李全,尹洪娜,孫忠人,于楠楠*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

帕金森病(PD)為最為常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響著患者的日常生活能力及生存質(zhì)量[1-3]。目前，藥物治療PD在一定程度上可以控制患者病情、緩解臨床癥狀和延緩疾病進(jìn)程，但長期服用極易出現(xiàn)各種毒副作用以及并發(fā)癥。因此，從毒副作用更小、療效更為顯著的層面探索PD治療新方法迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)旨在基于PI3K/AKT信號(hào)通路，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)角度研究頭針治療PD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇及分組

10～11周齡雄性C57BL/6小鼠50只,體質(zhì)量(20±2)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK(黑)2013004)。置于室溫(20～24 ℃)，自由飲水、取食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始建模。建模成功后，隨機(jī)選擇10只小鼠標(biāo)記為正常組(control group)，其余30只小鼠建模成功后隨機(jī)分為模型組(model group)、針刺組(BMA group)和美多巴組(Madopar group)，每組各10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP,美國Sigma公司)；美多芭 (madopar,上海羅氏制藥有限公司，規(guī)格為0.25 g/片，生產(chǎn)批號(hào)：H10930198)。

1.3 模型制備

MPTP為最常用的PD動(dòng)物模型誘導(dǎo)建模方法[4]，為提高模型存活率，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]，選用慢速模型制模方法，即每日9:00時(shí)對(duì)模型組、針刺組和美多芭組小鼠行MPTP腹腔注射，濃度為3 mg/mL(含有MPTP 0.3 mg)，日1次，連續(xù)7 d。

1.4 干預(yù)方法

實(shí)驗(yàn)第8 d開始(即動(dòng)物模型建立后)，每日上午9:00 AM對(duì)各組小鼠進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)。

針刺組小鼠參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]提供的方法，定位大鼠腧穴，局部脫毛、龍膽紫定標(biāo)，使用0.35 mm×40 mm毫針(貴州安迪醫(yī)療器械有限公司，批號(hào)：20190715)針刺百會(huì)、寧神、舞蹈震顫區(qū)(雙側(cè))及風(fēng)池(雙側(cè))，百會(huì)、寧神施以重復(fù)捻轉(zhuǎn)手法，捻轉(zhuǎn)5 min后休息5 min再施以手法，在留針的30 min內(nèi)反復(fù)進(jìn)行重復(fù)捻轉(zhuǎn)手法共3次，舞蹈震顫區(qū)則連接電針(華佗牌SDZ-II型)，電針刺激頻率10 Hz，電壓1V，每次30 min，日1次連續(xù)14 d。

美多芭組小鼠給予美多芭懸濁液灌胃，12 mg/mL(含有美多巴1.2 mg)，日1次，連續(xù)14 d。

正常組和模型組則不再做任何處理，僅常規(guī)飼養(yǎng)。

1.5 處死及取材

在干預(yù)的第14 d，完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，處死所有存活小鼠，快速剝離中腦和紋狀體，稱重，低溫保存及進(jìn)行標(biāo)本制備。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 行為學(xué)觀察

各組小鼠于實(shí)驗(yàn)建模前5 d每日進(jìn)行分別進(jìn)行爬桿及懸掛行為訓(xùn)練各2次。分別于實(shí)驗(yàn)前1 d(首次注射MPTP前1天)，造模成功后第0 d，干預(yù)第7 d和干預(yù)第14 d的10:00時(shí)進(jìn)行爬桿和懸掛行為學(xué)觀察以檢測(cè)其肢體運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)情況。

1.6.1.1 爬桿實(shí)驗(yàn)

將一直徑為2.5 cm的泡沫塑料小球固定于一根長60 cm、粗1 cm的木桿頂端，木桿外纏裹2層紗布以防打滑，將小鼠放于球頂，分別記錄小鼠爬完桿長的上半部分、下半部分及全桿所需時(shí)間，根據(jù)評(píng)分表進(jìn)行打分，3個(gè)時(shí)間分?jǐn)?shù)總和為被測(cè)小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)最終得分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(分)

1.6.1.2 懸掛實(shí)驗(yàn)

將小鼠雙前肢懸掛于一水平電線上。根據(jù)評(píng)分表進(jìn)行打分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(分)

1.6.2 Western Blot法檢測(cè)PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)

中腦和紋狀體組織勻漿，加入裂解液提取總蛋白后，按( BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒) 進(jìn)行蛋白定量，向每個(gè)樣品管中加 5 μL的4×Loading buffer混勻，煮沸5 min，蛋白于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，加入PI3K、p-Akt (Ser473)(1∶1 000)一抗孵育，4 ℃過夜，PVDF膜在室溫下結(jié)合兔二抗(1∶3 000)2 h，加入ECL顯色，采用Image J軟件進(jìn)行灰度值的分析。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 爬桿實(shí)驗(yàn)得分比較

與空白組實(shí)驗(yàn)前1 d及同時(shí)間點(diǎn)比較，模型組、針刺組及美多芭組小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)分均下降(P<0.05，P<0.01)，表明腹腔注射MPTP后小鼠動(dòng)作協(xié)調(diào)性受到破壞，PD模型建立成功；與模型組比較，針刺組及美多芭組小鼠在接受干預(yù)后爬桿實(shí)驗(yàn)得分均呈增長趨勢(shì)(P<0.05)；而針刺組與美多芭組進(jìn)行比較則無差異(P>0.05)。具體比較結(jié)果見表3。

表3 各組爬桿實(shí)驗(yàn)得分比較分)

注：與空白組實(shí)驗(yàn)前1 d比較，*P<0.05；與空白組同時(shí)間點(diǎn)比較,△P<0.05;與模型組比較，#P<0.05

2.1.2 懸掛實(shí)驗(yàn)得分比較

與空白組實(shí)驗(yàn)前1 d及同時(shí)間點(diǎn)比較，模型組、針刺組及美多芭組小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分均下降(P<0.05，P<0.01)，表明腹腔注射MPTP后小鼠動(dòng)作協(xié)調(diào)性受到破壞，PD模型建立成功；與模型組比較，針刺組及美多芭組小鼠在接受干預(yù)后懸掛實(shí)驗(yàn)得分均呈增長趨勢(shì)(P<0.05)；而針刺組與美多芭組進(jìn)行比較則無差異(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組懸掛實(shí)驗(yàn)得分比較分)

注：與空白組實(shí)驗(yàn)前1 d比較，*P<0.05；與空白組同時(shí)間點(diǎn)比較,△P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

以上行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針刺及美多芭均有輔助PD小鼠動(dòng)作協(xié)調(diào)性恢復(fù)的作用，效果大致相當(dāng)。

2.2 PI3K、p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)

分析圖1 PI3K蛋白條帶可知，PD建模成功后PI3K蛋白表達(dá)均快速上升，經(jīng)針刺及美多芭干預(yù)后PI3K蛋白表達(dá)均有不同程度的下降。分析圖2 p-Akt(Ser473)蛋白條帶可知，PD建模成功后p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)均快速下降，經(jīng)針刺及美多芭干預(yù)后p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)均有不同程度的上升。

圖1 各組PI3K蛋白條帶

圖2 各組p-Akt(Ser473)蛋白條帶

3 討論

PD患者臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、行動(dòng)遲緩及肌強(qiáng)直等運(yùn)動(dòng)障礙癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，選擇性的腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元喪失、紋狀體多巴胺含量顯著減少及黑質(zhì)和藍(lán)斑存在Lewy小體為PD主要病理特征[7]。

PD屬中醫(yī)“顫證”范疇，其病位腦，基本病機(jī)為肝腎陰虛，髓海不足，虛風(fēng)內(nèi)動(dòng)。臨床上頭針在PD治療方面有著較好療效。針刺位于腦部巔頂正中的百會(huì)穴，可以起到調(diào)神健腦、疏通局部經(jīng)絡(luò)氣血的作用[8],有通絡(luò)醒腦、調(diào)神治病之功效[9]；有研究表明[10]，針刺舞蹈震顫區(qū)可改善PD小鼠運(yùn)動(dòng)障礙癥狀，并可明顯減少中腦多巴胺神經(jīng)元的丟失；風(fēng)池熄風(fēng)止顫[11]。諸穴合用，激發(fā)頭部經(jīng)氣，平衡陰陽，調(diào)整全身經(jīng)絡(luò)氣血，進(jìn)而改善全身癥狀?，F(xiàn)代研究亦表明[12]，頭針可以提高黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元含量、減少黑質(zhì)細(xì)胞的凋亡，改善PD引起的運(yùn)動(dòng)癥狀,進(jìn)而延緩病情進(jìn)展,提升患者的生活質(zhì)量。

目前國內(nèi)外較為公認(rèn)的PD建模方法為MPTP誘導(dǎo)法。MPTP作用于C57BL/6品系小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元，進(jìn)而產(chǎn)生毒性作用，因此產(chǎn)生類似于人類PD的典型臨床癥狀，總體表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的下降[13-16]。在研究選用觀察了PD小鼠不同時(shí)期爬桿實(shí)驗(yàn)與懸掛實(shí)驗(yàn)的評(píng)分結(jié)果，以此來從行為學(xué)的角度評(píng)估不同的干預(yù)方法對(duì)PD小鼠運(yùn)動(dòng)遲緩程度及運(yùn)動(dòng)平衡能力的影響情況[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，頭針針刺與美多芭灌胃均可在一定程度上改善PD小鼠運(yùn)動(dòng)遲緩的癥狀、提升其運(yùn)動(dòng)平衡的能力，且兩組效果大致相當(dāng)。

PI3K-AKT是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是目前已知的作用最強(qiáng)、爭議最少的抗凋亡途徑之一。該通路抑制凋亡的關(guān)鍵作用主要體現(xiàn)在通路激活及下游信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)上[18-20]。Akt被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)胞存活的因子，為PI3K的主要靶蛋白之一[21]。Kroner[22]等研究發(fā)現(xiàn)，Akt活性的最終實(shí)現(xiàn)需要Ser473位點(diǎn)的磷酸化，故而很多研究把測(cè)定p-Akt(Ser473)水平作為Akt活化的主要標(biāo)志。本研究中，PD建模成功后PI3K蛋白表達(dá)快速上升，p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)快速下降；經(jīng)針刺及美多芭干預(yù)后PI3K蛋白表達(dá)均有不同程度的下降、p-Akt(Ser473)蛋白表達(dá)均有不同程度的上升。表明頭針針刺可以通過激活PI3K-AKT信號(hào)通路、調(diào)節(jié)PI3K及p-Akt(Ser473)蛋白水平來抗細(xì)胞凋亡，即PI3K表達(dá)水平越低、p-Akt (Ser473) 表達(dá)水平越高，則凋亡細(xì)胞數(shù)越少。

表面看來，在抗細(xì)胞凋亡、改善PD小鼠的運(yùn)動(dòng)遲緩的癥狀、提升其運(yùn)動(dòng)平衡的能力方面，頭針針刺效果與西藥美多芭大致相當(dāng)。但長期服用美多芭不僅費(fèi)用高昂，更會(huì)產(chǎn)生肝腎臟損傷、精神障礙等副作用，比較而言，頭針針刺更為安全可靠，操作可重復(fù)強(qiáng)，值得臨床推廣。