趙勝娟，費 鵬，劉麗莉，程玉江

(1.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.洛寧縣市場監(jiān)督管理局，河南 洛陽 471700)

0 引言

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其治療手段主要有手術、放療、化療、靶向治療和免疫治療等，但這些治療方式存在較大的毒副作用以及價格昂貴等問題[1-3]。因此，尋找一種抗癌效果顯著，副作用小且成本低的治療途徑是亟待解決的科學問題。

腫瘤細胞的生長繁殖與細胞的凋亡水平緊密相關，誘導細胞凋亡是防治癌癥的一個重要策略[4]，而天然產(chǎn)物能夠顯著地降低腫瘤細胞的生命活性[5]，因此，越來越多的研究致力于探討不同天然產(chǎn)物對腫瘤細胞的抑制作用。文獻[6]對蔥類蔬菜治療癌癥的前景進行了綜述。文獻[7]研究了青蒿提取物的抗腫瘤活性，并明確了其有效成分。文獻[8]研究了4種伏牛山原生藥用植物的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)其醇提物在體外對食管癌細胞或肝癌細胞具有濃度依賴的生長抑制作用，以70%(體積分數(shù))乙醇提取物活性最強。石榴具有驅蟲、抗菌、抗病毒、預防和治療心腦血管、抗癌等多種藥理作用[9-11]，而這些功效都歸結于石榴中含有豐富多樣的酚類物質。鞣花酸(ellagic acid，EA)是石榴中主要的酚類物質之一，文獻[12-13]研究了石榴皮多酚提取物和其主要活性物質安石榴苷、鞣花酸對肝癌細胞的凋亡誘導，發(fā)現(xiàn)它們能夠通過線粒體通路干預細胞的凋亡，而石榴鞣花酸提取物(ellagic acid extracts from pomegranate，EAEFP)對肺癌細胞的抑制作用及其可能的作用途徑尚未得到清晰的揭示。

本文以A549肺癌細胞為研究對象，分析EAEFP對A549肺癌細胞存活率、細胞形態(tài)、細胞周期和細胞凋亡的作用，以期揭示EAEFP誘導A549肺癌細胞凋亡的可能作用途徑，為石榴的深度加工利用和新型天然抗腫瘤功能性食品的開發(fā)提供一定的理論參考，對充分挖掘石榴的食用及保健價值具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人非小細胞肺癌細胞株A549：河南科技大學食品與生物工程學院細胞室保存；石榴鞣花酸提取物(EAEFP)：西安維特生物科技有限責任公司提供，由石榴皮(產(chǎn)地：陜西臨潼)用100%(體積分數(shù))甲醇提取所得。

四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)：美國Sigma公司；細胞培養(yǎng)基：RPMI-1640，美國Gibco公司；胎牛血清：Gibco 10099-141，美國Gibco|Life Technologies公司；細胞周期檢測試劑盒：Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗儀器

Agilent 1200 Infinity 系列高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)系統(tǒng)：北京安捷倫科技公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：CCL-170B-8型，新加坡ESCO有限公司；普通倒置顯微鏡：OLYMPUS CKX41型，日本OLYMPUS公司；全波長酶標儀：Multiskan GO型，美國熱電公司；生物柜：ESCO AC2-4S1型，新加坡 ESCO有限公司；流式細胞儀：FACSCalibur型，美國BD公司；熒光倒置顯微鏡：Leica DM3000型，上海徠卡儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 石榴鞣花酸提取物HPLC分析

準確稱取0.10 g的EAEFP，溶于甲醇中，配制成質量濃度為1 mg/mL的樣品溶液，用0.22 μm的過濾膜過濾后注入高效液相色譜系統(tǒng)進行成分分析。液相檢測條件：色譜柱 Aglient Zorbax SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，紫外檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，流動相A為1%(質量分數(shù))冰醋酸，流動相B為甲醇，流速1 mL/min。檢測程序：0～70 min(流動相 A:95%～56%(體積分數(shù))，流動相 B:5%～44%(體積分數(shù)))，70～80 min(流動相A：56%，流動相B:44%)[14]。

1.3.2 石榴鞣花酸提取物溶液配制及細胞培養(yǎng)

稱取一定量的EAEFP，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，配制成質量濃度為15 mg/mL的貯存液，避光保存于4 ℃冰箱中備用。試驗時，用無血清培養(yǎng)基把貯存液按2∶3(體積比)稀釋成一系列工作濃度，保證DMSO在終體系中體積分數(shù)不大于1‰。A549肺癌細胞用含10%(質量分數(shù))的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2相對飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 細胞增殖抑制試驗

利用MTT比色法檢測EAEFP對A549肺癌細胞存活率的影響。取對數(shù)生長期的A549肺癌細胞，計數(shù)后調整至適宜種板密度，每孔種板90 μL。過夜培養(yǎng)后，分別加入10 μL不同質量濃度的EAEFP。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，孵育4 h后加入50 μL三聯(lián)液，過夜孵育后用全波長酶標儀檢測570 nm波長處的吸光度，以對照組為100%計算各處理組的細胞活力。各質量濃度的EAEFP設6個平行復孔，為了消除原始細胞對吸光度的影響，不同處理樣品最后的吸光值均減去原始細胞的吸光值。

1.3.4 DAPI染色法分析細胞形態(tài)

取對數(shù)生長期的A549肺癌細胞接種于六孔板，種板密度為1×105mL-1，每孔2 mL，將經(jīng)過多聚賴氨酸包被的無菌玻片放入六孔板中。過夜培養(yǎng)后，加EAEFP繼續(xù)孵育48 h，將上清液棄去，加入4%(質量分數(shù))多聚賴氨酸固定。將固定液去除后，加入DAPI染色液，染色15 min后，用熒光顯微鏡拍照[15]。

1.3.5 細胞周期的檢測

利用流式分析儀分析EAEFP對A549肺癌細胞周期的影響。取對數(shù)生長期的A549肺癌細胞接種于六孔板，種板密度為1×105mL-1，每孔2 mL。過夜培養(yǎng)后，加EAEFP繼續(xù)孵育48 h，離心收集細胞，棄上清液，用預冷磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗細胞2次。加入預冷70%(體積分數(shù))乙醇，于4 ℃固定過夜，或-20 ℃長期固定。離心收集細胞，以1 mL的PBS洗細胞1次，加入500 μL PBS(含50 μg/mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，100 μg/mL RNase A)，4 ℃避光孵育30 min。用流式細胞儀檢測，一般計數(shù)1×104個細胞，結果用細胞周期擬合軟件ModFit進行分析。

1.3.6 細胞凋亡率的檢測

根據(jù)文獻[16]的方法，利用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞儀，檢測EAEFP對A549肺癌細胞的凋亡。按照試劑盒操作說明進行如下操作：將對數(shù)生長期A549肺癌細胞接種于六孔板中，種板密度為1×105mL-1，每孔2 mL。過夜培養(yǎng)后加EAEFP。相同條件下，繼續(xù)孵育48 h，消化收集細胞，用PBS洗2次，加入100 μL 結合緩沖液、5 μL異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記的Annexin-V和1 μL PI，室溫避光30 min。加入400 μL緩沖液，立即用FAC Scan進行流式細胞術定量檢測，以不加Annexin V-FITC及PI作為陰性對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上試驗每組樣品測3個平行樣，所得數(shù)據(jù)用Microsoft Excel數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行處理、制圖，并用DPS軟件進行差異性分析，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 石榴鞣花酸提取物成分鑒定及定量

在前期的研究中，確定了鞣花酸標品HPLC圖譜中最高峰在保留時間65 min左右出現(xiàn)。進而，利用HPLC法分析EAEFP的組成成分，結果如圖1所示。由圖1可知：EAEFP在65 min時出現(xiàn)最大峰，說明EAEFP中鞣花酸占絕大部分，根據(jù)峰面積計算得出此提取物中鞣花酸質量分數(shù)達90.41%，其他物質未確定。

2.2 石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細胞增殖的抑制作用

利用MTT比色法分析EAEFP對A549肺癌細胞存活率的影響，結果如圖2所示。圖2中，圖柱上方不同字母表示差異顯著(P<0.05)。由圖2可知：隨著EAEFP質量濃度的增大，A549肺癌細胞的存活率逐漸降低，呈現(xiàn)較好的劑量效應。當EAEFP質量濃度為0.88 μg/mL時，細胞存活率為83.54%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。當EAEFP質量濃度為15.00 μg/mL 時，細胞存活率僅為35.77%?？梢奅AEFP對A549肺癌細胞的增殖具有良好的抑制作用。

圖1 EAEFP成分HPLC圖

圖2 EAEFP對A549肺癌細胞存活率的影響

2.3 石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細胞形態(tài)的影響

A549肺癌細胞經(jīng)EAEFP處理后，利用DAPI染色法對其進行形態(tài)學分析，結果如圖3所示。圖3a為空白對照組，由圖3a可見：細胞大小均一，輪廓清楚，未見明顯的懸浮細胞。圖3b為3 μg/mL EAEFP處理后的細胞，由圖3b可見：A549肺癌細胞的生長受到顯著的抑制，細胞數(shù)量明顯減少，細胞核出現(xiàn)了一定程度的皺縮，甚至出現(xiàn)了一些細胞碎片。且對細胞的這種破壞隨著EAEFP質量濃度的提高而加劇(見圖3c)。因此，初步推斷EAEFP具有促使A549肺癌細胞形態(tài)異?；淖饔?，從而促進了A549肺癌細胞的凋亡，這一發(fā)現(xiàn)與白花蛇舌草乙醇提取物對A549肺癌細胞的作用途徑相似[17]。

(a) 對照組 (b) 3 μg/mL EAEFP (c) 6 μg/mL EAEFP

圖3 EAEFP對A549肺癌細胞形態(tài)的影響(200倍)

2.4 石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細胞周期的影響

細胞的分裂一般分為3個階段，分別為G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)。為了探究EAEFP對A549細胞增殖的抑制作用是否與其阻滯了細胞周期有關，本文利用流式細胞儀分析EAEFP作用于A549肺癌細胞48 h后，對A549肺癌細胞周期的影響，如圖4所示。

(a) 對照組

(b) 3 μg/mL EAEFP

(c) 6 μg/mL EAEFP

(d) 各時相細胞個數(shù)百分比統(tǒng)計圖

從圖4a～圖4c可以看出：當3 μg/mL和6 μg/mL的EAEFP作用于A549肺癌細胞 48 h后，S期細胞個數(shù)明顯少于對照組，且隨著EAEFP質量濃度的增大，S期細胞個數(shù)越來越少。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果顯示(見圖4d)：EAEFP作用于A549肺癌細胞后，G1期細胞個數(shù)百分比由66.93%增加至81.66%，S期細胞個數(shù)百分比由29.20%降低至15.21%，G2期細胞個數(shù)百分比無明顯變化。這表明EAEFP將A549肺癌細胞阻滯在G1期，抑制A549肺癌細胞進入DNA合成期，影響DNA正常復制，從而抑制了A549肺癌細胞的增殖。

2.5 石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀分析EAEFP對A549肺癌細胞凋亡的影響，結果如圖5所示。圖5a～5c中：橫坐標為熒光探針Annexin V-FITC的信號強度；縱坐標為熒光探針PI的信號強度。圖5a～圖5c為A549肺癌細胞Annexin V/PI染色點陣圖。圖5d為A549肺癌細胞凋亡率統(tǒng)計圖，圖柱上方不同字母表示差異顯著(P<0.05)。從圖5a～圖5c可以看出:當3 μg/mL和6 μg/mL的EAEFP作用于A549肺癌細胞 48 h后，細胞凋亡數(shù)量明顯高于對照組，且有劑量依賴關系。圖5d顯示兩個質量濃度處理組的A549肺癌細胞凋亡率分別為10.41%和17.35%，均顯著高于對照組A549肺癌細胞凋亡率(P<0.05)。表明EAEFP能誘導A549肺癌細胞凋亡并呈劑量依賴性。

(a) 對照組

(b) 3 μg/mL EAEFP

(c) 6 μg/mL EAEFP

(d) 細胞凋亡率統(tǒng)計圖

3 結束語

石榴鞣花酸提取物能顯著抑制A549肺癌細胞的增殖，且在質量濃度為0～15 μg/mL時呈現(xiàn)良好的劑量效應。石榴鞣花酸提取物可以使A549肺癌細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞核發(fā)生皺縮，且隨質量濃度增大，細胞核皺縮更加嚴重。石榴鞣花酸提取物可以干擾A549肺癌細胞生長周期，將細胞阻滯在G1期，抑制細胞DNA正常復制。石榴鞣花酸提取物可以引起A549肺癌細胞凋亡，且呈劑量依賴性。

石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細胞具有良好的凋亡作用，是潛在的抗癌天然物質。文獻[18]指出樹莓鞣花酸對肝癌細胞和肺癌細胞等具有顯著的抑制作用，發(fā)現(xiàn)鞣花酸在癌細胞分裂過程中，鞣花酸組織細胞有絲分裂G0/G1期的轉換，抑制了細胞DNA的合成，從而誘導細胞凋亡，本研究的結果與此基本吻合。文獻[19]研究發(fā)現(xiàn):鞣花酸能夠與姜黃素協(xié)同作用，共同誘導活性氧的產(chǎn)生，使p53蛋白大量累積，誘導了癌細胞的大量凋亡。文獻[20]利用膜透析技術制備鞣花酸的雙載核殼納米粒，優(yōu)化后的顆粒觀察到更高的細胞毒性，可作為乳腺癌治療聯(lián)合用藥。這些文獻均提示鞣花酸對肺癌細胞等癌細胞具有顯著抑制作用。但關于石榴鞣花酸提取物誘導A549肺癌細胞凋亡的研究報道較少，其作用機制和凋亡通路更是缺乏研究。本文明確了石榴鞣花酸提取物對A549肺癌細胞的凋亡作用以及作用機制，可以拓展石榴鞣花酸的應用領域，進一步指導該天然產(chǎn)物在抗癌功能上的應用。