梁華，聞宏妍，朱明雪，李奇瑋，西旺，閆起，王燕，李澤光

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.大連大學(xué)，遼寧 大連 116622；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

《宋·太平惠民和劑局方》卷三方之四君子湯，又名白術(shù)湯，是主治榮衛(wèi)氣虛的經(jīng)典基礎(chǔ)方劑，“補中有瀉，平和中正，不偏不倚”。汪昂《醫(yī)方集解》曰：“以其皆中和之品，故曰君子也。”方中四味藥物皆平和之品，不偏不盛，不熱不燥，補而不峻，益而無害，取“君子致中和”之義，故名“四君子湯”[1]。清代醫(yī)家張璐《傷寒緒論》指出:“氣虛者,補之以甘,參、術(shù)、苓、草,甘溫益胃,有健運之功,具沖和之德,故為君子?！北痉矫玖x故顯于此[2-3]。后世眾多補脾益氣方劑多從此方衍化而來[4]。

代謝組學(xué)技術(shù)有著整體化、微觀化等特點,將代謝組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系研究的基本思想、特點優(yōu)勢結(jié)合[5]。利用組學(xué)技術(shù)為挖掘中醫(yī)藥效能提供新的研究途徑[6]。繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后代謝組學(xué)成為了系統(tǒng)生物學(xué)的另一重要的組成部分[7]，作為新發(fā)展起來的學(xué)科從不同于基因組蛋白組的新角度來觀察生物體的狀態(tài)[8]。本課題組前期已做大量實驗研究，探究經(jīng)典補益劑作用于小鼠增齡過程各階段與衰老相關(guān)的代謝物質(zhì)發(fā)展變化的過程[9-16]。本實驗基于代謝組學(xué)技術(shù)研究四君湯干預(yù)下的16月齡小鼠與衰老相關(guān)的血漿內(nèi)源性小分子代謝物質(zhì)的變化。

1 材料

1.1 動物

選取30只3月齡體質(zhì)量(40±2)g的SPF級ICR雌性小鼠(遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證批號：SCXK(遼)2010-0001)。飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃，濕度 (55±15)%的室內(nèi)，給予固體飼料，自由飲水。

1.2 藥物及湯液制備

茯苓、人參、甘草、白術(shù)中藥飲片采購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，根據(jù)《中華人民共和國藥典》擬定制備方法，四君子湯以質(zhì)量比3∶3∶3∶2將人白茯甘四味中藥混合，浸泡后加水(藥液∶水=1∶8)，煎煮30 min過濾，提取藥液。把所濾得的藥渣與水1：8混合后重復(fù)以上煎煮過濾過程，將2次煎煮的濾液混合。將設(shè)備調(diào)至80 ℃，0.09 MPa，進行減壓濃縮并回收，獲得生藥液后配制為0.33 g/mL的質(zhì)量濃度。

1.3 試劑及儀器

見表1。

2 方法

2.1 實驗分組及給藥

本實驗將30只雌性小鼠隨機分為每組10只的3月齡對照組、16月齡空白組及16月齡給藥組。將3月齡對照組小鼠每日早晨8：00-8：30用0.9%濃度的NaCl溶液灌胃，重復(fù)相同操作持續(xù)30 d，取材后冷藏于-80℃冰箱。其余兩組小鼠，正常飼養(yǎng)到16個月，到16月齡后，16月齡空白組每日早晨8：00—8：30用0.9%濃度的NaCl溶液灌胃。16月齡給藥組用0.33 g/mL藥液灌胃。按照小鼠每6天的體質(zhì)量變化，調(diào)整小鼠給水給藥劑量。

表1 實驗試劑、設(shè)備及生產(chǎn)公司

2.2 樣品的采集、制備

小鼠飼養(yǎng)方法：1～30 d，給藥給水；30 d后，只提供飲水；第31天，采血管中加入肝素鈉，取眼球血靜置于其中6 h，4 ℃下保持3 500 r/min離心5 min，分離出血漿，置于-80 ℃冰箱。取出冷藏后的小鼠血漿，容量比例為每200 μL血漿加入1 mL甲醇，4℃下保持12 000 r/min離心3 min后，靜置15 min抽取上層清液，再一次4 ℃下保持12 000 r/min離心3 min，抽取200 μL上清液進行UPLC-MS分析。

2.3 色譜、質(zhì)譜條件

色譜柱Acquity UPICTM BEH C18(1.7μm,2.1 mm×50 mm)(Waters公司，美國)；柱溫40 ℃；樣品倉溫保持4℃。見表2，3。

表2 UPLC流動相梯度洗脫程序

注：A：0.1%甲酸-乙腈溶液，B：0.1%甲酸-超純水溶液

表3 電噴霧離子源正負(fù)離子模式程序

2.4 多元數(shù)據(jù)分析

結(jié)合Markerlynx V4.1 softwware、ProgenesisQI 2.1 softwware和 EZnifo softwware模塊對3月齡對照組、16月齡空白組及16月齡給藥組小鼠血液代謝輪廓數(shù)據(jù)采用主成分分析和正交偏最小二乘-判別分析法，以VIP(variable importance in the project)值作為參照篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選VIP值>1的物質(zhì)。

2.5 標(biāo)志物的確定

運用QI2.1軟件處理, 利用超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜，通過在線數(shù)據(jù)庫HMDB、KEGG、Metabo Analyst等檢索差異性代謝物及其所參與的代謝通路，探討標(biāo)志物及代謝通路的增齡性變化。

3 結(jié)果

3.1 小鼠血漿代謝輪廓分析

取3月齡對照組、16月齡空白組及16月齡給藥組血漿樣本，按照血漿樣品制備方法處理，利用己建立的UPLC- HDMS分析模式進行對上述血漿樣品正、負(fù)離子模式全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿代謝輪廓出現(xiàn)明顯差異。小鼠血漿代謝物的PCA分析下， X矩陣解釋率R2X>0.4。本實驗樣品在正離子模式負(fù)離子模式下R2X、R2Y值均符合條件，見圖1。

3.2 小鼠血液標(biāo)記物的鑒定

將3月齡對照組、16月齡空白組血液樣本進行正負(fù)離子模式全掃描，并對3月齡對照組、16月齡空白組小鼠血液代謝數(shù)據(jù)進行OPIS-DA分析(R2Y>0.5、Q2>0.5)，得到Score Plot 2D、Score Plot3D、VIP-Plot、S-Plot圖(見圖2，3，4)，從而找到對代謝輪廓變化起關(guān)鍵性作用的內(nèi)源性代謝物。將潛在生物標(biāo)記物篩查條件設(shè)為P<0.05，VIP貢獻(xiàn)值大于1，分析確定內(nèi)源性生物標(biāo)記物。利用UPLC-HDMS檢測標(biāo)記物，在human metabolome database及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes等數(shù)據(jù)庫進行檢索后，結(jié)合Progenesis Q1 2.1 software進行化合物鑒定。篩選出可能與衰老相關(guān)的37個潛在標(biāo)記物(見表4)。

注:A.正離子模式；B.負(fù)離子模式圖1 3月齡對照組、16月齡空白組及16月齡給藥組小鼠血液樣品PCA模式識別分析Score plot圖

注:A1.正離子模式-2D圖；A2.正離子模式-3D圖；B1.負(fù)離子模式-2D圖；B2.負(fù)離子模式-3D圖圖2 3月齡對照組、16月齡空白組雌性小鼠血液樣品PCA分析后的Scores plot圖

表4 正負(fù)離子條件下16月雌鼠血液樣品生物標(biāo)志物(VIP>1)

注：*表示該物質(zhì)VIP值大于2

注：A.正離子模式;B.負(fù)離子模式圖3 16月齡空白組、16月齡給藥組小鼠血液樣品OPLS-DA模式識別分析后VIP散點圖

注:A.正離子模式;B.負(fù)離子模式圖4 16月齡空白組、16月齡給藥組小鼠血液樣品OPLS-DA模式識別分析后S-Plot圖

4 討論

16月齡相較于3月齡雌性小鼠血漿代謝標(biāo)志物有明顯的增齡性變化。在正負(fù)離子模式下通過分析3月齡與16月齡空白組小鼠代謝標(biāo)志物在其體內(nèi)變化情況，確定了代謝標(biāo)志物中12個代謝標(biāo)志物含量在小鼠3月齡時達(dá)到峰值，但隨著小鼠的生長發(fā)育逐漸消耗降低，它們分別參與了氨?；?tRNA的生物合成，生物素代謝，賴氨酸降解，色氨酸代謝等13條代謝途徑；25個代謝標(biāo)志物在小鼠體內(nèi)的含量隨生長發(fā)育積累增加，參與了酪氨酸代謝、嘧啶代謝、甘油磷脂代謝等8條代謝途徑；當(dāng)取VIP值大于1時，鑒定得到的37個與衰老相關(guān)的潛在的生物標(biāo)記物內(nèi)，四君子湯干預(yù)下對16個代謝標(biāo)志物起到了調(diào)節(jié)作用，其中14個具有顯著性意義：Palmitaldehyde，Stearaldehyde，Glycerophosphocholine，12-Hydroxy-12-octadecanoylcarnitine，Behenic acid，4-Fumarylacetoacetic acid，L-Tryptophan，Taurodeoxycholic acid，Lactosylceramide (d18:1/12:0)，Taurochenodeoxycholate-3-sulfate，(23S)-23,25-dihdroxy-24-oxovitamine D3 23-(beta-glucuronide)，13S-hydroxyoctadecadienoic acid，(3a,5b)-24-oxo-24-[(2-sulfoethyl)amino]cholan-3-yl-b-D-Glucopyranosiduronic acid，L-Dihydroorotic acid，5-Methoxytryptophol。他們參與了色氨酸代謝，酪氨酸代謝，嘧啶代謝，不飽和脂肪酸的生物合成，甘油磷脂代謝，鞘脂代謝，亞油酸代謝等多項代謝通路。VIP值篩選大于2時，鑒定得到的15個與衰老相關(guān)的潛在的生物標(biāo)記物，對3個代謝標(biāo)志物起到了調(diào)節(jié)作用(3個都具有顯著性意義)：5-Methoxytryptophol、4-Fumarylacetoacetic acid、Behenic acid。主要參與了酪氨酸代謝。

以上結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)VIP大于2時，四君子湯干預(yù)下回調(diào)的主要功能代謝物是4-富馬酰乙酰乙酸(4-Fumarylacetoacetic acid)，該物質(zhì)所參與的是酪氨酸代謝。酪氨酸是一種非必需氨基酸，與情緒，新陳代謝，治療慢性疲勞等疾病有著密切的聯(lián)系。酪氨酸分解產(chǎn)生4-羥基苯基丙酮酸，4-羥苯基丙酮酸與稱為I型酪氨酸血癥的代謝性疾病有關(guān)。4-羥基苯基丙酮酸是一種潛在的有毒化合物，關(guān)于人類的4-羥基苯基丙酮酸被發(fā)現(xiàn)與多種疾病有關(guān)。4-羥基苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化成高純酸(檸檬酸)，其是計時色素的前體之一。高純酸可以氧化二聚形成河馬豆酸。如果含量足夠高，高純酸可用作骨毒素和腎毒素。骨毒素是導(dǎo)致骨骼或關(guān)節(jié)受損的物質(zhì)，腎臟毒素會損害腎臟。積累的高純酸會損壞軟骨(變時性，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎)和心臟瓣膜，還會沉淀成腎結(jié)石和其他器官的結(jié)石。更具體而言，高純酸可以轉(zhuǎn)化為苯醌乙酸(BQA)，并且所得的BQA可以輕松轉(zhuǎn)化為類似于深色皮膚色素黑色素的聚合物。這些聚合物沉積在膠原(一種結(jié)締組織蛋白，特別是諸如軟骨的組織)中。這個過程被稱為年老癥。卵巢組織變硬，異常脆弱，損害其正常功能并造成損害。4-富馬酰乙酰乙酸是酪氨酸代謝的中間產(chǎn)物之一。富馬酸乙酰乙酸酯水解酶(FAH)是一種催化4-富馬酸乙酰乙酸酯水解為富馬酸酯和乙酰乙酸酯的酶。FAH是酪氨酸分解代謝途徑中的最后一種酶。FAH缺乏與1型遺傳性酪氨酸血癥有關(guān)。在酪氨酸分解代謝至4-富馬酰乙酰乙酸的途徑中產(chǎn)生的4-羥基苯基丙酮酸、高純酸積累后均會對人體產(chǎn)生毒性積累而致病。本實驗觀察到四君子湯干預(yù)調(diào)節(jié)的小鼠體內(nèi)4-富馬酰乙酰乙酸含量較16月齡空白組降低，表明四君子湯產(chǎn)生了有利于機體健康的調(diào)節(jié)作用，減少了酪氨酸代謝過程中產(chǎn)生的毒素積累。

代謝標(biāo)志物L(fēng)-色氨酸(HMDB00929)是一種必需氨基酸，它參與了色氨酸代謝。色氨酸代謝后形成5-羥色胺(5-HT)和犬尿氨酸[17]。犬尿酸、黃尿酸、吲哚乙酸和5-羥吲哚乙酸自尿中排出。血清素(5-HT)是重要的神經(jīng)遞質(zhì)和旁分泌信號分子，已知具有多種生物學(xué)功能。游離L-色氨酸經(jīng)氧化脫羧后轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥色胺, 主要存在于腦組織、特別是在胃腸道內(nèi)[18]，它主要負(fù)責(zé)維持營養(yǎng)吸收和運動[19]。衰老是許多使人衰弱的疾病(包括癌癥和神經(jīng)退行性疾病)的重要危險因素[20]。最近在多種生物中的研究表明色氨酸代謝是與年齡有關(guān)的疾病和壽命的有力調(diào)節(jié)劑。它在整個進化過程中的高度保守性使研究可以開始剖析單個酶和代謝產(chǎn)物的作用[21]。本實驗中，與16月齡對照組相比，16月齡給藥組的L-色氨酸含量明顯回調(diào)，表明四君子湯對小鼠的抗衰具有一定的積極作用。

Behenic acid(HMDB00944)參與了不飽和脂肪酸的生物合成。不飽和脂肪酸對人體的缺乏癥和內(nèi)源性疾病有積極的防治作用[22-23]，促進生長發(fā)育，調(diào)節(jié)刺激生長激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、抗利尿激素、性腺激素的釋放[24]。

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid)有利于防止大鼠動脈粥樣硬化的發(fā)展，通過調(diào)節(jié)組織中脂肪酸的代謝來維持組織中脂肪酸的平衡；當(dāng)CLA少量攝入時，生物體Sod的分子活性增加從而保護機體[25]。

綜上所述，小鼠在自然增齡過程中，體內(nèi)的酪氨酸代謝、色氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成等這些代謝通路發(fā)生了紊亂，在四君子湯的干預(yù)下發(fā)生轉(zhuǎn)歸，揭示了四君子湯對16月齡小鼠血漿內(nèi)源性代謝物質(zhì)的顯著影響。然而，四君子湯中四藥合參相互協(xié)同，基于代謝組學(xué)的研究下，我們可以對機體的調(diào)節(jié)有整體把握，但很難判斷出起決定作用的位點。是否可以找出一個或少數(shù)幾個更小范圍的作用位點，抑或是這種起決定性作用的位點是否存在？此外，我們猜想經(jīng)過四君子湯干預(yù)后的VIP值越大的血漿代謝物是否意味著更有價值？這些問題還需要我們進一步的實驗和探索。