耿夢雅，王李卓，章 堯，裴文俊，漆夢湘，楊 夢，許家豪，梁洋洋，呂 坤，何春玲，高家林，2，

皖南醫(yī)學(xué)院1弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌科，2弋磯山醫(yī)院內(nèi)分泌糖尿病研究所，3臨床醫(yī)學(xué)院，4安徽省活性生物大分子研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，5基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，6中心實(shí)驗(yàn)室，7重大疾病非編碼RNA轉(zhuǎn)化研究安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖241002

肝臟具有高水平的新陳代謝應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬［1］，肝臟自噬通過促進(jìn)大分子和細(xì)胞器的降解為饑餓的細(xì)胞提供氨基酸、葡萄糖和游離脂肪酸［2］，用于能量生產(chǎn)和合成新的大分子，并控制線粒體等細(xì)胞器的質(zhì)量和數(shù)量，從而在調(diào)節(jié)肝臟生理中發(fā)揮著動(dòng)態(tài)平衡的作用［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，在患有肝相關(guān)疾病的人的肝細(xì)胞中自噬被調(diào)節(jié)，自噬參與了各種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，包括肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝細(xì)胞癌［1,4］等。細(xì)胞自噬分為巨自噬、微自噬、和分子伴侶介導(dǎo)的自噬［5］，其中巨自噬在本文中稱為自噬，其依賴于自噬小體的產(chǎn)生，通過自噬小體隔離細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并將其內(nèi)容物進(jìn)行降解加工［6］，所以巨自噬中的降解和再循環(huán)過程嚴(yán)格取決于溶酶體的功能［7,8］。

肝臟含有豐富的溶酶體，溶酶體是膜結(jié)合的細(xì)胞器，溶酶體膜包含多種蛋白質(zhì)，其中溶酶體膜蛋白是溶酶體的一個(gè)重要功能單位，SID1跨膜家族成員2（SID1 transmembrane family member 2,Sidt2）是一種溶酶體膜蛋白，其主要在肝臟和腎臟組織中高表達(dá)［9］。研究表明當(dāng)溶酶體膜蛋白異常時(shí)，溶酶體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，溶酶體不能發(fā)揮正常的生物學(xué)功能，進(jìn)而可能影響自噬［10-11］。自噬異常時(shí)受損的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)降解異常，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和細(xì)胞死亡［12］。同時(shí)，自噬也可以作為促進(jìn)肝臟疾病發(fā)生和發(fā)展的替代途徑［13］。目前研究表明當(dāng)Sidt2缺失后肝臟出現(xiàn)自噬紊亂［11］，但其具體機(jī)制并未得到探究，基于此，我們希望通過對溶酶體膜蛋白Sidt2的研究來進(jìn)一步探究肝臟自噬的改變，希望為肝臟相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展提供潛在靶標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

HL7702人肝臟細(xì)胞購自購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，用10%FBS（Excell Bio）1640培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)箱CO2濃度保持在5%，溫度保持在37 ℃。

1.2 使用CRISPR/Cas9基因編輯慢病毒載體系統(tǒng)剔除Sidt2基因

購買Lenticrispr-v2（AddgenePlasmid49535）質(zhì)粒，利用sgRNA在線設(shè)計(jì)工具（http://crispr.mit.edu/）設(shè)計(jì)靶向Sidt2的sgRNA，序列如下（F:5'-CACCGCAGGT GCCCCTAATCCTGCG-3'，R:5'-AAACCGCAGGATT AGGGGCACCTGC-3'），通過生物公司（SangonBiotech）進(jìn)行合成，使用CRISPR/Cas9 lentivirus system，將Lenticrispr-v2 質(zhì)粒線性化，與退火的sgRNA 雙鏈進(jìn)行連接，構(gòu)建Lenticrispr-v2-Sidt2重組質(zhì)粒。使用Vigofect（VigorousBiotechnology,China）轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染Lenticrispr-v2質(zhì)粒和Lenticrispr-v2-Sidt2重組質(zhì)粒構(gòu)建慢病毒，將得到的慢病毒轉(zhuǎn)染HL7702細(xì)胞，48 h后使用嘌林霉素篩選72 h，生存下來的細(xì)胞即為轉(zhuǎn)染成功的Sidt2+/+組和Sidt2-/-組。

1.3 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)

具體方法如前所述［14］，本研究中使用一抗包括兔抗LC3B（1∶1000；Sigma-Aldrich），鼠抗P62（1∶1000;abcam），鼠抗β-actin（1∶1000;Sigma-Aldrich），兔抗SIDT2（1∶1000;abgent），鼠抗LAMP1（1∶1000;Santa），兔抗Atg5（1∶1000;Cell signaling technology），兔抗Atg7（1∶1000;Cell signaling technology），兔抗Atg12（1∶1000;Cell signaling technology）。

1.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種在玻底培養(yǎng)皿上，使用多聚甲醛固定，封閉后使用一抗孵育過夜，二抗黑暗環(huán)境下孵育90 min，使用DAPI（1 μg/mL）染核后在激光共聚焦顯微鏡（Olympus,Japan）下進(jìn)行拍攝。LC3B與P62免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，采用含有LC3B（1∶200；Sigma-Aldrich）及P62（1∶200;abcam）的抗體孵育細(xì)胞過夜，抗鼠二抗Cy3-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（Proteintech;1∶200）與抗兔二抗CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（Proteintech;1∶200）混合孵育的方式。LC3B 與LAMP1 免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，采用含有LC3B（1∶200；Sigma-Aldrich）及LAMP1（1∶200；Santa）的抗體孵育細(xì)胞過夜，熒光二抗采取上述方法混合孵育。LysoTracker（Beyotime）同樣將細(xì)胞接種在玻底培養(yǎng)皿上，在生長到合適密度之后，加入含有LysoTracker終濃度為75 nmol/L的細(xì)胞培液，刺激45 min后在激光共聚焦顯微鏡（Olympus,Japan）下拍攝。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，使Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究中的每組實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建Sidt2剔除HL7702細(xì)胞模型

對HL7702細(xì)胞使用Crispr-Cas9技術(shù)進(jìn)行Sidt2基因的敲除，挑取單克隆細(xì)胞后進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示模型構(gòu)建成功，使用Western blot技術(shù)檢測Sidt2蛋白水平表達(dá)（圖1A)，結(jié)果顯示Sidt2-/-組較Sidt2+/+組蛋白水平明顯降低（P＜0.05，圖1B）。

圖1 HL7702細(xì)胞Sidt2剔除后蛋白水平驗(yàn)證Fig.1 Protein level verification after Sidt2 deletion in HL7702 cells.A:Western blotting for detecting Sidt2 protein expression before and after Sidt2 deletion;B:Quantitative analysis of the results.*P＜0.05.

2.2 HL7702細(xì)胞Sidt2剔除后自噬通路異常

對HL7702細(xì)胞模型進(jìn)行基礎(chǔ)自噬水平的相關(guān)檢測（圖2A），發(fā)現(xiàn)Sidt2-/-細(xì)胞較Sidt2+/+細(xì)胞，LC3-II/I和P62表達(dá)明顯增加（P＜0.01，圖2B）。

圖2 HL7702細(xì)胞Sidt2剔除后自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of key autophagy proteins after Sidt2 knockout in HL7702 cells.A:Western blotting for detecting the expression of the key autophagy proteins before and after Sidt2 deletion;B:Quantitative analysis of the results.**P＜0.01.

2.3 HL7702細(xì)胞Sidt2剔除后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)改變

對Sidt2缺失前后自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測（圖3A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sidt2-/-組較Sidt2+/+組自噬相關(guān)蛋白Atg5（P＜0.001）、Atg7（P＜0.01）、Atg12（P＜0.05）表達(dá)均明顯降低（圖3B）。

圖3 HL7702細(xì)胞Sidt2剔除后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of autophagy-related proteins after Sidt2 deletion in HL7702 cells.A:Western blotting for detecting the expression of autophagy-related proteins before and after Sidt2 is eliminated;B:Quantitative analysis of the results.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.4 免疫熒光檢測HL7702 細(xì)胞Sidt2 剔除后LC3B 及P62的表達(dá)

對Sidt2缺失后自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)及定位進(jìn)行了進(jìn)一步的檢測，可以清楚的發(fā)現(xiàn)LC3B和P62在胞質(zhì)中表達(dá)（圖4A、C），同時(shí)Sidt2-/-組較Sidt2+/+組LC3B及P62熒光點(diǎn)數(shù)均增加（P＜0.001，圖4B、D）。

圖4 免疫熒光檢測HL7702細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)Fig.4 Immunofluorescence detection of the expression of key autophagy proteins in HL7702 cells (10 μm).A,B:Immunofluorescence assay of LC3B in Sidt2+/+and Sidt2-/-HL7702 cells and quantitative analysis.C,D:Immunofluorescence assay of P62 in Sidt2+/+and Sidt2-/-HL7702 cells and quantitative analysis.***P＜0.001.

2.5 HL7702細(xì)胞Sidt2基因缺失后自噬小體對P62貨物蛋白識別及封存的影響

對Sidt2+/+組及Sidt2-/-組自噬小體和P62貨物蛋白進(jìn)行免疫熒光共定位檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sidt2-/-組較Sidt2+/+組相比LC3B及P62的皮爾森相關(guān)系數(shù)降低，顯示共定位減少（圖5）。

圖5 Sidt2缺失后LC3B與P62免疫熒光共定位Fig.5 Immunofluorescence co-localization of LC3B and P62 after Sidt2 deletion in HL7702 cells(10 μm).

2.6 Sidt2基因缺失對HL7702細(xì)胞自噬小體與溶酶體融合的影響

對Sidt2+/+組及Sidt2-/-組自噬小體及溶酶體標(biāo)記蛋白進(jìn)行免疫熒光共定位檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sidt2-/-組較Sidt2+/+組相比，LC3B與LAMP1的皮爾森相關(guān)系數(shù)降低（圖6），自噬小體與溶酶體融合減少。

圖6 Sidt2 缺失后LC3B 與LAMP1 免疫熒光共定位Fig.6 Immunofluorescence co-localization of LC3B and LAMP1 after Sidt2 deletion in HL7702 cells(10 μm).

2.7 Sidt2基因缺失后HL7702細(xì)胞酸性溶酶體數(shù)量減少

使用溶酶體示蹤劑LysoTracker對Sidt2基因缺失前后酸性溶酶體進(jìn)行標(biāo)記（圖7A），結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sidt2-/-組較Sidt2+/+組相比酸性溶酶體數(shù)量減少（P＜0.05，圖7B）。

圖7 Sidt2缺失后酸性溶酶體數(shù)量的改變Fig.7 LysoTracker for detecting the number of functional lysosomes before and after Sidt2 knockout in HL7702 cells and quantitative analysis of the results(10 μm).*P＜0.05.

3 討論

肝病已經(jīng)成為全世界疾病和死亡的主要原因之一［15］。已有研究表明，肝炎、脂肪變、肝細(xì)胞癌等都與自噬的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［16］，自噬通過消除肝相關(guān)疾病患者體內(nèi)引入的受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷和細(xì)胞死亡［2］。

巨自噬在本文中稱為自噬，其過程依賴自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并將其內(nèi)容物進(jìn)行降解加工的過程［6］。溶酶體的功能對自噬的降解和再循環(huán)過程起著決定性的作用［17,18］，而溶酶體膜蛋白是溶酶體的一個(gè)重要功能單位［19,20］，參與多種生理過程，如溶酶體的酸化和膜融合［21,22］，對溶酶體的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能維持具有重要作用，已有研究表明多種溶酶體膜蛋白參與了自噬的調(diào)節(jié)過程［14,23,24］，因此對溶酶體膜蛋白的研究值得引起更多的關(guān)注。在我們研究全身敲除Sidt2的小鼠時(shí)，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟出現(xiàn)脂肪變性［10］，而最近有證據(jù)表明，自噬溶酶體途徑在肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝中起重要作用，肝臟中自噬的降低可能會導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)的積累，同時(shí)脂質(zhì)的積累可能會隨著年齡的增長而導(dǎo)致自噬功能的降低［25,26］，因此我們使用Crispr-Cas9技術(shù)構(gòu)建了Sidt2敲除的人肝臟HL7702細(xì)胞模型，并對其進(jìn)行自噬相關(guān)研究，希望為肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展提供干預(yù)靶標(biāo)。

我們發(fā)現(xiàn)人肝臟細(xì)胞（HL7702）Sidt2缺失后自噬關(guān)鍵蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62出現(xiàn)堆積，同時(shí)免疫熒光亦表明LC3B及P62熒光點(diǎn)數(shù)增加，LC3-Ⅱ常用作為自噬小體標(biāo)記物［27,28］，其表達(dá)增加說明自噬小體增加，而自噬小體的增加可能是自噬被激活導(dǎo)致自噬小體產(chǎn)生增多或者自噬受阻導(dǎo)致自噬小體降解障礙所致。P62的堆積可能是其產(chǎn)生增多或者降解減少所致。以上結(jié)果提示我們Sidt2基因的缺失會導(dǎo)致肝臟細(xì)胞自噬發(fā)生紊亂。隨后，我們對自噬相關(guān)蛋白Atg5、Atg7、Atg12進(jìn)行檢測，自噬相關(guān)蛋白參與自噬小泡延伸形成自噬小體的過程［29,30］，當(dāng)Sidt2基因缺失后自噬相關(guān)蛋白表達(dá)降低表明自噬小體的形成受阻，進(jìn)一步說明LC3B的增多是自噬小體降解受阻所致。而P62增加的具體原因還需要進(jìn)一步的研究。

自噬過程中P62 通過自噬溶酶體途徑進(jìn)行降解［31,32］，所以我們將研究聚焦在了自噬溶酶體降解途徑上。P62降解的過程首先需要與自噬小體結(jié)合，再通過自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體進(jìn)行降解［33］，我們首先對自噬小體與P62的結(jié)合進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Sidt2缺失后代表自噬小體的LC3B 與P62 的共定位降低。這有兩種解釋，其一可能是Sidt2剔除后P62通過自噬溶酶體途徑降解增多所致，其二可能是Sidt2剔除后對貨物蛋白P62的識別及封存出現(xiàn)異常所致［34］。因?yàn)樯鲜鑫覀円呀?jīng)得出自噬小體的增多是降解障礙導(dǎo)致的，同時(shí)P62蛋白水平的增加也表示其降解并不會增多，故自噬小體對貨物蛋白的識別及封存障礙是Sidt2剔除后P62堆積的重要原因［34］。

隨后我們又對自噬溶酶體的形成進(jìn)行了探究。自噬溶酶體是由自噬小體與溶酶體融合形成的，我們發(fā)現(xiàn)Sidt2基因缺失后LC3B與溶酶體膜性標(biāo)志物L(fēng)AMP1［35］共定位降低，提示Sidt2基因的缺失導(dǎo)致自噬小體與溶酶體融合障礙［36］。而由于Sidt2是溶酶體膜蛋白，我們猜想其缺失可能會導(dǎo)致溶酶體的異常［20,21］，所以我們使用LysoTracker 對酸性溶酶體進(jìn)行檢測［27］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sidt2缺失后酸性溶酶體數(shù)量減少。以上兩點(diǎn)是導(dǎo)致P62與LC3B堆積自噬受阻的重要原因。已有文獻(xiàn)表明，在肝臟中自噬可以通過脂質(zhì)吞噬作用將脂質(zhì)小滴隔離在自噬小體內(nèi)并在溶酶體內(nèi)降解，以防脂質(zhì)在肝臟中的堆積［37］，所以Sidt2缺失導(dǎo)致的自噬受阻可能會導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)堆積，進(jìn)而影響肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，這將為我們進(jìn)一步的研究指明方向。

綜上所述，人肝臟細(xì)胞Sidt2基因缺失后自噬小體對貨物蛋白的識別與封存受阻，同時(shí)酸性溶酶體數(shù)量減少、自噬小體與溶酶體融合受阻導(dǎo)致自噬溶酶體形成障礙，從而導(dǎo)致自噬小體與貨物蛋白發(fā)生堆積。我們的研究可能只是Sidt2對人肝臟自噬調(diào)節(jié)的一部分，但為深入探究溶酶體膜蛋白與肝臟疾病的關(guān)系提供了一個(gè)新思路。