池宏波 楊英梅

細(xì)胞色素P450（CYP）是一組參與生物轉(zhuǎn)化的超基因家族編碼的同工酶。CYP2C19作為CYP超基因家族中的重要一員，是人體內(nèi)藥物代謝的主要酶，參與抗血小板藥物、質(zhì)子泵抑制劑、抗精神藥物、抗抑郁藥等在人體內(nèi)的代謝反應(yīng)[1]。氯吡格雷是臨床上常用的抗血小板藥物。CYP2C19不同的基因型能夠增強(qiáng)或減弱氯吡格雷的抗血小板作用，其中功能缺失等位基因CYP2C19*2與氯吡格雷抵抗有關(guān)，可導(dǎo)致不良心血管事件發(fā)生率顯著增加[2-3]。研究表明，CYP2C19的基因多態(tài)性存在著明顯的地域性和種族差異[4]。本研究通過(guò)對(duì)臺(tái)州地區(qū)501例漢族人群進(jìn)行CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)，分析臺(tái)州地區(qū)漢族人群CYP2C19基因型、代謝表型的分布以及不同性別之間的差異，為該地區(qū)臨床個(gè)體化抗血小板治療提供遺傳學(xué)依據(jù)，以減少不良心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2015年9月至2018年12月于臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）恩澤醫(yī)院住院、門診，擬使用氯吡格雷的501例患者為研究對(duì)象，其中男357例，女144例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）連續(xù)在臺(tái)州居住5年以上；（2）漢族；（3）相互之間無(wú)血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）無(wú)家族遺傳病史；（2）短期內(nèi)無(wú)手術(shù)輸血史；（3）無(wú)惡性腫瘤、慢性血液系統(tǒng)疾病。

1.2 主要儀器與試劑 ABI Stepone plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），NES-32核酸提取儀（杭州艾康生物技術(shù)有限公司）；全血基因組DNA提取試劑盒（杭州艾康生物技術(shù)有限公司），人類CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒（武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 外周血DNA提取 抽取受檢者清晨空腹靜脈血2ml（EDTA-K2抗凝），利用NES-32核酸提取儀按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行全血DNA的提取和純化。

1.3.2 熒光定量PCR 根據(jù)被測(cè)樣品數(shù)目準(zhǔn)備八連管，并預(yù)先標(biāo)記樣品編號(hào)，將分裝好的CYP2C19*2、CYP2C19*3反應(yīng)液加入預(yù)先標(biāo)記的八連管中，23μl/管，然后加入2μlDNA模板，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性及陰性對(duì)照，反應(yīng)總體系為25μl。擴(kuò)增條件：預(yù)反應(yīng)37℃ 10min；預(yù)變性95℃5min；變性95℃ 15s，延伸62℃ 60s，共 40個(gè)循環(huán)；4℃保存。

1.3.3 基因型檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的基因型有CYP2C19*1/CYP2C19*1，CYP2C19*1/CYP2C19*2，CYP2C19*1/CYP2C19*3，CYP2C19*2/CYP2C19*2，CYP2C19*2/CYP2C19*3，CYP2C19*3/CYP2C19*3。結(jié)果判讀：CYP2C19*1/CYP2C19*1為野生型，CYP2C19*1/CYP2C19*2、CYP2C19*1/CYP2C19*3為突變雜合型，CYP2C19*2/CYP2C19*2，CYP2C19*2/CYP2C19*3，CYP2C19*3/CYP2C19*3為突變純合型。根據(jù)不同基因型編碼的不同代謝活性酶對(duì)氯吡格雷的不同代謝動(dòng)力學(xué)特征，將野生型歸為快代謝型，突變雜合型歸為中間代謝型，突變純合型歸為慢代謝型。

1.3.4 質(zhì)量控制 PCR擴(kuò)增設(shè)立陽(yáng)性和陰性對(duì)照，所有操作均嚴(yán)格按照儀器和試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)樣本的群體代表性。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測(cè) 6種基因型符合遺傳平衡定律（χ2=0.502，P=0.990），所選取的受檢者具有群體代表性，處于平衡狀態(tài)。

2.2 CYP2C19等位基因頻率和基因型分布 本研究的501例受檢者中，CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3 3 種等位基因的頻率分別為 61.28%、33.93%、4.79%。CYP2C19基因型分布由高到低依次為CYP2C19*1/CYP2C19*1（39.32%）、CYP2C19*1/CYP2C19*2（37.33%）、CYP2C19*2/CYP2C19*2（13.57%）、CYP2C19*1/CYP2C19*3（6.19%）、CYP2C19*2/CYP2C19*3（3.39%）、CYP2C19*3/CYP2C19*3（0.20%）。不同性別者之間的CYP2C19 基因型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=1.521，P=0.931），見(jiàn)表1。

2.3 CYP2C19代謝表型的分布 501例受檢者中，CYP2C19代謝表型以中間代謝型（43.51%）為主，其次快代謝型占39.32%，慢代謝型占17.17%。不同性別者之間的代謝表型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.217，P=0.544）。見(jiàn)表2。

2.4 臺(tái)州地區(qū)漢族人群CYP2C19基因型分布與國(guó)內(nèi)其它地區(qū)比較 臺(tái)州地區(qū)漢族人群的CYP2C19基因型分布與寧德[5]、南京[6]、周口[7]地區(qū)存在差異，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；臺(tái)州地區(qū)漢族人群的CYP2C19基因型分布與西安[8]地區(qū)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表 3。

表1 不同性別者之間CYP2C19等位基因頻率和基因型分布表[例（%）]

表2 不同性別者之間CYP2C19代謝表型的分布表[例（%）]

3 討論

隨著人類基因組研究的快速發(fā)展，個(gè)性化用藥引起了廣泛關(guān)注，越來(lái)越多臨床醫(yī)生意識(shí)到其重要性。個(gè)體間的藥物反應(yīng)差異（療效不佳或中毒）是許多藥物臨床應(yīng)用時(shí)面臨的一個(gè)重要問(wèn)題，其主要與肝臟相關(guān)藥物代謝酶活性有關(guān)，影響代謝酶活性的原因包括遺傳因素和非遺傳因素。遺傳學(xué)改變導(dǎo)致代謝酶表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，具體體現(xiàn)在由等位基因編碼的代謝酶的代謝能力大相徑庭，進(jìn)而導(dǎo)致在治療過(guò)程中對(duì)個(gè)體反應(yīng)和藥物不良反應(yīng)產(chǎn)生重要影響[10]。研究表明，CYP2C19是參與體內(nèi)包括氯吡格雷在內(nèi)的多種藥物代謝的關(guān)鍵酶，而CYP2C19基因呈多態(tài)性分布，導(dǎo)致CYP2C19酶活性不同，從而影響藥物的療效和不良反應(yīng)的發(fā)生率[11]。因此，檢測(cè)CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)患者藥物的正確選擇有著至關(guān)重要的作用。

表3 臺(tái)州某地區(qū)漢族人群與其它地區(qū)CYP2C19基因型分布比較（%）

本研究對(duì)臺(tái)州地區(qū)501例漢族人群的CYP2C19基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示野生型 CYP2C19*1/CYP2 C19*1占39.32%；雜合突變型CYP2C19*1/CYP2C19*2占37.33%、CYP2C19*1/CYP2C19*3占6.19%；純合突變型 CYP2C19*2/CYP2C19*2占 13.57%、CYP2C19*2/CYP2C19*3占3.39%、CYP2C19*3/CYP2C19*3占0.20%；快代謝型占39.32%，中間代謝型占43.51%，慢代謝型占17.17%，且CYP2C19基因型分布和代謝表型在不同性別間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與趙連爽等[12]報(bào)道的結(jié)果一致。臺(tái)州地區(qū)漢族人群中，中間代謝型和慢代謝型占60.68%，這表明臺(tái)州地區(qū)漢族人群中約60%的人存在不同程度的氯吡格雷抵抗現(xiàn)象。因此，臨床應(yīng)格外重視此類患者，在氯吡格雷的實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)患者的基因代謝型及時(shí)增加劑量或更換其他抗凝血藥物，以避免不良心血管事件的發(fā)生[13]。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，CYP2C19的基因多態(tài)性分布具有明顯的種族和地域性差異[14]。本研究針對(duì)CYP2C19的基因多態(tài)性與國(guó)內(nèi)其它地區(qū)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，臺(tái)州地區(qū)漢族人群的CYP2C19基因型分布與寧德、南京和周口比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我國(guó)幅員遼闊，各地區(qū)飲食、生活環(huán)境和遺傳背景不同，長(zhǎng)期的集聚生活中為了適應(yīng)各自獨(dú)特的生存環(huán)境而產(chǎn)生CYP2C19基因突變的差異；與西安比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與兩者樣本差異量較大，研究對(duì)象選擇標(biāo)準(zhǔn)不同等有關(guān)。

綜上所述，CYP2C19基因型存在個(gè)體差異，導(dǎo)致不同基因型患者的酶活性不同，從而引起氯吡格雷的療效差異。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)患者的基因型制定療效最佳、不良反應(yīng)最少的個(gè)體化抗血小板治療方案及預(yù)測(cè)不良心血管事件的發(fā)生。