岳增文 王樹斌 劉進(jìn)忠

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC),是口腔頜面頭頸部常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有上升的趨勢，目前在口腔癌中的比例已超過90%[1]。OSCC嚴(yán)重威脅著人們的健康，而明確其發(fā)病機(jī)制，有針對性采取預(yù)防和干預(yù)措施，一直是研究人員努力的方向。

前期研究中發(fā)現(xiàn)大腫瘤抑制因子2(large tumor suppressor homolog 2,LATS2)基因在口腔鱗癌組織中的表達(dá)明顯低于正常口腔黏膜組織，且LATS2啟動子區(qū)域的高度甲基化與其低表達(dá)明顯相關(guān)[2-3]。通過過表達(dá)LATS2基因后口腔鱗癌細(xì)胞的增殖顯著受到抑制，且促凋亡蛋白Bcl表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞凋亡增加。先前的研究發(fā)現(xiàn)LATS2在腫瘤發(fā)展和細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用，并且可通過下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl家族表達(dá)，以及誘導(dǎo)前凋亡蛋白Bax、p53和caspase3等方式促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4-5]。在細(xì)胞生理過程中，自噬、凋亡、程序性壞死都是細(xì)胞死亡形式，它們相互影響、相互調(diào)節(jié)，自噬可能在此過程中扮演重要的角色。本研究通過在口腔鱗癌細(xì)胞中過表達(dá)LATS2來觀察其對OSCC細(xì)胞自噬功能的影響，以探討其在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人口腔鱗癌細(xì)胞株SCC-25(ATCC,美國典型培養(yǎng)物收藏中心)；慢病毒轉(zhuǎn)染LATS2于SCC-25的穩(wěn)定細(xì)胞系已成功構(gòu)建，該病毒載體無GFP熒光標(biāo)簽。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育。DMEM/F12完全培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司,美國)；PBS、青霉素和鏈霉素(Hyclone公司,美國)；抗LATS2多克隆抗體、抗Beclin-1抗體(Abcam公司,美國)；抗LC3B抗體(Cell signaing公司,美國)；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH) 多克隆抗體(上海威奧生物技術(shù)公司)；H-800型透射電鏡(日立,日本)；熒光檢測儀、Leica SP8共聚焦顯微鏡(Leica公司,德國)；Western印跡熒光檢測增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)系統(tǒng)(Azure公司,美國)。對照組分為Control組、Lenti-control組，實驗組為Lenti-LATS2組。

1.2 Western印跡

提取轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞，BCA法測量蛋白濃度，取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。于含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1 h，加入一抗后，4 ℃封閉過夜。TBST洗膜3 遍，分別加入二抗IgG稀釋成1∶5 000，室溫避光孵育2 h。TBST洗膜后，ECL法顯色蛋白條帶，然后進(jìn)行凝膠成像分析，共3 次平行實驗。

1.3 共聚焦顯微鏡檢測自噬流

本研究采用雙腺病毒mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染已穩(wěn)定表達(dá)LTAS2的SCC-25細(xì)胞。該系統(tǒng)中LC3攜帶有紅色熒光的mRFP和綠色熒光GFP，并可聚集在自噬前體和自噬體膜上，使其在熒光顯微鏡的紅綠合成圖像中呈黃色亮點；由于LC3攜帶的GFP綠色熒光在自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，所形成的酸性條件使GFP熒光淬滅，而mRFP紅色熒光耐受降解，使自噬溶酶體呈紅色亮點。據(jù)此可用來判斷自噬情況。為此，將MOI值為100的陰性對照腺病毒及mRFP-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒加入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8 h后進(jìn)行半量換液；72 h后置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行拍照。

1.4 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

各組細(xì)胞以2×105/ml的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)72 h后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，用不完全DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌，離心沉淀后加入2.5%戊二醛固定2 h。PBS洗3 次，再用4 ℃預(yù)冷的1%鋨酸固定1 h，脫水后包埋，70 nm厚超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色后，應(yīng)用透射電鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 LATS2對自噬相關(guān)蛋白變化的影響

Western印跡結(jié)果顯示，與空載體對照組和陰性對照組相比較，過表達(dá) LATS2 的SCC-25細(xì)胞的LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著高于空載體組和陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 過表達(dá)LATS2的SCC-25細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)(*P<0.05，**P<0.01)Fig 1 The expression of autophagy-related proteins in SCC-25 cells with LATS2 overexpression(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 免疫熒光檢測

LATS2基因在SCC-25細(xì)胞穩(wěn)定過表達(dá)后，SCC-25細(xì)胞經(jīng)雙熒光mRFP-GFP-LC3自噬流系統(tǒng)檢測自噬過程，即可見自噬體(黃色斑點)和自噬溶酶體(紅斑點色)數(shù)量有顯著增多，而對照組只有極弱而少的熒光斑點(P<0.05)(圖2)。

2.3 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

與空載體對照組(Control)和陰性對照組(Lenti-control)相比，過表達(dá) LATS2后，電鏡下SCC-25細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體和(或)自噬溶酶體的數(shù)量明顯增多(P<0.05)(圖3)。

3 討 論

自噬是一種非凋亡形式的程序性死亡方式，廣泛存在于真核細(xì)胞的病理生理過程中。當(dāng)細(xì)胞亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化后，其溶酶體發(fā)動對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程，并形成自噬體降解其底物。近年來隨著對自噬研究的不斷深入，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用引起更多人的重視。自噬在腫瘤發(fā)展中具有促進(jìn)和抑制的雙重作用[6]。在腫瘤發(fā)展過程中，缺氧和營養(yǎng)缺失條件下能夠誘發(fā)細(xì)胞自噬的發(fā)生，通過對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解而是新陳代謝發(fā)生變化，促使腫瘤細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下作出適應(yīng)性反應(yīng)。Beclin-1是哺乳動物中與酵母菌Atg6同源的基因，在調(diào)節(jié)自噬起始囊泡形成過程中起重要作用[7]。研究人員發(fā)現(xiàn)在小鼠敲除自噬相關(guān)基因Beclin-1后，其癌癥的發(fā)病率明顯高于正常小鼠，提示自噬在腫瘤的早起有一定的抑制作用[8]。而在胃癌、乳腺癌研究過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞自噬受到抑制后，細(xì)胞凋亡明顯增多[9-11]。而在腫瘤的治療過程中，通過提高自噬活性可以及時清除化療或放療后腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的破損細(xì)胞器和損壞的蛋白質(zhì)等有害成分，并為受損的細(xì)胞提供應(yīng)急底物和能量，以促進(jìn)細(xì)胞的修復(fù)[12]。由此可見，自噬對腫瘤既有殺傷作用，又有保護(hù)作用，合理利用自噬的這一特性，或許能為腫瘤的治療提供新的思路。

圖2 過表達(dá)LATS2的SCC-25細(xì)胞自噬流(*P<0.05，**P<0.01)Fig 2 Autophagy flux in SCC-25 cells with LATS2 overexpression(*P<0.05，**P<0.01)

圖3 過表達(dá)LATS2后SCC-25細(xì)胞自噬顆粒(TEM)(* P<0.05)Fig 3 Autophagy granules in SCC-25 cells with LATS2 overexpression(TEM)(* P<0.05)

LATS2基因位于13q11-q12，負(fù)責(zé)編碼絲/蘇氨基酸蛋白激酶，定位于中心體，通過積累微管蛋白和紡錘體的形成來調(diào)控細(xì)胞周期而發(fā)揮抑癌基因的作用[13]。前期的實驗發(fā)現(xiàn)，在OSCC中LATS2基因的表達(dá)與SCC-25細(xì)胞的凋亡數(shù)量成正相關(guān)。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中上調(diào)LATS2基因后，細(xì)胞的凋亡明顯增加，認(rèn)為自噬可能在其中扮演了重要的角色。LC3蛋白是酵母自噬相關(guān)蛋白(Atg8)的同源蛋白，在合成后其C末端即被Atg4蛋白酶切割轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-I并散在分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)后，LC3-I和磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3-II并始終穩(wěn)定地錨定于自噬體膜上直至與溶酶體融合，因此通常把LC3-I與LC3-II作為自噬標(biāo)志物[15]。另外，作為自噬誘導(dǎo)物，Beclin-1也可作為自噬和凋亡的重要橋梁。Bcl-2蛋白家族成員不僅調(diào)節(jié)著凋亡，而且調(diào)節(jié)著自噬。研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1可以通過 BH3區(qū)與Bcl-2蛋白家族結(jié)合，兩者結(jié)合后競爭性抑制磷脂酰肌醇3-激酶與Beclin-l的結(jié)合，使自噬小體形成過程受阻，使自噬作用受到抑制[16]。當(dāng)Beclin-1從 Beclin-1與Bcl-2所形成的異源二聚體解離后，Beclin-1激活自噬信號通路使自噬過程啟動[17]。金龍等[18]在舌鱗癌細(xì)胞SCC-15細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)NOD2基因后，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可以抑制細(xì)胞的增殖和遷移。而實驗發(fā)現(xiàn)在口腔鱗癌細(xì)胞過表達(dá)LATS2基因后自噬相關(guān)基因LC3 蛋白、Beclin-1蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)；雙熒光自噬流以及透射電子顯微鏡觀察到SCC-25細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的自噬體和自噬溶酶體明顯增多。先前研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LATS2基因后Bcl-2表達(dá)的下調(diào)，推測LATS2的上調(diào)使Bcl-2的表達(dá)受到抑制，這樣促使Beclin-1與Bcl-2所形成的異源二聚體解離，釋放出更多的Beclin-1，從而激活自噬。

自噬現(xiàn)象貫穿于真核細(xì)胞生長的全過程，在OSCC的不同階段可能發(fā)揮著不同的作用。調(diào)控OSCC細(xì)胞自噬活性，是否能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)展，仍需進(jìn)一步研究。促進(jìn)自噬被認(rèn)為是治療腫瘤的一個潛在途徑，而進(jìn)一步研究LATS2誘導(dǎo)SCC-25細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制，有助于為OSCC的研究提供新的思路。