-NCinhibitor轉染入HCT-116和SW480結腸癌細胞系中。利用qRT-PCR檢測各組細胞系中miR-141-3p的表達，結果表明，轉染miR-141-3pinhibitor后結腸癌細胞中的miR-141-3p表達量顯著降低(見圖2A)。然后通過MTT實驗來檢測各組細胞的增值能力，發(fā)現(xiàn)下調miR-141-3p明顯抑制了結腸癌細胞的增殖能力(見圖2B)。細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力，結果顯示下調miR-141-3p后結腸癌細胞遷移能力明顯低于對照組(見圖2C)。最后通過Transwell實驗分析各組細胞的侵襲能力，結果表明下調miR-141-3p明顯抑制了結腸癌細胞的侵襲能力(見圖2D)。以上實驗表明，下調miR-141-3p會抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

2.3 結腸癌細胞中miR-141-3p靶向結合UNC5C

之后，我們對miR-141-3p的下游調控機制進行了研究。為進一步分析miR-141-3p的靶基因，通過edgeR進行差異分析，共獲得2065個差異mRNA(見圖3A)。利用TargetScan、miRDB兩個數(shù)據(jù)庫對miR-141-3p進行靶基因預測，并與下調的903個差異mRNA取交集，獲得38個與miR-141-3p具有靶向結合位點的靶基因(見圖3B)，并且對它們進行表達分析發(fā)現(xiàn)，UNC5C在結腸癌細胞中呈現(xiàn)極顯著的低表達(見圖3C)。相關性分析顯示，miR-141-3p與UNC5C具有顯著的負相關性(見圖3D)。之后，利用qRT-PCR檢測結腸癌細胞HCT-116、SW620、SW480、HT-29以及人正常結腸上皮細胞系FHC中UNC5C的表達，結果如(見圖3E)。研究發(fā)現(xiàn)與人正常結腸上皮細胞相比，結腸癌細胞系中UNC5C顯著低表達。然后利用WB檢測各細胞系中UNC5C的蛋白表達，結果顯示在結腸癌細胞系中UNC5C的蛋白表達水平明顯下調(見圖3F)。

圖1 結腸癌細胞中miR-141-3p高表達

注：A：TCGA數(shù)據(jù)庫結腸癌的normal組和tumor組的差異miRNA火山圖；B：miR-141-3p在normal組和tumor組的表達量箱線圖，其中淺色表示正常組織，深色表示結腸癌組織；C：miR-141-3p的表達量對患者預后的生存曲線，黑色線表示高表達組，灰色線表示低表達組；D：qRT-PCR檢測結腸癌細胞HCT-116、SW620、SW480、HT-29細胞系以及人正常結腸上皮細胞系FHC中miR-141-3p的表達量；*表示P<0.05。

注：A：qRT-PCR檢測各組細胞系中miR-141-3p的表達；B：MTT實驗來檢測各組細胞的增值能力；C：細胞劃痕實驗檢測各組細胞的遷移能力；D：Transwell實驗分析各組細胞的侵襲能力；*表示P<0.05。

注：A：TCGA數(shù)據(jù)庫結腸癌的normal組和tumor組的差異mRNA火山圖；B：miR-141-3p預測的靶基因和差異mRNA的venny圖；C：UNC5C在normal組和tumor組的表達量箱線圖，其中淺色表示正常組織，深色表示結腸癌組織；D：miR-141-3p與UNC5C的相關性分析；E：qRT-PCR檢測結腸癌細胞HCT-116、SW620、SW480、HT-29細胞系以及人正常結腸上皮細胞系FHC中UNC5CmRNA的表達；F：WB檢測各細胞系中UNC5C的蛋白表達；*表示P<0.05。

為了探究miR-141-3p與UNC5C的結合關系，首先通過miRNA數(shù)據(jù)分析軟件(starBase)尋找UNC5C與miR-141-3p的結合位點，結果顯示UNC5C與miR-141-3p存在結合位點(見圖4A)。利用雙熒光素酶實驗來檢測miR-141-3p和UNC5C的靶向關系，結果表明，上調miR-141-3p會抑制UNC5C-wt的熒光素酶活性，而對UNC5C-mut沒有影響(見圖4B)。然后利用qRT-PCR檢測結腸癌細胞中轉染miR-141-3pmimics或miR-NC后UNC5C的mRNA表達水平，結果發(fā)現(xiàn)過表達miR-141-3p可以顯著下調UNC5C的mRNA表達水平(見圖4C)。通過WB檢測不同組結腸癌細胞中UNC5C的蛋白表達水平，結果表明，過表達miR-141-3p可以顯著下調UNC5C的蛋白表達水平(見圖4D)。以上實驗表明在結腸癌細胞中miR-141-3p能靶向結合UNC5C并且抑制UNC5C的表達。

2.4 miR-141-3p通過靶向UNC5C促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲

為了驗證miR-141-3p是否可以通過靶向UNC5C促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，我們通過過表達結腸癌細胞HCT-116和SW480中的miR-141-3p和UNC5C來進行分析。首先，通過qRT-PCR檢測各組細胞的UNC5CmRNA表達水平，結果表明過表達miR-141-3p可以抑制UNC5CmRNA表達，但是同時過表達UNC5C會減弱過表達miR-141-3p對UNC5CmRNA表達的抑制效果，與對照組無顯著差異(見圖5A)。利用WB檢測各細胞組的UNC5C蛋白水平，結果顯示過表達miR-141-3p后UNC5C的蛋白表達水平顯著下調，但是同時過表達UNC5C后UNC5C蛋白表達水平與對照組無顯著差異(見圖5B)。之后，利用MTT實驗檢測各組細胞增殖的情況，結果表明，過表達miR-141-3p可以促進細胞的增殖，但是同時過表達UNC5C會下調過表達miR-141-3p對細胞增殖的促進效果(見圖5C)。利用細胞劃痕實驗分析各組細胞的遷移能力，發(fā)現(xiàn)過表達miR-141-3p可以促進細胞的遷移能力，但同時過表達UNC5C會使過表達miR-141-3p對細胞遷移能力的促進效果減弱(見圖5D)。同樣，利用Transwell實驗分析各組細胞的侵襲能力，結果顯示過表達miR-141-3p可以增強細胞的侵襲能力，但同時過表達UNC5C后細胞侵襲能力與對照無顯著差異(見圖4E)。通過以上分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-141-3p可能通過靶向UNC5C促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

圖4 結腸癌細胞中miR-141-3p靶向結合UNC5C

注：A：生信分析miR-141-5p和UNC5C的靶向結合位點；B：雙熒光素酶實驗來檢測miR-141-5p和UNC5C兩者的靶向關系；C：qRT-PCR檢測結腸癌細胞中轉染miR-141-3pmimics或NCmimics后UNC5C的mRNA表達水平；D：WB檢測結腸癌細胞轉染miR-141-3pmimics或NCmimics后UNC5C的蛋白表達水平；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3 討論

先前的研究已證明，miR-141-3p在多種癌癥類型中均具有致癌活性，例如卵巢癌[12]和三陰性乳腺癌[13]。臨床證據(jù)表明，在結腸癌中，miR-141-3p過表達與不良預后之間存在顯著關聯(lián)[14]。在神經(jīng)膠質瘤中，發(fā)現(xiàn)miR-141-3p抑制細胞增殖并促進細胞凋亡[15]。Li，等[16]發(fā)現(xiàn)宮頸癌中miR-141-3p的表達明顯高于正常宮頸組織，miR-141-3p的表達水平與腫瘤大小以及淋巴結轉移狀態(tài)有關，并且miR-141-3p的過表達顯著促進宮頸癌細胞的增殖、集落形成、侵襲以及上皮向間質的轉化。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在結腸癌細胞中miR-141-3p顯著高表達，并且下調miR-141-3p會抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。該研究表明在結腸癌中miR-141-3p有致癌因子的作用，與之前的研究一致。

通過生信分析發(fā)現(xiàn)UNC5C可能是miR-141-3p的靶基因，并且通過分子實驗對UNC5C進行表達分析發(fā)現(xiàn)UNC5C在結腸癌細胞中顯著下調。近年來神經(jīng)生長因子Netrin-1受體UNC5C作為大腸癌中可能的抑癌基因被廣泛研究[17]。Thiebault，等[18]人研究了人類UNC5A、UNC5B或UNC5C在包括子宮癌、結直腸癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、肺癌或腎癌在內的多種癌癥中的表達情況，研究表明其在癌癥中表達下調。此外，專門針對UNC5C的最新研究表明，UNC5C在大腸癌和胃癌中顯著低表達[19-20]。這與我們的研究結果相一致。此外，雙熒光素酶實驗表明miR-141-3p對UNC5C具有靶向調控作用。功能分析實驗進一步證明miR-141-3p可以通過負調控UNC5C促進腎透明細胞癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本實驗證明了在結腸癌中miR-141-3p對UNC5C有靶向調控作用，并且影響結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學功能。這一結果使人們更為深入地了解了miR-141-3p在結腸癌中所起的作用，為結腸癌的靶向治療提供了新的途徑。

注：A：qRT-PCR檢測各組細胞的UNC5CmRNA表達水平；B：WB檢測各細胞組的UNC5C蛋白水平；C：MTT實驗檢測各組細胞增殖的情況；D：細胞劃痕實驗分析各組細胞的遷移能力；E：Transwell實驗分析各組細胞的侵襲能力；*表示P<0.05，**表示P<0.01。