趙瑛,王婕,楊明艷,王冬雪,郇帥

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

近年來，采用中醫(yī)藥防治糖尿病的研究逐漸成為熱點，而動物糖尿病中醫(yī)證候模型的建立是制約其發(fā)展的關(guān)鍵性因素[1]。證候是疾病發(fā)展不同階段病理生理的概括，有動態(tài)性、階段性、個體性等特征，故建立動物中醫(yī)證候模型時應(yīng)引入時間的觀點，動態(tài)觀察模型動物整個疾病發(fā)生發(fā)展的過程[2]。因此本實驗通過連續(xù)10周全面、動態(tài)的監(jiān)測糖尿病大鼠外觀體征和證候相關(guān)實驗室指標的變化，對糖尿病發(fā)展過程中證候特點進行歸納闡述，尋找符合糖尿病發(fā)展過程的中醫(yī)證候模型，旨在為預(yù)防與治療糖尿病提供基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

雄性Wistar大鼠97只，6～8周齡，體質(zhì)量(220±10)g，由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司提供，SPF級，許可證號：SCXK(吉)-2016-0003，合格證號：201700016425。室溫控制在(23±2)℃，實驗動物采用通氣籠飼養(yǎng)，每籠4只，實驗期間可自由攝食飲水。

1.2 實驗試劑

STZ(Sigma公司)；大鼠葡萄糖測定試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)；大鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)試劑盒、大鼠環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)試劑盒、大鼠皮質(zhì)醇試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；游離三碘甲腺原氨酸(FT3)放射免疫分析試劑盒、游離四碘甲腺原氨酸(FT4)放射免疫分析試劑盒(北方生物科技有限公司)。

1.3 實驗設(shè)備

FA1004分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)，GLM-76血糖儀(厚美德生物技術(shù)有限公司)，S8獨立通氣籠(蘇杭科技器材有限公司)，RT-6000酶標分析儀(RAYTO公司)，曠場箱及其軟件(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組及造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按體質(zhì)量隨機分為對照組(n=16)和模型組(n=81)。實驗動物禁食不禁水12 h，模型組大鼠腹腔注射65 mg·kg-1鏈脲佐菌素(STZ)，對照組注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。造模72 h(0 w)后，采用葡萄糖氧化酶法測空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol·L-1的大鼠納入模型組。成模后第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w用血糖儀測定空腹血糖，血糖恢復(fù)的動物剔除。

2.2 中醫(yī)外觀體征的觀察

成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w稱量各組大鼠體質(zhì)量，進行代謝籠測定大鼠12 h食量、水量、尿量，觀察糞便色澤形狀。動態(tài)觀察實驗動物的外觀體征：毛色毛態(tài)(柔順、枯黃、無光澤、豎立、脫毛)，精神狀態(tài)(正常、萎靡)，行為狀態(tài)(正常、少動、瞇眼、拱背)等。對各組大鼠的舌、爪、鼻進行拍照及圖像處理，采用Photoshop 7.0圖像軟件，選取舌、爪、鼻特定區(qū)域定量提取色度R、G、B，進而求出反映紅色程度的C值，C=R/(R+G+B)。

2.3 動物自主活動能力考察

成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w測定各組大鼠自主活動能力。實驗于規(guī)格為100 cm×100 cm×40 cm曠場箱內(nèi)進行。實驗前將所有的大鼠單獨放在曠場箱內(nèi)自由活動5 min，每天2次，連續(xù)2 d，以減輕大鼠對新環(huán)境的焦慮。測試時間為5 min。使用軟件記錄正式實驗被測大鼠5 min總路程和平均速度。

2.4 實驗室指標的測定

成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w，對各組大鼠禁食不禁水12 h，進行眼底靜脈叢采血，采用ELLSA法測定血漿中cAMP、cGMP和皮質(zhì)醇含量，采用放射免疫法測定血漿中FT3和FT4含量。

2.5 中醫(yī)證候表征指標體系

依據(jù)中醫(yī)證候外觀體征及實驗室相關(guān)指標表征中醫(yī)證候的相關(guān)研究，建立中醫(yī)證候表征指標體系。內(nèi)熱偏盛：食量、飲水量增加、自主活動增多、大便干結(jié)、舌紅；氣虛：精神狀態(tài)萎靡、自主活動減少；陰虛：體質(zhì)量降低、毛色枯黃無光澤、便干、飲水量增加、舌紅、cAMP/cGMP增加；陽虛：尿量增多、大便不調(diào)、瞇眼、拱背、爪和鼻色淡、FT3和FT4含量降低、皮質(zhì)醇含量增加。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 實驗結(jié)果

3.1 空腹血糖的動態(tài)變化

本次實驗以造模72 h(0 w)空腹血糖≥16.7 mmol·L-1為標準，有63只大鼠成模，成模率為77.8%。DM大鼠血糖成模后第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w顯著高于對照組(P<0.01)，且各周之間無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖(FBG)水平比較

注：與對照組相比，**P<0.01

表2 大鼠不同階段階段食量、飲水量、尿量

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

3.2 動物外觀體征變化

DM大鼠在成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w食量、飲水量、尿量均顯著高于對照組(P<0.05)，且DM大鼠成模第0 w飲水量最多，第3 w后開始回落并趨于穩(wěn)定，見表2。DM大鼠體質(zhì)量在造模后第0 w到10 w顯著低于對照組(P<0.01)，結(jié)果見表3。

對照組外觀體征從始至終均無明顯變化。DM大鼠成模第1 w出現(xiàn)拱背和少動遲緩的癥狀，并持續(xù)增加；第2 w少部分出現(xiàn)瞇眼現(xiàn)象，但無明顯增多趨勢；第3 w開始出現(xiàn)精神萎靡、毛色枯黃無光澤、毛態(tài)豎立、大便干燥呈黑色；第4 w開始出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象；第5 w所有DM大鼠均出現(xiàn)大便干稀不調(diào)呈黃色和精神萎靡的癥狀。

表3 各組大鼠不同階段體質(zhì)量

注：與對照組相比，**P<0.01

與對照組相比，DM大鼠成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w鼻色紅色程度C值均顯著降低(P<0.01)；與自身0 w比較，DM大鼠5 w和10 w鼻色紅色程度C值顯著降低(P<0.05)。DM大鼠在成模10 w舌色紅色程度C值顯著低于對照組(P<0.01)。在成模各周，對照組與DM組大鼠爪色紅色程度C值均無顯著差異(P>0.05)，結(jié)果見表4。

表4 鼻色、舌色和爪色紅色程度C值分析

注：與對照組相比，**P<0.01；與0 w相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與3 w相比，●●P<0.01；與4 w相比，△△P<0.01

3.3 動物自主活動能力變化

與對照組相比，DM大鼠5 min運動路程和平均速度在成模第0 w、3 w、4 w、5 w、10 w均顯著降低(P<0.01)；與自身0 w相比，DM大鼠DM大鼠5 min運動路程和平均速度在成模第4 w、5 w、10 w顯著降低(P<0.05)，見表5。表明DM大鼠成模在0 w自主活動能力開始明顯降低，且持續(xù)至實驗結(jié)束。

表5 各組大鼠5 min運動路程和運動平均速度

注：與對照組相比，**P<0.01；與0 w相比▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.4 實驗室指標的變化

與對照組相比，DM大鼠在成模第0 w、3 w、4 w、5 w和10 w血漿FT3和FT4濃度顯著性降低(P<0.05)；與自身0 w相比，DM大鼠第5 w開始血漿FT3和FT4濃度顯著性降低(P<0.05)。與對照組相比，DM大鼠在成模4 w、5 w、10 w皮質(zhì)醇濃度均明顯升高(P<0.01)，見表6。

兩組大鼠的cAMP和cGMP濃度均無顯著性差異(P>0.05)；與對照組相比，DM大鼠成模第3 w、4 w、5 w、10 w的cAMP/cGMP顯著性升高(P<0.01)，與自身3 w相比，DM大鼠成模第4 w、5 w、10 w的cAMP/cGMP顯著性升高(P<0.01)，見表7。

表6 各組大鼠血漿FT3、FT4和皮質(zhì)醇濃度變化

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與0 w相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與3 w相比，●P<0.05，●●P<0.01；與4 w相比，△P<0.05，△△P<0.01

表7 各組大鼠血漿cAMP、cGMP濃度和cAMP/cGMP比值變化

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與0 w相比，▲▲P<0.01；與3 w相比，●●P<0.01；與4 w相比，△△P<0.01；與5 w相比，##P<0.01

3.5 中醫(yī)證候表征變化

根據(jù)上述實驗數(shù)據(jù)分析歸類，糖尿病大鼠在造模0 w符合內(nèi)熱偏盛的證候特點，兼有陽氣不足的表現(xiàn)持續(xù)至實驗結(jié)束；3 w符合內(nèi)熱偏盛、陰虛、氣虛的證候特點；4 w符合陰虛、氣虛、陽虛的證候特點；5 w符合陰虛、氣虛、陽虛的證候特點；10 w符合陰虛、陽虛的證候特點。見表8。

表8 各時間點糖尿大鼠證候表征特點

4 討論

辨證施治是中醫(yī)學(xué)的重要特點之一。而目前很多疾病的中醫(yī)藥防治研究及某一治則的實驗研究都是建立在疾病動物模型的基礎(chǔ)上開展的，完全脫離了辨證論治的基本思想。究其原因，很重要的一點就是目前缺乏與之相適應(yīng)的中醫(yī)證的動物模型，且目前已有的一些中醫(yī)證或病證結(jié)合模型多是通過物理、化學(xué)、機械等因素誘導(dǎo)下模擬，與生物體自身或在某種疾病狀態(tài)下的自然演變差異較大[3]。鑒于此本文采用經(jīng)典的STZ誘導(dǎo)建立大鼠1型DM模型，構(gòu)建中醫(yī)外觀體征結(jié)合中醫(yī)證候相關(guān)實驗室指標共表征的方法，通過描述1型DM大鼠中醫(yī)證候的經(jīng)時自然演變過程，已期為中醫(yī)證候模型的研究提供一種思路，并為DM的中醫(yī)藥辨證用藥研究提供一種方便可行的證候模型。

糖尿病在中醫(yī)范疇屬“消渴病”，燥熱偏盛-氣陰兩虛-陰陽兩虛是其基本病機及演變規(guī)律[4]。按照相同相似病理原則，臨床四診信息可以體現(xiàn)在大鼠動物模型上。通過觀察糖尿病大鼠的形體、毛色毛態(tài)、二便情況、自主活動能力、精神狀況和鼻舌爪的顏色等外觀體征，推測實驗動物的基本生命狀態(tài)、營養(yǎng)情況、氣血的盛衰等情況，進而判斷糖尿病大鼠證候特點[5]。臨床上糖尿病患者容易發(fā)生甲狀腺功能異常，尤其易發(fā)生甲狀腺功能減退[6]。FT3和FT4作為“下丘腦-垂體-靶腺軸”終端產(chǎn)物，由甲狀腺分泌，其含量變化可反映甲狀腺軸功能，且腎陽虛的病機學(xué)中甲減起很重要的作用[7-8]，推測FT3和FT4可能作為表征陽虛證型的一項指標。cAMP，cGMP作為第二信使，是整體性調(diào)節(jié)機制影響細胞功能的中間樞紐[9]。1986年美國生物學(xué)家Hynie認為cAMP與cGMP是體內(nèi)兩種對立的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可能是中醫(yī)陰陽理論的物質(zhì)基礎(chǔ)[10]。有研究表明[11]，血漿cAMP、cGMP含量的改變與陰虛、陽虛證密切相關(guān)，即陰虛cAMP占優(yōu)勢，陽虛cGMP占優(yōu)勢。皮質(zhì)醇是糖皮質(zhì)激素的主要成分，是對糖類代謝具有最強作用的腎上腺皮質(zhì)激素。研究發(fā)現(xiàn)[12]，DM腎病患者出現(xiàn)“陽虛”證與腎上腺皮質(zhì)激素有著密切的關(guān)系。

本實驗結(jié)果顯示，在成模10 w內(nèi)，模型組大鼠除個別血糖會出現(xiàn)波動，總體維持高血糖(血糖≥16.7 mmol·L-1)、多飲、多食、多尿和體重減少的狀態(tài)，可以看出本實驗所建立的糖尿病模型比較穩(wěn)定。DM大鼠在成模0w即出現(xiàn)自主活動能力、鼻色紅色程度C值、血漿FT3和FT4含量顯著下降的現(xiàn)象，且持續(xù)至實驗結(jié)束，符合陽氣不足的證候特點。糖尿病大鼠成模即表現(xiàn)出陽氣不足的現(xiàn)象未見文獻報導(dǎo)，故推測其原因是采用一次性大劑量注射STZ造模損傷機體陽氣。

本實驗DM大鼠在成模0 w食量和飲水量較對照組顯著升高，符合內(nèi)熱偏盛的證候特點，糖尿病大鼠在成模0 w以內(nèi)熱偏盛為主，兼有陽氣不足。DM大鼠在成模3 w出現(xiàn)毛色枯黃無光澤，血漿cAMP/cGMP較對照組顯著升高，符合陰虛的證候特點；出現(xiàn)精神萎靡的現(xiàn)象符合氣虛的證候特點；出現(xiàn)大便干結(jié)符合內(nèi)熱偏盛的證候特點，綜合分析糖尿病大鼠在成模3 w開始由內(nèi)熱偏盛向氣陰兩虛過渡發(fā)展。在成模4 w自主活動能力較自身0 w比較顯著降低，符合氣虛的證候特點；血漿皮質(zhì)醇含量顯著升高，符合陽虛的證候特點，綜合分析糖尿病大鼠在成模3 w以氣陰兩虛為主，兼有陽虛證型。DM大鼠在成模5 w 出現(xiàn)均精神萎靡的現(xiàn)象，符合氣虛的證候特點；DM大鼠均出現(xiàn)大便干稀不調(diào)，且與自身0 w比較，鼻色紅色程度C值和血漿FT4含量顯著降低，與自身4 w比較，血漿皮質(zhì)醇含量顯著上升，表明陽虛的證候特點加重，綜合分析糖尿病大鼠在成模5 w在氣陰兩虛基礎(chǔ)上陽虛的證候特點的加重。在前面基礎(chǔ)上，在成模10 w血漿cAMP/cGMP較自身3 w顯著升高，符合陰虛的證候特點，綜合分析糖尿病大鼠在成模10 w表現(xiàn)為陰陽兩虛。

以65 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素所建立的糖尿病大鼠10 w內(nèi)模型穩(wěn)定；早期以內(nèi)熱偏盛為主，STZ可損傷機體陽氣，故兼有輕度陽虛表現(xiàn)，且貫穿始終。3～5 w出現(xiàn)氣陰兩虛的表現(xiàn)，10 w表現(xiàn)為陰陽兩虛。