董愛(ài)文， 李維新， 王 歡， 鄒亞珂

(吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000)

紅麩楊(Rhuspunjabensisvar.sinicaRehd.)為漆樹(shù)科鹽膚木屬落葉小喬木[1]，其根、莖、葉、皮、花和果實(shí)均可入藥，且無(wú)需與其它中藥配伍，單獨(dú)使用效果就很好，具有祛風(fēng)化濕、收斂解毒、生津潤(rùn)肺和降火化痰等功效[2]。黃顏木素(3，7，3，4-四羥基雙氫黃酮)是具有多種生物活性與藥用價(jià)值的黃酮類(lèi)物質(zhì)[3]。本課題組前期利用酶輔助提取協(xié)同大孔樹(shù)脂純化的方法，從紅麩楊果實(shí)中提取分離純化得到純度68.15%的黃顏木素[4]。國(guó)內(nèi)已有報(bào)道從鹽膚木干燥心材粉末中獲得的黃顏木素對(duì)人白血病K562細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖抑制活性[5]；此外黃顏木素對(duì)肝癌Hep G2、肺癌A549和食管癌EC109這3種細(xì)胞株具有較強(qiáng)的增殖抑制活性[6]。國(guó)外也早已把黃顏木素作為防癌、防治心血管等疾病藥物的主要藥效成分和安全無(wú)毒新型氧化酶抑制劑而廣泛的應(yīng)用[7-10]。目前國(guó)內(nèi)外研究者主要從豆科植物皂莢的皂角刺及松柏中提取黃顏木素[11]，而紅麩楊果實(shí)中黃顏木素的提取分離只有本課題組報(bào)道了用酶輔助提取協(xié)同大孔樹(shù)脂分離純化[4]。目前黃酮類(lèi)化合物的提取方法主要有水提取、加熱回流提取、堿提酸沉、乙醇提取、微波輔助提取、超聲波輔助提取和超臨界萃取等[12-13]。其中，超臨界CO2萃取技術(shù)具有溶劑安全性高且易回收、產(chǎn)品提取率相對(duì)較高、同時(shí)對(duì)原有物質(zhì)的化學(xué)成分不會(huì)造成損傷等優(yōu)點(diǎn)，是一種環(huán)保型的綠色分離技術(shù)，現(xiàn)已成為獲得高純度活性成分的有效手段之一[14-15]。武陵山區(qū)紅麩楊資源極其豐富，但目前僅僅開(kāi)發(fā)利用其五倍子，果實(shí)還未得到有效開(kāi)發(fā)利用。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究采用 0～10 ℃低溫下超微粉碎紅麩楊果實(shí)后，運(yùn)用超臨界CO2萃取其黃顏木素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化萃取工藝，并測(cè)定了黃顏木素的體外抗氧化活性，以期提高黃顏木素純度與提取率的同時(shí)，盡量減少材料處理與提取分離純化過(guò)程對(duì)黃顏木素生物活性的影響，從而為黃顏木素的開(kāi)發(fā)利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也為紅麩楊果實(shí)的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

紅麩楊果實(shí)采于吉首大學(xué)張家界校區(qū)后山，經(jīng)鑒定為紅麩楊(Rhuspunjabensisvar.sinicaRehd.)的果實(shí)。清洗后置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干，備用。甲醇、無(wú)水乙醇、乙腈，均為國(guó)產(chǎn)分析純。HPLC檢測(cè)用乙腈、磷酸為國(guó)產(chǎn)色譜純。不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇等未加說(shuō)明都是以去離子水與分析純?nèi)軇┗旌隙谩｜S顏木素(98.0%，20725- 03-5)，云南西力生物；VC(99.7%，20170115)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)，美國(guó)Sigma公司；總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒、超氧陰離子測(cè)定試劑盒、羥基自由基測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

XDW- 6J型振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)，濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司；BHS-113明場(chǎng)顯微鏡，日本Olypus公司；HA121-50- 05超臨界CO2萃取儀，江蘇南通儀創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司； UV-3900紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本日立公司；PLC-20AT高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；SF-6脂肪抽出裝置，日本三紳公司。

1.2 原料的預(yù)處理

1.2.1紅麩楊果實(shí)干粉的制備 每次在超微粉碎機(jī)6 L物料器中裝入已干燥的紅麩楊果實(shí)1.2 L，將溫控設(shè)置為0～10 ℃，設(shè)置間歇性粉碎3次，每次粉碎5 min，間隔3 min，將明場(chǎng)顯微鏡轉(zhuǎn)換成偏光鏡后對(duì)果粉進(jìn)行鏡檢，果粉密封干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2紅麩楊果粉脫脂 每次稱(chēng)取1.2.1節(jié)果粉60 g，置于脂肪抽出裝置中，加入石油醚(60～90 ℃)250 mL，回流脫脂。抽濾、濾渣揮干溶劑后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 超臨界CO2萃取黃顏木素

1.3.1夾帶劑的選擇 選用工業(yè)酒精、70%乙醇、無(wú)水乙醇、70%甲醇和甲醇5種試劑作為夾帶劑，在萃取壓力30 MPa，萃取溫度55 ℃，分離釜Ⅰ壓力10 MPa、分離釜Ⅰ溫度50 ℃，分離釜Ⅱ壓力5 MPa、分離釜Ⅱ溫度40 ℃，CO2流量20 L/h條件下萃取2 h，同時(shí)以未加夾帶劑為對(duì)照，從中篩選出一種較適合的夾帶劑。

1.3.2正交試驗(yàn)優(yōu)化 利用1.3.1節(jié)所選擇的夾帶劑，按文獻(xiàn)[16]中L9(34)正交試驗(yàn)探索果粉與夾帶劑固液比、萃取壓力、萃取溫度和萃取時(shí)間等4個(gè)因素對(duì)黃顏木素得率的影響，從而得到超臨界CO2萃取紅麩楊果粉中黃顏木素的最佳工藝參數(shù)。

1.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.3.2節(jié)優(yōu)化得到的工藝參數(shù)進(jìn)行萃?。杭慈〖t麩楊果粉500.0 g置于2 L的料筒中，裝入萃取釜，裝好壓環(huán)及密封圈，旋緊其堵頭，然后嚴(yán)格按規(guī)定程序操作并回流萃取。萃取時(shí)間達(dá)到所設(shè)定時(shí)間時(shí)，關(guān)閉相應(yīng)閥門(mén)、高壓泵等，回收CO2，從分離釜出料口出料，收集萃取物并干燥，以干燥物質(zhì)量除以500.0 g為黃顏木素萃取物的得率，并測(cè)定萃取物純度。

1.4 黃顏木素純度的測(cè)定

1.4.1對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取黃顏木素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品2.0 mg，加乙腈溶解后定容至100 mL容量瓶中，得20 mg/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液，保存，備用。

1.4.2HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈- 0.4%磷酸(體積比19 ∶81)；紫外檢測(cè)器檢測(cè)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。精密量取1.4.1節(jié)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL分置25 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成0、1.6、3.2、4.8、6.4和8.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，搖勻、用0.45 μm濾膜過(guò)濾后，依次進(jìn)樣10 μL檢測(cè)(進(jìn)樣3次)，以峰面積積分值的平均值為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并擬合出回歸方程。

1.4.3純度的測(cè)定 按1.4.1節(jié)方法配制萃取物樣品溶液，再按1.4.2節(jié)高效液相色譜分析條件，用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾后依次進(jìn)樣10 μL檢測(cè)(進(jìn)樣3次)，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，按峰面積歸一法計(jì)算黃顏木素的純度。

1.5 黃顏木素體外抗氧化性能測(cè)定

1.5.1DPPH·清除率測(cè)定 取優(yōu)化條件下得到的萃取物樣品，按照1.4.1節(jié)方法配制成質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、30和40 mg/L的黃顏木素樣品溶液。精密移取2.0 mL樣品溶液于試管中，稱(chēng)取一定量的DPPH·用無(wú)水乙醇溶解并配制成0.20 mmol/L溶液，取2.0 mL加入樣品溶液試管，混勻。在室溫下避光反應(yīng)30 min后，測(cè)其A517 nm值[17]，平行測(cè)定3次。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，精密稱(chēng)取一定量的VC配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度，按上述方法操作。DPPH·清除率(ηDPPH·)測(cè)定結(jié)果按式(1)計(jì)算：

ηDPPH·=(A0-A1)/A0×100%

(1)

式中：A0—無(wú)水乙醇對(duì)照液517 nm處的吸光度值；A1—測(cè)定樣液517 nm處的吸光度值。

1.5.2·OH清除率測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)使用建成生物工程研究所的·OH試劑盒測(cè)定紅麩楊果實(shí)中質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、120和160 mg/L的黃顏木素對(duì)·OH的清除效果。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，超純水調(diào)零，測(cè)其A550 nm值，平行測(cè)定3次?！H清除率(η·OH)測(cè)定結(jié)果按式(2)計(jì)算：

η·OH=(A′0-A2)/A′0×100%

(2)

式中：A′0—無(wú)水乙醇對(duì)照液550 nm處的吸光度值；A2—測(cè)定樣液550 nm處的吸光度值。

(3)

式中：A″0—無(wú)水乙醇對(duì)照液在550 nm處的吸光度值；A3—測(cè)定樣液在550 nm處的吸光度值。

1.5.4總抗氧化能力測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)使用建成生物工程研究所的總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)試盒測(cè)定紅麩楊果實(shí)中質(zhì)量濃度分別為120、160、200、240、340和440 mg/L的黃顏木素體外總抗氧化能力，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，超純水調(diào)零，測(cè)其A520 nm值，平行測(cè)定3次[18]?？偪寡趸芰?η總)測(cè)定結(jié)果按式(4)計(jì)算:

η總=(A4-A?0)×N×n/(0.01×30)

(4)

式中:A?0—無(wú)水乙醇對(duì)照液在520 nm處的吸光度值；A4—測(cè)定樣液在520 nm處的吸光度值；N—反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(反應(yīng)液總量/取樣量)；n—樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 超微粉碎果實(shí)干粉的結(jié)果分析

紅麩楊果實(shí)在溫度設(shè)置為0～10 ℃、間歇性粉碎3次，每次粉碎5 min，間隔3 min，粉粒運(yùn)用偏光顯微鏡進(jìn)行鏡檢，結(jié)果顯示粉體粒徑在0.1～1 μm范圍內(nèi)，細(xì)胞破壁率達(dá)到95%以上。

2.2 黃顏木素的HPLC檢測(cè)

2.2.1HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 黃顏木素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液HPLC圖譜見(jiàn)圖1(a)，以對(duì)照品梯度濃度溶液所得峰面積積分值的平均值為縱坐標(biāo)(Y)，溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制回歸曲線(xiàn)，所得擬合曲線(xiàn)回歸方程：Y=139 869X+10 315，R=0.999 6，表明黃顏木素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液在0～8.0 mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.2萃取物的HPLC檢測(cè) 優(yōu)化條件下萃取所得黃顏木素樣品的HPLC檢測(cè)圖譜見(jiàn)圖1(b)，與黃顏木素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(圖1(a))相對(duì)比，兩者均在12.5 min左右具有較大特征峰。按2.2.1節(jié)回歸方程以峰面積歸一法計(jì)算超臨界CO2萃取所得黃顏木素的純度為80.26%，其純度要明顯高于文獻(xiàn)[4]中酶輔助提取紅麩楊果實(shí)中黃顏木素的純度(14.59%)以及經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂XDA-8精制后的純度(68.15%)，說(shuō)明加入70%乙醇溶液作為夾帶劑后，超臨界CO2萃取技術(shù)的提取和蒸餾雙重作用對(duì)紅麩楊果粉中單味成分黃顏木素是非常有效的。

圖1 黃顏木素標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品(a)和萃取物樣品(b)溶液的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of dihydrofisetin standard(a) and extract(b)

2.3 超臨界CO2萃取工藝的優(yōu)化

2.3.1夾帶劑的選擇 超臨界CO2萃取紅麩楊果粉中黃顏木素時(shí)，由于純CO2對(duì)黃酮類(lèi)化合物的溶解度不高，如果不加夾帶劑萃取物中大部分是易揮發(fā)油或精油，黃酮類(lèi)化合物的含量會(huì)很低。夾帶劑的加入可以改善系統(tǒng)的極性，有利于提高產(chǎn)物得率[19]，這也是本研究超臨界CO2萃取紅麩楊果粉之前要用石油醚脫脂的原因。由于乙醇在超臨界CO2流體中的溶解度很大且無(wú)毒，往往作為首選夾帶劑。本研究考察發(fā)現(xiàn)工業(yè)酒精、70%乙醇、無(wú)水乙醇、70%甲醇和甲醇這5種夾帶劑存在時(shí)的萃取物得率分別為0.386%、0.408%、0.424%、0.403%和0.417%，本實(shí)驗(yàn)最終選擇70%乙醇溶液為夾帶劑。

2.3.2正交試驗(yàn)優(yōu)化 按照文獻(xiàn)[16]方法進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析見(jiàn)表2。由正交試驗(yàn)及方差分析可知，各因素對(duì)紅麩楊果實(shí)中黃顏木素得率的影響大小依次為果粉與夾帶劑固液比>萃取時(shí)間>萃取壓力>萃取溫度，通過(guò)直觀分析和極差分析得到萃取的最佳條件為：果粉與夾帶劑固液比5 ∶3(g ∶mL)、萃取壓力30 MPa、萃取溫度55 ℃、萃取時(shí)間2 h、分離釜Ⅰ的溫度55 ℃、壓力10 MPa、分離釜Ⅱ的溫度35 ℃、壓力5 MPa。

2.3.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在上述優(yōu)化工藝條件下，采用超臨界CO2萃取500.0 g紅麩楊果粉，所得黃顏木素萃取物的得率僅為0.46%，其得率要明顯低于前期酶輔助提取紅麩楊果實(shí)中黃顏木素的得率1.35%[4]，但前者純度為80.26%，后者純度僅為14.59%。也就是說(shuō)，超臨界CO2萃取紅麩楊果粉中黃顏木素的得率達(dá)到了3.69 mg/g，相反酶輔助提取紅麩楊果粉時(shí)得率可達(dá)1.35%，純度僅為14.59%，其黃顏木素的得率僅為1.97 mg/g。這是由于超臨界CO2萃取技術(shù)將萃取、分離(精制)和除去溶劑等多個(gè)單元過(guò)程合為一體，簡(jiǎn)化了工藝流程，從而提高了黃顏木素的純度。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)方差分析

2.4 體外抗氧化性能分析

2.4.1DPPH·清除率 如圖2(a)所示，黃顏木素表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH·清除能力，隨著黃顏木素質(zhì)量濃度的增加，供試品溶液對(duì)DPPH·的清除率逐漸升高。當(dāng)黃顏木素質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，DPPH·的清除率為89.76%，且在試驗(yàn)設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈一定的線(xiàn)性量效關(guān)系。此外，黃顏木素對(duì)DPPH·的清除能力接近于VC。通過(guò)線(xiàn)性擬合清除率曲線(xiàn)，計(jì)算得到黃顏木素對(duì)DPPH·的IC50值為6.93 mg/L。黃顏木素作為三酚羥基的雙氫黃酮保證了它提供質(zhì)子的能力，從而達(dá)到清除DPPH·的效果，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.4.2·OH清除率 如圖2(b)所示，黃顏木素表現(xiàn)出很強(qiáng)的·OH清除能力，隨著質(zhì)量濃度的增加，黃顏木素和VC對(duì)·OH的清除率均逐漸增加。當(dāng)黃顏木素質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)，·OH的清除率為92.38%，且在試驗(yàn)設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈一定的線(xiàn)性量效關(guān)系。而VC質(zhì)量濃度為160 mg/L時(shí)，·OH 的清除率僅為39.85%。由此可見(jiàn)，黃顏木素對(duì)·OH具有很強(qiáng)的清除能力，而且其清除能力明顯高于VC。通過(guò)線(xiàn)性擬合清除率曲線(xiàn)，計(jì)算得到黃顏木素對(duì)·OH的IC50值為9.05 mg/L。清除機(jī)理是否為黃顏木素酸性較強(qiáng)的酚羥基的氫與羥基自由基結(jié)合，從而達(dá)到清除效果還有待進(jìn)一步研究。

2.4.4總抗氧化能力 如圖2(d)所示，黃顏木素表現(xiàn)出較強(qiáng)的總抗氧化能力，且在試驗(yàn)設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈一定線(xiàn)性量效關(guān)系，總的來(lái)說(shuō)其總抗氧化能力強(qiáng)于VC。

a.DPPH·; b.·OH; d.總抗氧化能力total antioxidant capacity圖2 黃顏木素的體外抗氧化性能Fig.2 The antioxidant properties of dihydrofisetin in vitro

3 結(jié) 論

3.1紅麩楊果實(shí)經(jīng)超微粉碎、脫脂處理后，采用超臨界CO2萃取黃顏木素，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化萃取工藝。結(jié)果表明：最佳的萃取工藝條件為以70%乙醇為夾帶劑、果粉與夾帶劑固液比5 ∶3(g ∶mL)、萃取壓力30 MPa、萃取溫度55 ℃、萃取時(shí)間2 h、分離釜Ⅰ的溫度55 ℃、壓力10 MPa、分離釜Ⅱ的溫度35 ℃、壓力5 MPa。在此條件下，黃顏木素萃取物的得率為0.46%，純度為80.26%，雖然萃取物得率較低，但其純度達(dá)到了80.26%，遠(yuǎn)高于前期研究中酶輔助提取的純度(14.59%)以及用XDA-8大孔吸附樹(shù)脂吸附分離純化后的純度(68.15%)。

3.3運(yùn)用超臨界CO2萃取紅麩楊果粉中黃顏木素，既簡(jiǎn)化了工藝流程，又能提高黃顏木素的提取得率，而且對(duì)黃顏木素的純化程度也較高，但運(yùn)行經(jīng)濟(jì)成本相對(duì)較高。因此，超臨界CO2萃取只適合提取與分離純度要求較高的黃顏木素。