王萌，任麗彤，凌悅銘，谷海濤，孔廣超*

(1 綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003；2 石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832003)

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TFs)是一類與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件發(fā)生特異性作用的蛋白質(zhì)[1]，具有調(diào)節(jié)目的基因在特定時(shí)空表達(dá)的功能[2]，在調(diào)控高等植物生長發(fā)育、形態(tài)建成、植物應(yīng)對非生物脅迫以及生物應(yīng)激反應(yīng)等方面具有重要作用[3]。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，是NAM(No apical meristem)、ATAF(Arabidopsis transcription activation factor)和CUC(Cup-shaped cotyledon)的總稱，其包含3個(gè)超家族[4]。首個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子是從矮牽牛中克隆得到的[5]，因矮牽牛中的NAM基因和擬南芥ATAF1/2和CUC2基因編碼蛋白的N端均含有1段相同的氨基酸序列，因而取首字母命名為NAC[6]。目前，在擬南芥、水稻、小麥等物種中已相繼發(fā)現(xiàn)了多個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子[7-9]。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族典型的特點(diǎn)是在其N端有1個(gè)由150個(gè)左右氨基酸組成NAC保守結(jié)構(gòu)域，而C端則具有多樣性，是轉(zhuǎn)錄激活或抑制功能域，主要在調(diào)節(jié)植物發(fā)育以及識別環(huán)境刺激等方面發(fā)揮作用[10]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御逆境脅迫方面具有重要作用，在高鹽或干旱的條件下，擬南芥中NAC基因ANAC019表達(dá)量均上調(diào)[11]。過量表達(dá)ATAF1基因的擬南芥會(huì)出現(xiàn)明顯的矮化和開花延遲現(xiàn)象，同時(shí)轉(zhuǎn)ATAF1基因的擬南芥對干旱的耐性提高[12]。水稻中OsNAC10主要在根和花序中優(yōu)勢表達(dá)，并能被ABA、干旱和高鹽誘導(dǎo)表達(dá)[13]。然而，迄今為止尚未見到在六倍體小黑麥有關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子研究的公開報(bào)道。

小黑麥(×TriticaleWittmack)由小麥屬(Triticum)和黑麥屬(Secale)經(jīng)屬間有性雜交和染色體加倍培育而成的一種新型異源多倍體作物[14]，不但保持了小麥籽粒產(chǎn)量高和品質(zhì)優(yōu)良的特性，還結(jié)合了黑麥抗逆性強(qiáng)的優(yōu)勢，是糧、飼兼用的一種新作物[15-16]。在研究[17-18]和生產(chǎn)實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，六倍體小黑麥表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性，因此挖掘其抗旱基因?qū)τ诶斫庑『邴溈鼓婢硻C(jī)制以及基因工程育種將具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

六倍體小黑麥品種新小黑麥3號[19]，由石河子大學(xué)麥類作物研究所選育并提供。將新小黑麥3號種子清洗消毒后種植于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站干旱脅迫池中，通過滴管技術(shù)控制灌溉量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。在小黑麥田間抽穗后對干旱脅迫區(qū)停止灌水，對照區(qū)正常進(jìn)行灌溉，并為防止降雨對干旱脅迫效應(yīng)的影響，在干旱脅迫區(qū)搭建遮雨棚，阻斷降水。在開花期選取生育進(jìn)程基本一致的植株進(jìn)行標(biāo)記。待干旱脅迫區(qū)小黑麥植株呈現(xiàn)葉片卷曲、土壤含水量、葉片游離脯氨酸、電導(dǎo)率均較對照明顯升高時(shí)，采集干旱脅迫和正常灌溉下的小黑麥根、莖、旗葉和幼粒(開花后22 d)，分別于液氮中迅速冷激后保存于-80 ℃冰箱備用,以供提取RNA進(jìn)行基因克隆以及基因表達(dá)特點(diǎn)分析。

1.2 總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄

以上述小黑麥根、莖、旗葉以及幼粒為材料，利用abm(廣州)生物科技公司Hipure HP Plant RNA Mini Kit試劑盒提取小黑麥各組織總RNA，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及超微量紫外-可見光分光光度計(jì)(NanoDrop,ND-1000,USA)檢測質(zhì)量合格后，采用寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 基因全長cDNA序列克隆

在本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以干旱脅迫后的小黑麥經(jīng)RNA-Seq測序獲得的1條顯著上調(diào)表達(dá)的長度為708 bp的Unigene c51971的測序結(jié)果為基礎(chǔ),采用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)3′RACE引物：C065-1TGGGGGACCAGCAGACCGCGATC；C065-2TCGTCGGCGCTGCTGAGCCCTTC；5′RACE引物：B086-1CGGTCTTGTTGAGGTC；B086-2CTTGGGGGTGAGGTAGT，B086-3：GGTGGAACCGGAAGCC，以上述旗葉中cDNA為模板，經(jīng)RACE擴(kuò)增獲得3′端和5′端序列,利用生物信息學(xué)軟件CAP3進(jìn)行全長拼接獲得1 624 bp序列，在NCBI中預(yù)測基因的起始和終止密碼子位置，獲得ORF全長為1 052 bp。以拼接到的ORF全長序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物(上游：5′-TCAGATCTTCCACATGTTGG-3′；下游:5′-ATGTCGGACGTGACGGCGGTG-3′)，以上述旗葉中cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，80 s；35 個(gè)循環(huán)，72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，連接到pMD19-T Vector載體上轉(zhuǎn)化TOPO10，經(jīng)藍(lán)、白斑篩選與PCR 鑒定、測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

對已測序的序列采用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線查找序列的ORF開放閱讀框和編碼區(qū)CDS，并采用在線生物學(xué)軟件Protparam(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)對該基因編碼的氨基酸序列理化性質(zhì)進(jìn)行分析。利用ExPASy Prot Scale(http://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測蛋白的疏水性。利用(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行超家族分析。通過DNAMAN軟件將所克隆基因的氨基酸序列與同源性較高的NAC基因氨基酸序列進(jìn)行多重比較分析。通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blastn和Blastp搜索核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行序列同源性分析。利用TMHMM Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測跨膜區(qū)域，借助TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。使用MEGA 5.0 軟件采用相鄰連接法(neighbor-joining,NJ)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。利用 Signal(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽，利用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat)預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建該基因預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。

1.5 基因表達(dá)特點(diǎn)檢測

為明確該基因在小黑麥不同組織部位以及干旱脅迫下的表達(dá)特點(diǎn)，以開花期后22 d干旱脅迫和對照區(qū)小黑麥根、莖、旗葉和幼粒cDNA為模板，以所克隆基因的CDS序列(避開保守域)為基礎(chǔ)、采用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量引物(上游引物5′-CGTCGGCATGAAGAAGACGC-3′，下游引物5′-AGTCCTTGTCGAACACCCGG-3′)，并以小麥Actin為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。采用TIANGEN公司SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒，以10 μL反應(yīng)體系(2x SuperReal PreMixPlus 6 μL,上游引物0.25 μL，下游引物0.25 μL,cDNA模板1 μL，以RNase-free ddH2O補(bǔ)至10 μL)，在Roche Light-Cycler480R儀進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。qPCR擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性95 ℃，15 min；變性95 ℃，10 s；退火61 ℃，30 s；擴(kuò)增72 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品及內(nèi)參基因做3次重復(fù)取平均值,采用2-△△Ct(Livak)法計(jì)算基因相對表達(dá)量[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的總RNA質(zhì)量

所提取的小黑麥根、莖、旗葉以及幼粒總RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其28S與18S核糖體RNA條帶清晰可見，且亮度比基本呈2∶1(圖1)，可見所提取的總RNA完整性較好，無DNA污染。經(jīng)超微量紫外-可見光分光光度計(jì)檢測，所提RNA的OD260/280均在1.8～2.0之間，無明顯污染。

泳道1～4分別表示根、莖、旗葉、幼粒。圖1 小黑麥總RNA電泳圖

2.2 小黑麥基因全長cDNA

通過RACE技術(shù)分別獲得的5′RACE序列為224 bp、3′RACE序列為557 bp。經(jīng)在線拼接獲得1條全長1 624 bp的序列。利用ORF Finder查找到的ORF全長為1 059 bp。以該ORF(1 059 bp)為基礎(chǔ)通過PCR擴(kuò)增獲得了1條清晰的條帶(圖2)。將所獲得的基因片段回收(圖3左)并克隆到大腸桿菌中(圖3右)、經(jīng)測序結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)獲得了完整的1 059 bp序列CDS。

M—2 000 bp DNA markerⅡ；1～3為重復(fù)。圖2 小黑麥基因全長cDNA序列PCR擴(kuò)增

M—2 000 bp DNA markerⅡ；左為膠回收，1～5為重復(fù)；右為菌液PCR，1～6為重復(fù)。圖3 基因回收及大腸桿菌菌液PCR

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 保守結(jié)構(gòu)域

通過NCBI在線分析，該全長cDNA預(yù)測蛋白由352個(gè)氨基酸組成，其中第20～148個(gè)氨基酸序列之間有1個(gè)由129個(gè)連續(xù)氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域與NAC轉(zhuǎn)錄因子家族NAM亞家族的保守結(jié)構(gòu)域(PPGFRFHPTDEEVVTHYLTPKAVNNAFSCLVIADVDLNKTEPWDLPGKAKMGEKEWYFFVHKD RKYPTGTRTNRATEKGYWKATGKDKEIFRGKGRDAV LVGMKKTLVFYTGRAPRGDKTPYVMHEYRL)完全相同(圖4)。

虛線方框標(biāo)記部分為NAM超家族域。圖4 預(yù)測蛋白保守域預(yù)測

通過DNAMAN軟件將所克隆小黑麥TwNAC01氨基酸序列與NCBI中已知具有NAC保守結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行多序列比較，發(fā)現(xiàn)TwNAC01氨基酸序列與山羊草中含有NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白XP 020161331同源性達(dá)到了95%以上，且與具有NAC保守域的大麥蛋白CBZ41151、KAE8777325及KAE8777329同源性也達(dá)到83.26%。尤其是在其N端第20～148個(gè)氨基酸之間有著高度一致的NAC保守的氨基酸序列(圖5)，在其C端第175～187、197～239、305～327個(gè)氨基酸分別有AAKNAPPPMAPAA、FLDVDDFLNNPDLLNNADLPMLMDSPSGADDFAGASSSTSS AA、AASSSALLSPSLGFDAGALAGAD 3個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。據(jù)此，可確認(rèn)所克隆基因?yàn)樾『邴淣AC基因,將其命名為TwNAC01,并在GenBank注冊，登錄號為MG736919。

藍(lán)色表示50%相似度，紅色表示75%相似度，黑色表示100%相似度，紅色框部分為保守氨基酸序列，綠色框部分為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。圖5 TwNAC01預(yù)測氨基酸序列比對

2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化

通過MEGA 5.0中的ClustalW比對，采用相鄰連接法(Neighbor-joining,NJ)繪制了小黑麥TwNAC01預(yù)測蛋白與NCBI中相似性較高蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示小黑麥TwNAC01預(yù)測預(yù)測蛋白與山羊草中含有NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白XP020161331同源性最高(圖6)，其次是與大麥中的NAC轉(zhuǎn)錄因子CBZ41151、KAE8777325以及GRAB2 蛋白(KAE8777329)同源性也較高，再次是小麥中的GRAB2蛋白(CAA09372)與粗山羊草中的含有NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白(XP020182284、XP020166616、XP020166615、XP020166614)，同源性再低一點(diǎn)的還有大麥GRAB2蛋白(KAE8782198)以及漸尖二型花(Dichantheliumoligosanthes)含有NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白(OEL23749)以及高粱中的含有NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白(XP002461233),與其同源性最遠(yuǎn)的是小麥中含有NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白(AVG22584)。由此推斷該小黑麥TwNAC01預(yù)測蛋白就是NAC轉(zhuǎn)錄因子。

圖6 TwNAC01預(yù)測蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3.3 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

采用Protparam預(yù)測到該基因的蛋白分子式為C1722H2642N464O522S19，相對分子質(zhì)量為38 805.86，理論等電點(diǎn)為5.44，正/負(fù)電荷殘基總數(shù)分別為46、37，消光系數(shù)46 996，在280 nm波長處吸光度值為1.211。

采用Protparam預(yù)測到該蛋白中含有堿性氨基酸共45個(gè)，其中21個(gè)精氨酸(占6.0%)、16個(gè)賴氨酸(占4.5%)、8個(gè)組氨酸(占2.3%)；包含酸性氨基酸共85個(gè)，其中28個(gè)天冬氨酸(占8.0%)、18個(gè)谷氨酸(占5.1%)、36個(gè)丙氨酸(占10.2%)、3個(gè)半胱氨酸(占0.9%)，故此蛋白為偏中性。同時(shí)預(yù)測到該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為45.06，脂肪指數(shù)為63.27。根據(jù)Guruprasad方法判定該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。利用ExPASy Prot Scale在線預(yù)測該蛋白總平均疏水系數(shù)-0.494，為親水性蛋白(圖7)。

親水、疏水性分別用負(fù)值、正值表示。圖7 TwNAC01預(yù)測蛋白親水/疏水性

2.3.4 跨膜區(qū)和信號肽

利用TMHMM Server和Signal對TwNAC01預(yù)測蛋白的跨膜區(qū)和信號肽特點(diǎn)預(yù)測表明，該蛋白信號肽S值在1～61個(gè)氨基酸之間，預(yù)測值為0.096，其中最大值在第54個(gè)氨基酸，預(yù)測值為0.121，其中剪切位點(diǎn)(C)在第62個(gè)氨基酸，最大值為0.113，綜合剪切位點(diǎn)(Y值)在第62個(gè)氨基酸，最大值為0.107，SP信號肽顯示NO。因此，可推斷該蛋白中不含信號肽，無蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)。TMHMM分析結(jié)果也顯示TwNAC01預(yù)測蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，屬于非膜蛋白及非分泌蛋白。

2.3.5 亞細(xì)胞定位

利用在線軟件TargetP 1.1 Server對小黑麥TwNAC01基因的氨基酸序列亞細(xì)胞定位分析表明(表1)，該序列葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP)分值0.090、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(MTP)分值0.104和信號肽(SP)分值0.171,這些分值均較小，而預(yù)測為其他類型的分值為0.887，目的蛋白的分泌途徑為“_”型，即該蛋白定位在除葉綠體、線粒體、信號肽外的其它細(xì)胞器上。同時(shí)結(jié)合軟件ProtComop分析確定小黑麥TwNAC01蛋白定位在細(xì)胞核中預(yù)測值為8.26、細(xì)胞膜預(yù)測值為1.01、細(xì)胞外預(yù)測值為0.04、線粒體預(yù)測值為0.01、葉綠體預(yù)測值為0.11、液泡預(yù)測值為0.48，可見，定位于細(xì)胞核中的預(yù)測值最高。綜上分析，可斷定該蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中。

表1 亞細(xì)胞定位分值

2.3.6 二級結(jié)構(gòu)

利用SOPMA對小黑麥TwNAC01預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，TwNAC01預(yù)測蛋白中α-螺旋(H)、β-折疊(E)、無規(guī)則卷曲(C)組成分別占12.78%、16.19%、71.03%含量極高，故認(rèn)為該小黑麥NAC蛋白屬于C型(圖8)。

H為α 螺旋(藍(lán)色);E為延伸鏈(紅色);C為無規(guī)則卷曲(黃色)。圖8 TwNAC01基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.7 三級結(jié)構(gòu)

利用SWISS-MODEL對小黑麥TwNAC01蛋白的三級結(jié)構(gòu)模擬顯示，小黑麥TwNAC01蛋白與水稻中NAC1模型3ulx.1.A蛋白一致性達(dá)到52.87%，由空間立體結(jié)構(gòu)可以看出TwNAC01蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲(C)組成，且無規(guī)則卷曲含量高(圖9)。

圖9 小黑麥TwNAC01蛋白三級結(jié)構(gòu)

2.4 TwNAC01表達(dá)特點(diǎn)

為了明確TwNAC01基因在小黑麥不同器官間以及干旱脅迫前后的表達(dá)特點(diǎn)，對開花后22 d時(shí)的干旱脅迫和對照新小黑麥3號的根、莖、旗葉和幼粒中該基因表達(dá)量分別進(jìn)行了檢測。結(jié)果如圖10所示，在干旱脅迫下，小黑麥TwNAC01基因在開花后22 d 時(shí)的根、莖、旗葉以及幼粒的中表達(dá)量均較對照明顯上升，其中在根和幼粒中表達(dá)量較對照呈極顯著上調(diào)表達(dá)；同時(shí)該基因在莖和葉中的表達(dá)量明顯低于根與幼粒?？梢?，小黑麥TwNAC01基因在受到干旱脅迫時(shí)會(huì)顯著上調(diào)。

采用LSD-T法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)結(jié)果；*、**分別表示干旱處理和對照差異在0.05、0.01水平上顯著。圖10 干旱脅迫下TwNAC01基因在小黑麥不同組織器官的表達(dá)量

3 討論

NAC是目前所知的植物所特有、成員數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[14-15,21-22],不但參與花器官發(fā)育、葉片衰老以及植物次生壁合成[16,23],還參與植物應(yīng)對非生物脅迫反應(yīng)[10,21,24]。本研究結(jié)合RNA-seq和RACE技術(shù)克隆了六倍體小黑麥NAC轉(zhuǎn)錄因子基因TwNAC01，在GenBank中注冊為MG736919。該基因編碼區(qū)全長1 059 bp，預(yù)測編碼352個(gè)氨基酸。TwNAC01預(yù)測蛋白的第20～148氨基酸間有1個(gè)由129個(gè)連續(xù)氨基酸組成的NAM亞家族的保守結(jié)構(gòu)域。同時(shí)該基因預(yù)測氨基酸序列與山羊草中包含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白XP020161331(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_020161331)同源性可達(dá)到95%以上，與大麥NAC轉(zhuǎn)錄因子(CBZ41151、KAE8777325以及KAE8777329)同源性達(dá)83%。CBZ41151是大麥中參與植物細(xì)胞次生壁合成、葉片衰老、根系發(fā)育、種子萌發(fā)有關(guān)，同時(shí)受ABA和MeJA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的大麥NAC轉(zhuǎn)錄因子[25]，蛋白KAE8777325是大麥NAC轉(zhuǎn)錄因子(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/KAE8777325)。KAE8777329蛋白大麥中GRAB2蛋白(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/KAE8777329)，與其同源性較高的蛋白CAA09372也是小麥NAC轉(zhuǎn)錄因子(GRAB2)[26]與粗山羊草中的含有NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白(XP020182284(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_020182284)、XP020166616(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_020166616)、XP020166615(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_020166615)、XP020166614(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_020166614))。由此推斷該小黑麥TwNAC01預(yù)測蛋白就是NAC轉(zhuǎn)錄因子。

自首個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因在矮牽牛中被克隆后[27]，關(guān)于NAC基因表達(dá)模式與功能的研究相繼報(bào)道，如小麥NAC基因TaNAC2和TaNAC67過量表達(dá)可明顯提高擬南芥對干旱、鹽和低溫脅迫耐性[28]；過量表達(dá)小麥NAC基因(TaNAC2a、TANAC4a、TaNAC6、TaNAC7、TaNAC13和TaNTL5)能明顯提高煙草對干旱的耐性[29]、在擬南芥中過表達(dá)ATAF1基因后，其植株蒸騰速率降低、耐旱性能提高[30]；過表達(dá)OsNAP的水稻在營養(yǎng)生長期水分損失率更低，對鹽、干旱和低溫脅迫的耐性增強(qiáng)，同時(shí)對外源ABA響應(yīng)敏感性增加[31]。本研究所克隆的小黑麥NAC基因TwNAC01在小黑麥?zhǔn)艿礁珊得{迫后表達(dá)量顯著增強(qiáng)，特別是在根和幼粒中表達(dá)量升高顯著。在本實(shí)驗(yàn)室前期的轉(zhuǎn)錄組測序中也發(fā)現(xiàn)該基因在干旱脅迫后表達(dá)量較對照提高4倍以上。這與研究[29-30,32]發(fā)現(xiàn)NAC基因表達(dá)受干旱誘導(dǎo)明顯升高的結(jié)論相一致。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)該基因在開花后22 d的小黑麥根部表達(dá)量高于旗葉和莖部，這也與小麥基因TaNAC4在根中較葉片和莖中表達(dá)量高的規(guī)律相一致[33]。這表明所克隆的小黑麥基因TwNAC01受干旱脅迫誘導(dǎo)，并在小黑麥響應(yīng)干旱脅迫反應(yīng)中具有重要作用。

通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測到的TwNAC01蛋白定位在細(xì)胞核中。這在我們的后繼研究中也已經(jīng)通過生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證，該蛋白確定定位于煙草表皮細(xì)胞核中。生物信息學(xué)預(yù)測TwNAC01蛋白屬于親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu),與康美玲等[34]研究結(jié)果一致。

NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物對干旱脅迫反應(yīng)中的機(jī)理研究也已有了較大進(jìn)展，這為理解植物抗旱機(jī)制與NAC轉(zhuǎn)錄因子生物功能提供了理論依據(jù)，例如，干旱誘導(dǎo)水稻保衛(wèi)細(xì)胞中NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控OsSRO1c基因的過量表達(dá)，從而促進(jìn)了保衛(wèi)細(xì)胞中H2O2積累、減少完全開放氣孔的數(shù)量[35]、減少可騰水分散失[36]。水稻中SNAC3轉(zhuǎn)錄因子靶基因具有活性氧清除功能，過量表達(dá)SNAC3能增加活性氧清除基因的表達(dá)[37]。此外，NAC蛋白的核心結(jié)合區(qū)還調(diào)控多個(gè)與脅迫相關(guān)的基因，增強(qiáng)植物的耐旱性[38]。這些研究均為TwNAC01轉(zhuǎn)錄因子的具體作用機(jī)理和小黑麥耐旱機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。