范瑞良，李楠楠，王桃妮，2，孫兆躍，2，修玉娜，2，全為民

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

牡蠣是一類具有群聚性的雙殼類軟體動物［1］，廣泛分布于溫帶河口和濱海區(qū)，如長牡蠣（Crassostrea gigas）分布于中國北方沿岸，熊本牡蠣（C.sikamea）主要在江蘇以南沿海［2］，能大量聚集生長形成牡蠣礁（oyster reef）。牡蠣礁具有凈化水體［3］、維持生物多樣性［4］、提供魚類棲息地［5-8］、能量耦合［9］、防止海岸線侵蝕［10］和碳匯［11］等生態(tài)功能。由于過度捕撈、環(huán)境污染和病害浸染等，過去100多年來全球牡蠣礁分布面積約下降85%［12-13］。此后，為恢復(fù)牡蠣礁生境及其提供的生態(tài)服務(wù)價值，美國、澳大利亞和中國等地陸續(xù)成功開展了許多牡蠣礁恢復(fù)項目［6，8，10，14-15］。牡蠣的生長需要硬質(zhì)的附著基，因此建造適合于牡蠣幼蟲附著的棲息生境（礁體）是牡蠣礁恢復(fù)的重點。國內(nèi)外牡蠣礁恢復(fù)項目中最常用的底物材料是牡蠣殼，但由于其數(shù)量不足，篩選適合于牡蠣幼蟲附著生長的替代底物成為牡蠣礁恢復(fù)中迫切需要解決的關(guān)鍵技術(shù)之一［10］。

附著底物的物理和化學(xué)性質(zhì)顯著影響海洋無脊椎動物幼蟲的附著和生長發(fā)育［16-17］，其中底物大小的影響頗受關(guān)注。如FUCHS等［18］的野外實驗發(fā)現(xiàn)：美洲牡蠣（C.virginica）幼蟲更喜歡附著于長度較短的底物上。JEFERY［19］于野外實驗中發(fā)現(xiàn)：藤壺（Balanus）幼蟲單位附著量隨著底物變大依次減少（直徑：6 cm＜3 cm＜1.5 cm）。LILLIS等［20］發(fā)現(xiàn)：鵝卵石大小對美洲龍蝦（Homarus americanus）幼蟲的附著無顯著影響。實踐表明，底物大小對海洋無脊椎動物幼蟲附著的影響不一。然而，有關(guān)底物大小對牡蠣幼蟲附著的影響鮮有報道。

熊本牡蠣雖然在我國有自然分布，但目前還沒有規(guī)模化人工養(yǎng)殖［21］。因此，室內(nèi)實驗動物為長牡蠣，室外實驗動物是熊本牡蠣。基于以往的研究結(jié)果和野外觀察，本研究提出如下假設(shè)：在低牡蠣幼蟲補充下，牡蠣幼蟲附著密度與其底物大小呈現(xiàn)正相關(guān)，即隨著底物變大，稚貝附著密度逐步增加。據(jù)此，本研究通過設(shè)計室內(nèi)實驗和野外實驗比較3種規(guī)格實驗底物（A：5 cm長×5 cm寬×3 cm厚、B：10 cm長 ×10 cm寬 ×3 cm厚、C：15 cm長×15 cm寬×3 cm厚，以下分別簡稱A、B、C）上牡蠣稚貝附著量，以期確認(rèn)室內(nèi)和野外自然條件下底物大小、兩種實驗環(huán)境及他們之間的交互作用對牡蠣幼蟲的誘導(dǎo)效果。研究結(jié)果將對牡蠣礁修復(fù)中替代底物大小的篩選和牡蠣養(yǎng)殖均具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

室內(nèi)實驗于2016年5月7日至2016年6月23日在山東省萊州市國燕水產(chǎn)育苗場（山東萊州虎頭崖鎮(zhèn)西原村）內(nèi)完成。實驗生物為長牡蠣的幼蟲，自受精卵開始培育20 d左右至具足面盤幼蟲（pediveliger）階段時，將實驗底物置于附苗池中開展附著實驗。

野外實驗于2018年7月19日至2018年8月19日在浙江省寧波市奉化區(qū)莼湖象山港牡蠣養(yǎng)殖區(qū)內(nèi)完成，實驗生物為處于具足面盤階段的熊本牡蠣幼蟲。在幼蟲附著高峰期（每年7月20日左右）將底物吊掛于潮間帶筏架上開展野外附著實驗。

1.2 實驗設(shè)計

室內(nèi)和野外實驗均采用單因子隨機區(qū)組設(shè)計，實驗均設(shè)定3個底物大小處理組，各個底物大小處理組之間互為對照。每個底物大小處理組設(shè)置10個重復(fù)，室內(nèi)和野外實驗分別總計3個處理組合和30個實驗底物。

實驗底物為河沙和水泥按比例混合制作的混凝土模塊（表1）。每種原料經(jīng)粉碎后過80目網(wǎng)篩備用。

1.3 實驗方法

室內(nèi)實驗：在育苗車間準(zhǔn)備一個低幼蟲豐度（1～2個·mL-1）附苗池，其上架設(shè)6根竹竿，隨機選取10個實驗底物吊掛于竹桿上，使實驗底物位于水面下50 cm處，相鄰實驗底物相距15 cm，相鄰竹桿間相距20 cm。實驗期間，將沙濾后加熱與未加熱海水混合，保持實驗池中的水溫維持在24℃左右（范圍為23.2～24.6℃）、海水鹽度范圍為26.5～27.2，每天于 1∶00、5∶00、9∶00、13∶00、17∶00、21∶00各投餌 1次，投餌量由育苗場管理人員根據(jù)幼蟲生長狀況而定，餌料為金藻，每天于7∶00和19∶00各換水1次，換水量為附苗池總?cè)萘康?／2，每天光照時間約為8 h，光照強度為100 lx左右，幼蟲附著期間充氣培養(yǎng)等條件均與育苗車間保持一致。

3 d后，將兩個附苗池中的實驗底物移置養(yǎng)殖池暫養(yǎng)，直至附著稚貝清晰可見為止（約1個月），用單反相機對每個實驗底物表面進(jìn)行拍照，在電腦上計數(shù)，隨機選取20個附著稚貝，用Photoshop7.0測量殼高。自牡蠣受精卵至實驗結(jié)束共持續(xù)48 d左右，實驗期間，每天不定期觀察幼蟲生長狀況。

野外實驗：在熊本牡蠣幼蟲處于具足面盤幼蟲時，于2018年7月19日將底物吊掛在搭建的竹竿筏架上，底物位于筏架下50 cm處，其隨漲落潮的露干、淹沒和餌料等情況與野生牡蠣一致，期間不定期觀察附著情況，待附著稚貝清晰可見為止（約1個月）。在此期間，實驗海域白天海水溫度范圍為29.9～30.2℃，鹽度范圍為為23.7～25.7。

表1 實驗基質(zhì)組成成分及大小Tab.1 Chem ical com position and sizes of the experimental substrates

考慮到實驗結(jié)果的一致性，僅統(tǒng)計實驗底物正面附著稚貝的密度和殼高來顯示牡蠣幼蟲的附著效果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將每塊實驗底物上附著的稚貝數(shù)量換算成稚貝的密度，統(tǒng)計每種實驗底物上附著牡蠣稚貝的平均密度（個·cm-2）和平均殼高（mm）。實驗數(shù)據(jù)經(jīng)過以10為底的對數(shù)函數(shù)處理后，用SPSS 19.0中的 Kolmogorov-Smirnov（以下簡稱 K-S）正態(tài)檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗（P＞0.05，表2），符合正態(tài)分布。處理后數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，使用LSD法進(jìn)行后檢驗，P＜0.05時差異顯著，P＜0.01時差異極其顯著；室內(nèi)和野外實驗中分別從3個處理組中隨機選取10個密度值及與其對應(yīng)的殼高，總計30組數(shù)據(jù)，使用Excel 2013繪制密度與殼高的相關(guān)性分析圖，并采用SPSS 19.0中的Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析；采用Sigmaplot10.0軟件繪制折線圖。

表2 K-S正態(tài)檢驗結(jié)果Tab.2 K-S results of normal test

2 結(jié)果與分析

2.1 底物大小對附著稚貝密度的影響

單因子方差分析結(jié)果表明：無論室內(nèi)實驗還是野外實驗，底物大小對附著稚貝密度的影響均極其顯著（表3，P＝0.000）。

底物大小對附著稚貝密度的影響結(jié)果如圖1所示。室內(nèi)和野外實驗中，A、B、C 3個處理組間差異極其顯著（圖1，P＜0.01），3個處理組實驗底物上的附著稚貝密度高低順序為：C＞B＞A。室內(nèi)實驗附著稚貝的平均密度分別為A組1.06個·cm-2，B組 5.60個·cm-2，C組 12.01個·cm-2；野外實驗附著稚貝的平均密度分別為2.41個·cm-2，B組 4.65個·cm-2，C組 6.90個·cm-2。

圖1 室內(nèi)實驗和野外實驗中3種實驗底物上牡蠣稚貝密度的比較Fig.1 Com parison of oyster spat density on three substrates in laboratory and field experiments（n＝10）

2.2 底物大小對附著稚貝殼高的影響

單因子方差分析結(jié)果表明：無論室內(nèi)還是野外實驗，實驗底物大小對附著稚貝殼高的影響都極其顯著（表4，P＝0.000）；

表3 底物大小對附著稚貝密度影響的單因素方差分析結(jié)果Tab.3 One-way ANOVA results of the effect of substrate sizes on settled oyster spat density

底物大小對附著稚貝殼高的影響結(jié)果如圖2所示，室內(nèi)和野外實驗中，3個實驗底物處理組間差異極其顯著（圖2，P＜0.01），附著稚貝殼高大小順序為：A＞B＞C。室內(nèi)實驗附著稚貝的平均殼高分別為A組14.10 mm，B組8.69 mm，C組4.44 mm；野外實驗附著稚貝的殼高分別為A組17.83 mm，B組 11.61 mm，C組7.43 mm。

2.3 室內(nèi)和野外實驗附著結(jié)果的比較

雙因子方差分析結(jié)果表明（表5，表6）：2因子交互作用對附著稚貝密度影響顯著（P＜0.05），對殼高影響不顯著（P＞0.05）；室內(nèi)和野外的實驗環(huán)境對附著稚貝密度影響不顯著（P＞0.05），對殼高影響顯著（P＜0.05），且野外實驗殼高顯著大于室內(nèi)實驗的（P＝0.000）。

2.4 牡蠣稚貝密度與殼高之間的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：室內(nèi)實驗和野外實驗中牡蠣稚貝密度與殼高相關(guān)性很強，且為負(fù)相關(guān)。其中，室內(nèi)實驗為極強相關(guān)性（表7，r＝-0.840）；野外實驗為強相關(guān)性 （表 7，r＝-0.726）。

圖2 室內(nèi)實驗和野外實驗3種實驗底物上牡蠣稚貝殼高的比較Fig.2 Com parison of settled oyster spat shell height on three substrates in laboratory and field experiments

表4 底物大小對附著稚貝殼高影響的單因素方差分析結(jié)果Tab.4 One-way ANOVA results of the effect of substrate sizes on the shell height of settled oyster spat

表5 室內(nèi)和野外實驗稚貝附著密度的雙因子方差分析結(jié)果Tab.5 Two-way ANOVA results of settled oyster spat density in laboratory and field experim ents

表6 室內(nèi)和野外實驗稚貝附著殼高的雙因子方差分析結(jié)果Tab.6 Two-way ANOVA results of settled shell height of oyster spat in laboratory and field experiments

圖3 室內(nèi)（a）和野外（b）實驗中牡蠣稚貝密度與殼高的相關(guān)性分析圖Fig.3 Analysis of the correlation between shell height and density of oyster spat in laboratory（a）and field experiments（b）

表7 室內(nèi)實驗和野外實驗中密度與殼高的Pearson相關(guān)性分析Tab.7 Pearson correlation analysis of density and shell height in laboratory and field experiments

3 討論

3.1 底物大小對附著稚貝密度的影響

本研究結(jié)果表明，底物大小顯著影響牡蠣稚貝附著密度，即底物越大，稚貝附著密度越高。主要機制是底物越大，幼蟲接觸機會越大，一旦有幼蟲附著，就會釋放化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)其他的幼蟲同伴來此聚集附著［23-24］。如王國棟等［24］發(fā)現(xiàn)具有更多附著面積的多層結(jié)構(gòu)附著底物對菲律賓蛤仔 （Ruditapes philippinarum）、青蛤 （Cyclina sinensis）和硬殼蛤（Mercenaria mercenaria）的附苗效果顯著高于細(xì)砂的結(jié)果解釋了這種可能。LILLIS等［19］研究發(fā)現(xiàn)鵝卵石大小對美洲龍蝦幼蟲附著的影響不顯著。ADAMIAK-BURD等［25］發(fā)現(xiàn)水蛭幼蟲更易附著于尺寸較小的底物上。這可能是由于物種間的差異。歐微龍等［26］的研究表明2種規(guī)格的底物大小對葉片山海綿的附著量差異不顯著，其可能是2種底物的有效附著面積均能夠滿足葉片山海綿的生長，為本研究的設(shè)計思路提供了方向，并為本實驗結(jié)果提供了解釋的空間。FUCHS等［17］野外研究發(fā)現(xiàn)在長度較短的底物上美洲牡蠣稚貝附著量較多，與本實驗研究結(jié)果不同?？赡苁怯捎趯嶒灪^(qū)的幼蟲豐度遠(yuǎn)少于室內(nèi)養(yǎng)殖的。大多數(shù)牡蠣幼蟲會附著在鄰近的優(yōu)勢底物上，大底物雖然增加了幼蟲接觸的可能性，但降低了底物上的單位稚貝附著量。室內(nèi)實驗A處理組的附著稚貝密度低于野外實驗可能是由于室內(nèi)實驗暫養(yǎng)時海水中沒有幼蟲，而野外實驗中一直有幼蟲再次附著到底物上。本研究的結(jié)果是基于低幼蟲密度的環(huán)境，如果幼蟲密度高時，這種底物大小對幼蟲附著的誘導(dǎo)效應(yīng)會顯著降低。

3.2 附著稚貝殼高和密度的相關(guān)性

附著稚貝殼高與密度呈負(fù)相關(guān)。很多研究與本實驗結(jié)果類似，如杜美榮［27］研究發(fā)現(xiàn)底棲硅藻處理組附著底物上櫛孔扇貝（Chlamys farreri）稚貝附著量明顯多于常規(guī)方法處理組，稚貝殼高結(jié)果卻與附著量相反。陳璐等［28］研究發(fā)現(xiàn)密鱗牡蠣（Ostrea enselamellosa）幼蟲高豐度 （3個·mL-1和4個·mL-1）處理組底物上稚貝的附著效果優(yōu)于低豐度處理組（1個·mL-1和2個·mL-1），生長速度卻明顯慢于低豐度處理組。因為隨著稚貝附著密度的增大，食物、空間競爭壓力增大，導(dǎo)致個體生長發(fā)育緩慢。野外實驗中附著稚貝密度低于其在室內(nèi)實驗的密度、殼高卻高于室內(nèi)實驗也可能是這個原因?qū)е碌?。后期幼蟲附著密度等外界條件可能會造成殼高的差異，所以，底物大小與后期殼高之間直接相關(guān)性不大。密度是牡蠣稚貝生長的關(guān)鍵因素之一，貝殼生長還與鹽度、溫度等環(huán)境條件密切相關(guān)，如王濤等［29］的鹽度實驗結(jié)果顯示，鹽度15、20和25組中熊本牡蠣稚貝殼高顯著高于鹽度35和40組；溫度實驗結(jié)果顯示，稚貝殼高在溫度28℃組顯著高于溫度16℃、20℃、24℃和32℃組。饒科等［30］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) pH為 8.1～7.0時，近江牡蠣（C.ariakensis）的鈣化率隨著pH的下降而顯著下降。

3.3 室內(nèi)和野外實驗結(jié)果的比較

通過室內(nèi)和野外實驗的對比，我們發(fā)現(xiàn)實驗環(huán)境對附著稚貝密度影響不顯著，而其與底物大小的交互作用對密度影響顯著，可能是由于牡蠣幼蟲對附著底物的選擇性優(yōu)于環(huán)境條件的差異。實驗環(huán)境對附著稚貝殼高影響顯著，這個可能有兩種原因，一種是幼蟲豐度的不同，導(dǎo)致附著密度的不同，從而影響稚貝殼高［28］；另一種是野外實驗的環(huán)境更適宜牡蠣的生長。兩種因子的交互作用對殼高影響不顯著，可能是環(huán)境條件差異對殼高的影響大于底物大?。ɑ蛑韶惷芏龋ζ涞挠绊?。

3.4 小結(jié)

本研究表明，在低幼蟲密度下，底物大小與牡蠣稚貝附著密度呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。因此，在牡蠣礁生態(tài)修復(fù)中，底物大小是必須特別考慮的因子之一，選擇適合規(guī)格的底物可顯著提高礁體上牡蠣幼蟲附著量，從而影響牡蠣礁生態(tài)修復(fù)的效果。

本實驗僅證明底物大小對牡蠣幼蟲附著影響顯著，并未驗證幼蟲附著的最適底物規(guī)格，仍需下一步進(jìn)行研究。

致謝：感謝育苗場工作人員在實驗期間提供的幫助，楊杰青等在論文寫作中給予的指導(dǎo)。