王 斌， 袁 旭， 韓 楓， 唐 寧

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430030；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院，湖北 武漢 430030）

目前，新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的治療方法除支持療法外，能有效抑制疾病進(jìn)展的特效藥和疫苗還在研發(fā)中。武漢市是本次疫情防控的重點(diǎn)城市，從既有經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，及時(shí)、有效地救治重癥患者是降低死亡率的關(guān)鍵[1]。完整的凝血指標(biāo)數(shù)據(jù)目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道尚不多見(jiàn)[2-3]。本研究通過(guò)分析COVID-19患者的凝血指標(biāo)、血液學(xué)指標(biāo)和生化指標(biāo)等實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，探討這些指標(biāo)與COVID-19近期危重事件發(fā)生的關(guān)系，旨在為COVID-19重癥患者的早防早治提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年1月13日—2月15日華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院的73例COVID-19患者，臨床結(jié)局（出院時(shí)間、病死率、住院時(shí)間）觀察至2020年3月6日。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）核酸檢測(cè)陽(yáng)性；（2）符合國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》（試行第七版）標(biāo)準(zhǔn)[4]。本研究通過(guò)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)收集 通過(guò)電子病歷系統(tǒng)收集患者性別、年齡、冠心病史、高血壓史、糖尿病史和結(jié)核病史等臨床資料，分別記錄入院當(dāng)日（第1階段）、＞1～≤4 d（第2階段）和＞4～≤8 d（第3階段）3個(gè)階段14項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)指標(biāo)[凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、D-二聚體（D-dimer，DD）、抗凝血酶活性（antithrombin activity，AT）、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞（lymphocyte，Ly）計(jì)數(shù)、血小板（platelet，PLT）計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（creatinine，Cr）]及轉(zhuǎn)歸資料（觀察至2020年3月6日）。將患者分為非危重組（未使用高流量鼻導(dǎo)管氧療、無(wú)創(chuàng)和有創(chuàng)輔助呼吸）和危重組（使用上述任一輔助呼吸），將使用高流量鼻導(dǎo)管氧療、無(wú)創(chuàng)或有創(chuàng)輔助呼吸設(shè)備治療事件定義為危重事件。

1.2.2 樣本采集及檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象靜脈血，分裝到0.109 mmol/L（3.2%）枸櫞酸鈉抗凝管、乙二胺四乙酸二鉀抗凝管和肝素鋰抗凝管，采集后輕輕顛倒混勻，避免溶血，1 912×g離心10 min上機(jī)檢測(cè)。

采用凝固法檢測(cè)PT、APTT、Fg和TT，采用比濁法檢測(cè)DD，采用發(fā)色底物法檢測(cè)AT，檢測(cè)儀器為STA-R MAX型凝血分析儀及配套試劑（法國(guó)Stago公司）。采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)WBC、Ly和PLT，檢測(cè)儀器為XN-9000全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑[希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司]。采用免疫透射比濁法檢測(cè)CRP，采用速率法檢測(cè)ALT和AST，采用比色法檢測(cè)BUN和Cr，檢測(cè)儀器為cobas 8000全自動(dòng)生化分析儀和配套試劑（瑞士羅氏公司）。所有檢測(cè)項(xiàng)目均嚴(yán)格按照儀器和試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，且質(zhì)控均在控。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用SK檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。危重事件發(fā)生的相關(guān)因素分析采用二元Logistic回歸分析。相關(guān)因素的診斷價(jià)值采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線(xiàn)進(jìn)行評(píng)估。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COVID-19患者基線(xiàn)臨床資料和轉(zhuǎn)歸情況

73例COVID-19患者中位年齡為65歲，其中男性37例（50.68%）。非危重組49例（67.12%）、危重組24例（32.88%）。2個(gè)組之間冠心病、高血壓、結(jié)核病史差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；危重組男、女比例高于非危重組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；危重組年齡、糖尿病史例數(shù)和死亡率均高于非危重組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 2組患者基線(xiàn)臨床資料和轉(zhuǎn)歸情況比較

2.2 2組患者住院期間實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比較

危重組PT、DD、WBC計(jì)數(shù)、CRP、AST和BUN水平在3個(gè)階段均高于非危重組（P＜0.05）；危重組與非危重組APTT、Fg、TT、AT、Ly計(jì)數(shù)、PLT計(jì)數(shù)和Cr在不同階段的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ALT水平3個(gè)階段2個(gè)組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2～表4。

2.3 近期危重事件多變量Logistic回歸分析

危重組24例患者中，第1階段18例；第1階段～第2階段新增6例，死亡2例；第2階段～第3階段無(wú)新增病例，死亡1例；入院8 d后至觀察日結(jié)束死亡6例（其中2例為第1階段的非危重組患者）。將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的項(xiàng)目納入危重事件的多變量Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：DD和PLT計(jì)數(shù)是近期發(fā)生危重事件的獨(dú)立影響因素，其中DD是獨(dú)立危險(xiǎn)因素，PLT計(jì)數(shù)是獨(dú)立保護(hù)因素。見(jiàn)表5。

表2 2組患者第1階段的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比較 M（P25～P75）

表3 2組患者第2階段的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比較 M（P25～P75）

表4 2組患者第3階段的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比較

表5 近期危重事件多變量Logistic回歸分析

2.4 DD、PLT計(jì)數(shù)、DD+PLT計(jì)數(shù)對(duì)近期危重事件發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值

DD、PLT計(jì)數(shù)、DD+PLT計(jì)數(shù)預(yù)測(cè)近期危重事件發(fā)生的ROC曲線(xiàn)下面積（area under curve，AUC）分別為0.820（95%CI為0.739～0.902，P＜0.001）、0.764（95%CI為0.652～0.876，P＜0.001）、0.809（95%CI為0.704～0.915，P＜0.001），三者兩兩比較，AUC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z值分別為0.797、0.163、-0.576，P＞0.05）。見(jiàn)表6、圖1。

表6 DD、PLT計(jì)數(shù)、DD+PLT計(jì)數(shù)近期危重事件發(fā)生的ROC曲線(xiàn)分析

圖1 DD、PLT計(jì)數(shù)、DD+PLT計(jì)數(shù)預(yù)測(cè)危重事件的ROC曲線(xiàn)

3 討論

截至2020年3月6日，本研究納入的73例患者，中位年齡為65（26～95）歲，有基礎(chǔ)疾病的33例（45.2%），出院26例（35.6%），死亡9例（12.3%），38例（52.1%）仍在院治療。

有文獻(xiàn)報(bào)道，COVID-19多見(jiàn)于高齡、男性、有基礎(chǔ)疾病的患者[5]。本研究73例患者中男性37例（50.7%），危重組中16例（66.7%），危重組與非危重組男性比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.056），與WANG等[2]和方丹等[6]的報(bào)道一致?？赡芘c前期報(bào)道中納入的患者多為華南海鮮市場(chǎng)工作的男性患者有關(guān)。在年齡和糖尿病史方面，危重組與非危重組雖然差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.006、0.017），但多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，這2項(xiàng)不是危重事件近期發(fā)生的獨(dú)立影響因素（P=0.292）。此結(jié)果還有待更大樣本量的研究結(jié)果加以證實(shí)。

有文獻(xiàn)報(bào)道，COVID-19患者從發(fā)病至出現(xiàn)氣促、急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和需要機(jī)械輔助通氣治療的中位時(shí)間分別為8、9和10.5 d[3]，為了解患者入院后的病情變化，本研究分3個(gè)階段記錄相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)指標(biāo)結(jié)果，24例危重患者中，第1階段18例（75.0%）；第2階段新增6例，累計(jì)24例，占100%；第3階段無(wú)新增病例，在觀察日內(nèi)危重組死亡率[9例（37.5%）]明顯高于非危重組[0例（0.0%）]（P＜0.001），提示SARS-CoV-2感染后短時(shí)間內(nèi)病情發(fā)展迅速。引起ARDS和多臟器衰竭的重要原因是細(xì)胞因子風(fēng)暴[7]，其與疾病嚴(yán)重程度可能相關(guān)[3，8]，但細(xì)胞因子檢測(cè)需要特殊儀器設(shè)備、操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢驗(yàn)人員需要具備相關(guān)的專(zhuān)業(yè)知識(shí)，故實(shí)驗(yàn)室無(wú)法常規(guī)開(kāi)展。

本研究14項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)篩查指標(biāo)中，除ALT外，其他指標(biāo)危重組與非危重組在病程的不同階段（8 d內(nèi)）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示COVID-19危重患者會(huì)出現(xiàn)多臟器損傷和多系統(tǒng)功能紊亂。

本研究大多數(shù)患者Ly計(jì)數(shù)降低，尤其危重組患者的Ly計(jì)數(shù)中位數(shù)均低于參考區(qū)間下限，提示SARS-CoV-2可能作用于Ly。LIU等[9]報(bào)道，Ly計(jì)數(shù)顯著降低表明嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）消耗了大量免疫細(xì)胞，抑制了機(jī)體細(xì)胞免疫功能，T淋巴細(xì)胞受損可能是患者病情加重的重要因素。但多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，Ly計(jì)數(shù)不是此次危重事件近期發(fā)生的獨(dú)立影響因素（P=0.403）。

DD來(lái)源于纖溶酶溶解的交聯(lián)纖維蛋白凝塊，是最簡(jiǎn)單的纖維蛋白降解產(chǎn)物，其水平升高說(shuō)明體內(nèi)存在高凝狀態(tài)和繼發(fā)性的纖維蛋白溶解亢進(jìn)，是COVID-19近期危重事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨界值為3.99 μg/mL。本研究中多數(shù)COVID-19患者DD水平升高，危重組比非危重組升高更為明顯（P＜0.05），提示COVID-19危重患者有較高的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)[10]。GRALINSKI等[11]在SARS-CoV誘導(dǎo)的急性肺損傷機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，利用SARS-CoV作為模型病原體感染尿激酶通路中纖溶酶原激活物抑制劑1基因缺失小鼠，該小鼠的肺部感染速度更快，有更廣泛的出血，表明SARS-CoV感染后尿激酶通路的調(diào)節(jié)異常會(huì)導(dǎo)致纖溶酶生成過(guò)度，降解產(chǎn)物水平升高，最終表現(xiàn)為更為嚴(yán)重的肺部病理?yè)p傷，而纖溶酶原激活物抑制劑1則起到保護(hù)作用。BERRI等[12]報(bào)道，甲型流感病毒感染期間，纖溶酶原通過(guò)促纖溶作用引起降解產(chǎn)物水平升高，導(dǎo)致患者肺部炎癥。由此推測(cè)SARSCoV-2感染人體后也可能誘發(fā)纖溶。因此，建議動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)COVID-19患者的DD水平，結(jié)合其他出凝血指標(biāo)綜合判斷患者凝血功能狀態(tài)。

本研究結(jié)果表明，危重組PLT計(jì)數(shù)隨著病程進(jìn)展逐漸升高，到監(jiān)測(cè)的第3個(gè)階段，與非危重組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示COVID-19患者從發(fā)病到出現(xiàn)危重癥狀的時(shí)間較短。有研究結(jié)果顯示小鼠肺也是PLT生成的場(chǎng)所[13]，COVID-19患者肺部損傷明顯[14]。有研究結(jié)果表明，由于嚴(yán)重急性呼吸綜合征患者肺泡有廣泛損傷，肺部有效毛細(xì)血管床減少，導(dǎo)致PLT生成減少，同時(shí)因炎癥損傷促進(jìn)了肺部PLT聚集和血栓形成，可引發(fā)PLT消耗性減少及破壞增加[15]。

綜上所述，與實(shí)驗(yàn)室其他常規(guī)指標(biāo)相比，DD和PLT計(jì)數(shù)與COVID-19患者近期危重事件發(fā)生的相關(guān)性更高，因此臨床應(yīng)高度重視COVID-19患者DD和PLT計(jì)數(shù)的變化，隨時(shí)關(guān)注患者病情發(fā)展，做到早防、早治。

本研究尚有不足之處，作為單中心的回顧性研究，存在觀察例數(shù)較少的問(wèn)題，并且截至投稿時(shí)，還有部分患者仍在院治療。因此，需加大樣本量，并延長(zhǎng)監(jiān)測(cè)時(shí)間，以獲得更加全面的數(shù)據(jù)支持。