閆佩毅， 張 驥， 涂煥平， 張 立， 仇 越， 張鋒英， 胡奕雯， 金 姝

（1.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200060；2.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院病理科，上海 200060；3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200060；4.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200060）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以不完全可逆的氣流受限為特征的疾病，是一種常見、多發(fā)、高致死率的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。中性粒細(xì)胞的聚集活化是COPD發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一，中性粒細(xì)胞及其組分均參與了COPD的發(fā)生、發(fā)展過程[1-2]。為了進(jìn)一步闡明COPD可能的發(fā)病機(jī)制，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)COPD患者外周血及痰液的中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能，同時(shí)檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面的趨化因子C-C基序受體-1（chemokine C-C receptor-1，CCR1）和Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2 、TLR4的表達(dá)，以期了解COPD患者中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能的改變，探討COPD發(fā)病的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月—2019年12月上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院確診并住院治療的COPD急性發(fā)作期患者30例（COPD組），其中男16例、女14例，年齡35～82歲，依據(jù)慢性阻塞性肺疾病全球倡議（the Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）指南2017版[3]的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。選取同期上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院確診并住院治療的肺炎患者30例（肺炎組）作為疾病對(duì)照，其中男12例、女18例，年齡32～88歲。選取同期上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院體檢健康者30名（正常對(duì)照組），其中男14名、女16名，年齡27～79歲。體檢健康者外周血白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)為（5.9～9.9）×109/L，中性粒細(xì)胞百分比為55.0%～68.7%，肝功能指標(biāo)、腎功能指標(biāo)及心血管系統(tǒng)指標(biāo)均無異常。COPD組、肺炎組及正常對(duì)照組之間性別、年齡等臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 試劑和儀器

Alexa Fluor 488 標(biāo)記鼠抗人CD282（TLR2）抗體（貨號(hào)558318，克隆號(hào)11G7）、Alexa Fluor 488標(biāo)記小鼠IgG1同型對(duì)照（貨號(hào)557702，克隆號(hào)MOPC-21）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記鼠抗人CD284（TLR4）（貨號(hào)564215，克隆號(hào)TF901）、PE標(biāo)記小鼠IgG1同型對(duì)照（貨號(hào)554680）、Alexa Fluor 647標(biāo)記鼠抗人CD191（CCR1）抗體（貨號(hào)557914，克隆號(hào)53504）、Alexa Fluor 647標(biāo)記小鼠IgG2b同型對(duì)照（貨號(hào)557903，克隆號(hào)27-35）、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP）標(biāo)記鼠抗人CD45抗體（貨號(hào)347464，克隆號(hào)2D1）、PerCP標(biāo)記小鼠IgG1同型對(duì)照（貨號(hào)550672，克隆號(hào)MOPC-31C）、Lysing Solution溶血?jiǎng)┖虵ASC Flow緩沖液均購(gòu)自美國(guó)BD公司。無熒光的染料二氫若丹明123（dihydrorhodamine123，DHR123；工作溶液濃度為30 μg/mL）、佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；工作溶液濃度為10 μg/mL）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），80-2型臺(tái)式離心機(jī)（上海和欣科教設(shè)備有限公司），LA-920-3垂直層流潔凈工作臺(tái)（上海上凈設(shè)備有限公司），QL-901型旋渦混合器（江蘇海門醫(yī)療儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集所有對(duì)象靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝，24 h內(nèi)完成外周血中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能及相關(guān)受體（TLR2、TLR4和CCR1）的檢測(cè)。肺炎患者和COPD患者早晨用生理鹽水漱口后，留取晨起第一口深部痰。用鑷子取痰栓，在顯微鏡下觀察鱗狀上皮細(xì)胞＜10個(gè)/高倍鏡視野、WBC＞25個(gè)/高倍鏡視野為合格痰標(biāo)本。取空試管，稱重后，選取100～500 mg不含唾液的痰標(biāo)本，放入已稱重的試管中，向痰液中加入4倍體積的0.1%DTT溶液，用一次性吸管抽吸幾次后置于37 ℃水浴箱內(nèi)15 min，48 μm尼龍網(wǎng)過濾，濾液以150×g離心5 min，棄上清，沉淀用磷酸緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）重懸后150×g離心，棄上清，沉淀再次用PBS重懸，在顯微鏡下調(diào)整細(xì)胞數(shù)至 1×106/mL，作為待測(cè)樣本。

1.3.2 中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能的檢測(cè) 取2支流式專用管，分別標(biāo)記為對(duì)照管和刺激管，對(duì)照管中加入50 μL PBS，刺激管中加入50 μL PMA，每管分別加入全血或重懸的痰液50 μL，混勻后37 ℃溫育15 min。加入DHR123 25 μL，混勻，37 ℃避光溫育5 min。每管加入1 mL溶血素（痰液樣本無需加入溶血素），室溫避光反應(yīng)10 min，150×g離心5 min，棄上清，加300 μL PBS重懸，上機(jī)檢測(cè)。先用對(duì)照管進(jìn)行設(shè)置，用前向散射光（forward scatter，F(xiàn)SC）和側(cè)向散射光（side scatter，SS）進(jìn)行調(diào)整，確保中性粒細(xì)胞可以清晰地顯示出來。設(shè)中性粒細(xì)胞門為R1，以對(duì)照管為陰性管，在直方圖上調(diào)整對(duì)照管的熒光強(qiáng)度在101之內(nèi)，記為M1，收集刺激管中的細(xì)胞，在對(duì)應(yīng)的直方圖上100～101（M1）為陰性細(xì)胞，DHR123熒光信號(hào)101以上的區(qū)域?yàn)殛?yáng)性（M2），見圖1。記錄M2區(qū)域的“%Gated”值，即為中性粒細(xì)胞氧化吞噬陽(yáng)性率，每個(gè)樣本R1門收集10 000個(gè)細(xì)胞。

圖1 中性粒細(xì)胞氧化吞噬能力檢測(cè)示意圖

1.3.3 中性粒細(xì)胞表面受體表達(dá)的檢測(cè) 取2支流式專用管，標(biāo)記為對(duì)照管和測(cè)試管，測(cè)試管依次加入CD282-Alexa Fluor 抗體10 μL、CD284-PE抗體5 μL、CD191-Alexa Fluor抗體5 μL、CD45-PerCP抗體5 μL、50 μL全血或痰液樣本，對(duì)照管依次加入等量相對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體和50 μL全血或痰液樣本，混勻后室溫避光溫育25 min，每管加入500 μL溶血?jiǎng)ㄌ狄簶颖緹o需加入溶血素），混勻后室溫避光靜置10 min，150×g離心5 min，棄上清，加入PBS 1 mL，混勻，150×g離心5 min，棄上清，再加入PBS 300 μL重懸，上機(jī)檢測(cè)。利用SS和CD45-PerCP，以中性粒細(xì)胞群設(shè)門（R1），檢測(cè)中性粒細(xì)胞表面表達(dá)CD282（TLR2）、CD284（TLR4）、CD191（CCR1）的平均熒光強(qiáng)度（mean flourscence indensity，MFI）。數(shù)據(jù)采用Cell Quest軟件進(jìn)行分析，每個(gè)樣本每次檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞。2 h內(nèi)完成檢測(cè)，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估各項(xiàng)目之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中性粒細(xì)胞門R1的確立

在通過CellQuest軟件獲取的散點(diǎn)圖上，根據(jù)CD45-PerCP和SS的參數(shù)設(shè)定中性粒細(xì)胞門R1。見圖2。

圖2 不同樣本的流式散點(diǎn)圖

2.2 COPD組、肺炎組和正常對(duì)照組外周血中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能及相關(guān)受體的表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，肺炎組和C O P D組中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能均顯著下降（P＜0.05），肺炎組與COPD組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。COPD組、肺炎組及正常對(duì)照組之間僅CCR-1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而TLR2、 TLR4表達(dá)3組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖3、圖4。

2.3 COPD組和肺炎組痰液中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能及相關(guān)受體表達(dá)陽(yáng)性率

與肺炎組比較，COPD組痰液中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能顯著下降（P＜0.05），CCR1表達(dá)顯著升高（P＜0.05），TLR2和TLR4表達(dá)2個(gè)組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2、圖5、圖6。

2.4 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，COPD組痰液中性粒細(xì)胞氧化吞噬陽(yáng)性率與CCR1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.548，P＜0.01），與TLR2、TLR4表達(dá)均無相關(guān)性（r值分別為-0.206、-0.219，P＞0.05）。

表1 COPD組、肺炎組及正常對(duì)照組外周血中性粒細(xì)胞氧化吞噬百分率及相關(guān)受體陽(yáng)性率比較 %，±s

表1 COPD組、肺炎組及正常對(duì)照組外周血中性粒細(xì)胞氧化吞噬百分率及相關(guān)受體陽(yáng)性率比較 %，±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與肺炎組比較，#P＜0.05

組別 例數(shù) 氧化吞噬百分率 TLR2 TLR4 CCR1正常對(duì)照組 30 98.27± 2.58 59.62±19.32 48.70±27.57 61.77±25.89肺炎組 30 93.05±9.24* 54.33±32.86 40.62±22.93 29.04±28.16*COPD組 30 96.22± 3.28* 45.58±34.31 42.45±28.62 40.97±34.58#

圖3 COPD組、肺炎組及正常對(duì)照組外周血中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能的流式直方圖

圖4 COPD組、肺炎組及正常對(duì)照組外周血中性粒細(xì)胞表面CCR1、TLR2及TLR4表達(dá)的流式直方圖

表2 COPD組和肺炎組痰液中性粒細(xì)胞氧化吞噬百分率及相關(guān)受體的陽(yáng)性率 %，±s

表2 COPD組和肺炎組痰液中性粒細(xì)胞氧化吞噬百分率及相關(guān)受體的陽(yáng)性率 %，±s

注：與肺炎組比較，*P＜0.05

組別 例數(shù) 氧化吞噬百分率 TLR2 TLR4 CCR1肺炎組 30 51.57±36.50 10.26±9.24 20.86±18.39 15.08±15.03 COPD組 30 33.60±31.73* 12.64±12.13 20.30±19.15 44.99±34.11*

圖5 肺炎組和COPD組痰液中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能的流式直方圖

圖6 肺炎組和COPD組痰液中性粒細(xì)胞表面受體的流式直方圖

3 討論

COPD確切的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，一般認(rèn)為COPD以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征，肺部的蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化與抗氧化失衡也在COPD發(fā)病中起重要作用[1]。

有研究結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞的氧化聚集是COPD發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一，中性粒細(xì)胞及其組分均參與了COPD的發(fā)生、發(fā)展[4-6]。趨化因子受體是以趨化因子為配體的跨膜受體家族，中性粒細(xì)胞表面的趨化因子受體，如CCR1是其向病原體感染部位遷移或向炎癥部位游走的關(guān)鍵分子。WANG等[7]的研究結(jié)果顯示，炎癥細(xì)胞上CCR1的表達(dá)與COPD的嚴(yán)重程度有關(guān)。TLR是一類天然的免疫受體，在各種炎癥反應(yīng)細(xì)胞吞噬作用的調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞凋亡中起重要作用。TLR作為病原識(shí)別受體對(duì)中性粒細(xì)胞的功能起著決定性的作用，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[8]。

中性粒細(xì)胞在COPD的發(fā)病過程中起重要作用，但中性粒細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞毒性物質(zhì)在殺傷入侵的病原微生物的同時(shí)可能也會(huì)造成自身組織細(xì)胞的損傷。目前的研究多聚焦于COPD患者中性粒細(xì)胞數(shù)量的增多是否由凋亡減少而引起細(xì)胞壽命延長(zhǎng)導(dǎo)致，但還未找到中性粒細(xì)胞壽命延長(zhǎng)的明確證據(jù)，甚至有一些研究結(jié)論相互矛盾[9-11]。近年來，學(xué)者們逐漸將研究方向轉(zhuǎn)向中性粒細(xì)胞自身功能方面。PRIETO等[12]的研究結(jié)果顯示，COPD患者存在多形核白細(xì)胞吞噬活性的缺陷。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，在假單胞菌感染的鼠模型中，香煙煙霧提取物會(huì)削弱中性粒細(xì)胞的吞噬作用[13-14]。SAPEY等[15]的研究結(jié)果顯示，COPD患者中性粒細(xì)胞自身功能可能有缺陷，其趨化行為和移行結(jié)構(gòu)與其他人群有著本質(zhì)上的差異。為此，本研究對(duì)中性粒細(xì)胞的氧化吞噬功能進(jìn)行了探討。因COPD屬于氣道炎癥，而肺炎為非氣道炎癥，以肺炎作為疾病對(duì)照可更好地證明研究結(jié)論是氣道炎癥所特有的。同時(shí)檢測(cè)COPD患者外周血與痰液中性粒細(xì)胞的氧化吞噬功能能更好地反映整體與局部的關(guān)系。

本研究采用的流式細(xì)胞術(shù)-DHR123方法是一種臨床常用的評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能的方法。DHR123被激活的中性粒細(xì)胞吞噬，中性粒細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用時(shí)產(chǎn)生的呼吸爆發(fā)使DHR123在氧化反應(yīng)中被還原為具有綠色熒光的若丹明123（rhodamine 123，Rho123），從而成為流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)。這種方法的檢測(cè)結(jié)果可同時(shí)反映中性粒細(xì)胞的吞噬和氧化2種功能，任何一種功能缺陷都將影響檢測(cè)結(jié)果[16]。

本研究結(jié)果顯示，肺炎組和COPD組外周血中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05），肺炎組與COPD組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；COPD組痰液中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能顯著低于肺炎組（P＜0.05），而CCR1表達(dá)顯著高于肺炎組（P＜0.05）。COPD患者CCR1表達(dá)升高，可能是COPD患者氣道中中性粒細(xì)胞的蓄積較肺炎患者多，但因聚集的中性粒細(xì)胞的氧化吞噬功能較差，所以COPD患者相對(duì)于肺炎患者更易發(fā)生氣道病理性組織損傷。因此，我們推測(cè)COPD患者呼吸道中的中性粒細(xì)胞由于自身功能缺陷，導(dǎo)致在感染時(shí)的趨化作用過度，精確性下降，盡管中性粒細(xì)胞數(shù)量增多，但清除病原體的能力不足，最終導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在肺部的病理性蓄積，進(jìn)而造成組織損傷。

LIU等[17]的研究結(jié)果顯示，COPD患者的主要趨化因子受體都含有至少1個(gè)酪氨酸硫酸化位點(diǎn)，酪氨酸硫酸化后通過影響信號(hào)傳導(dǎo)來影響參與COPD發(fā)病的相關(guān)細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞。酪氨酸硫酸化位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)有助于特應(yīng)性受體-配體拮抗劑的研發(fā)，對(duì)COPD的治療有積極的意義。CCR1等趨化因子受體在COPD中起重要作用，深入研究有助于開發(fā)用以調(diào)節(jié)氣道疾病重要事件的特異性受體-配體拮抗劑。GLADUE等[18]的研究結(jié)果顯示，COPD等疾病CCR1表達(dá)上調(diào)，提示CCR1及其配體的拮抗劑或許可作為治療這類疾病的手段。

TLR2和TLR4的主要配體分別是革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌和真菌，在細(xì)菌和真菌感染中起核心作用[19-20]。VON SCHEELE等[21]的研究結(jié)果顯示，COPD患者支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞TLR2表達(dá)下調(diào)可能與其吞噬功能下降有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，COPD患者痰液中性粒細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)與肺炎組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。原因可能是TLR2和TLR4的表達(dá)主要與感染的細(xì)菌種類有關(guān)，肺炎和COPD患者感染的細(xì)菌種類相似，故2種受體表達(dá)無明顯差異。

綜上所述，COPD患者中性粒細(xì)胞基礎(chǔ)代謝異常活躍，是COPD病程持續(xù)進(jìn)展的重要原因。COPD患者痰液中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能與其表面CCR1表達(dá)有關(guān)，提示COPD患者氣道中的中性粒細(xì)胞的氧化吞噬功能受損，這可能是COPD發(fā)病的機(jī)制之一。本研究結(jié)論為探索以提高中性粒細(xì)胞氧化吞噬功能為靶標(biāo)的控制COPD炎癥的治療策略提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。