牛宇敏，王 彬，楊潤(rùn)暉，段鶴君，張 晶，邵 兵*

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心，北京 100123；3.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

雙酚A(BPA)是全球產(chǎn)量最大的化合物之一，被廣泛用于生產(chǎn)環(huán)氧樹(shù)脂和聚碳酸酯塑料[1]。然而，長(zhǎng)期暴露于低劑量BPA，可能會(huì)引起人類(lèi)的一些代謝性疾病，如肥胖、Ⅱ型糖尿病等[2-3]?？紤]到BPA的潛在風(fēng)險(xiǎn)，中國(guó)等國(guó)家相繼禁止在兒童容器中添加BPA[4]。歐洲食品安全局(EFSA)在2015年對(duì)BPA進(jìn)行了全面評(píng)估，將推薦的每日容許攝入量(TDI)由50 μg/kg bw/day降至4 μg/kg bw/day[4]。隨著B(niǎo)PA的限用，一些廠家陸續(xù)推出了BPA的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物用于替代BPA。雙酚S(BPS)、雙酚F(BPF)、雙酚AF(BPAF)等已被用于工業(yè)和日常生活用品[5-7]。四氯雙酚A(TCBPA)和四溴雙酚A(TBBPA)等BPA的鹵代衍生物被廣泛用作阻燃劑[8]。此外，在飲用水氯化消毒過(guò)程中BPA和BPF會(huì)生成相應(yīng)的氯化產(chǎn)物[9-10]。本文將BPA結(jié)構(gòu)類(lèi)似物及其鹵代產(chǎn)物統(tǒng)稱(chēng)為雙酚類(lèi)化合物(BPs)。由于具有相似的結(jié)構(gòu)，新興BPs表現(xiàn)出與BPA類(lèi)似或更強(qiáng)的毒性[11-13]。

隨著B(niǎo)PA類(lèi)似物的使用逐漸增加，目前已在環(huán)境、食品以及管網(wǎng)水中檢測(cè)到這類(lèi)物質(zhì)的廣泛存在[3]，人體生物樣本(如血清、尿液、血漿、母乳、脂肪組織、胎盤(pán)和唾液)中亦檢測(cè)到1種或幾種BPs[9]，表明人類(lèi)廣泛暴露于這類(lèi)物質(zhì)。然而，目前的檢測(cè)方法集中在BPA及其氯代衍生物和少量的BPA結(jié)構(gòu)類(lèi)似物[14-19]。一方面考慮到BPs的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)存在差異，現(xiàn)有的檢測(cè)方法不適用于目前新興BPs的檢測(cè)需求。另一方面，現(xiàn)有檢測(cè)方法的樣品用量大，方法復(fù)雜，靈敏度低[18-19]，不能滿(mǎn)足大量生物樣品中BPs的監(jiān)測(cè)需求。因此有必要建立一種高靈敏的檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)生物基質(zhì)中BPs的高通量檢測(cè)需求。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用吡啶-3-磺酰氯對(duì)BPs進(jìn)行衍生，可以極大提高方法的靈敏度和選擇性[20]。因此本文選擇23種目前已報(bào)道的BPs為目標(biāo)物，采用液液萃取和簡(jiǎn)單通過(guò)式固相萃取等前處理方法，利用吡啶-3-磺酰氯衍生化試劑對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行衍生，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)實(shí)現(xiàn)了尿液和血清中BPs的高通量和痕量檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ-XS三重四極桿質(zhì)譜儀、ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm× 100 mm，1.7 μm)色譜柱(美國(guó)Waters公司);Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)；Vortex-Genin 2渦旋振蕩器(美國(guó)Scientific Industries公司)；N-EVAP-116氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)。

Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL，美國(guó)Waters公司)；Agilent Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid分散固相萃取填料(美國(guó)Agilent Technologies公司)。吡啶-3-磺酰氯(純度> 98%，日本Tokyo Chemical Industry公司)。超純水、甲醇和乙腈(LC-MS級(jí)，美國(guó)Sigma Aldrich公司)；正己烷、丙酮、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚(HPLC級(jí)，美國(guó)Dikma公司)；甲酸、乙酸(純度99%，美國(guó)Across公司)；碳酸氫鈉(ACS級(jí))、氫氧化鈉(98.5%)和醋酸鈉(98%)均購(gòu)于百靈威科技有限公司；β-葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶混合物(從Helix pomatia提取)購(gòu)于德國(guó)Roche Diagnostics公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：BPA(>98.5%)、BPB(>98%)、BPF(>99%)、BPS(>98%)、BPAF(>98%)、TCBPA(>98%)和TBBPA(>98%)購(gòu)于日本Tokyo Chemical Industry公司；BPC(≥99%)、BPE(≥98%)、BPM(≥99%)、BPP(≥99%)、BPZ(≥99%)、BPAP(≥99%)、BPBP(≥98%)、BPFL(≥99%)和DHDPE(≥99%)均購(gòu)于美國(guó)Sigma Aldrich公司；MCBPA(98%)、DCBPA(98%)和TriCBPA(98%)均購(gòu)于加拿大Toronto Research Chemicals公司；MCBPF、DCBPF、TriCBPF和TCBPF由本實(shí)驗(yàn)室合成，純度均在98%以上[9]。同位素內(nèi)標(biāo)：BPA-13C12、BPB-13C12、BPF-13C12(99%，100 μg/mL，溶于乙腈)，BPS-13C12(98%，100 μg/mL，溶于甲醇)，BPAF-d4(98%)固體，TCBPA-13C12(99%，50 μg/mL，溶于甲醇)和TBBPA-13C12(99%，50 μg/mL，溶于甲醇)均購(gòu)于美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并分別定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存。

內(nèi)標(biāo)工作混合液：分別準(zhǔn)確吸取一定量的同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的內(nèi)標(biāo)混合溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將?nèi)標(biāo)混合溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度為2 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作混合液。

1.3 儀器條件

儀器條件參照前期優(yōu)化結(jié)果[20]。色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：10.0 μL；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣器溫度：10 ℃；流動(dòng)相：A為乙腈，B為 0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序?yàn)椋?～0.5 min，40%A；0.5～2 min，40%～90%A；2～5 min，90%～95%A；5～6 min，95%～99%A；6～9 min，保持99%A；9～9.1 min，99%～40%A；9.1～11 min，40%A。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離源，正離子模式(ESI+)；定量檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；毛細(xì)管電壓：2.5 kV，錐孔電壓：30 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：450 ℃；脫溶劑氣流速：900 L/h；碰撞氣流速：0.12 mL/min。目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 23種雙酚類(lèi)化合物及內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 23 BPs and the internal standards

*quantitative ion

1.4 樣品采集

為避免污染，尿液樣品收集于預(yù)先洗滌的棕色玻璃樣品瓶，血清樣品收集于5 mL含肝素的采血管中，靜置離心后取上層血清。樣品在分析前置于-80 ℃儲(chǔ)存。該研究經(jīng)北京市疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有受試者均被告知研究目的和意義，并簽署同意書(shū)。

1.5 樣品前處理

尿液樣品：取不少于10 mL尿液樣品，離心，準(zhǔn)確吸取上清液200 μL，加入50 μL內(nèi)標(biāo)工作混合溶液后，再加入200 μL乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.3)和10 μLβ-葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶混合，37 ℃水浴酶解12 h。取出冷卻至室溫后，混合液用800 μL乙酸乙酯萃取2次，合并上清液，在溫和的氮?dú)庀麓抵两?，待衍生?/p>

血清樣品：解凍后渦旋混勻，準(zhǔn)確吸取200 μL血清樣品，加入50 μL內(nèi)標(biāo)工作混合溶液后，再加入200 μL乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.3)和10 μLβ-葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶混合，37 ℃下酶解12 h后，取出冷卻至室溫后，加入1.2 mL乙腈超聲提取20 min，14 000 r/min離心10 min，上清液通過(guò)PRiME HLB柱(60 mg/3 mL)后，用1 mL乙腈洗脫固相萃取小柱，合并2次過(guò)柱液，在溫和的氮?dú)庀麓抵两桑苌?/p>

衍生條件：上述混合液干燥后用200 μL碳酸氫鈉緩沖液(100 mmol/L，pH 10.5)溶解殘?jiān)偌尤?00 μL吡啶-3-磺酰氯(5 mg/mL，溶于丙酮)，渦旋1 min，60 ℃下衍生5 min。冷卻至室溫后，將反應(yīng)混合物用400 μL正己烷萃取2次，合并正己烷層，氮吹至近干，以100 μL乙腈-水(50∶50，體積比)復(fù)溶，待LC-MS/MS分析。

圖1 不同提取溶劑對(duì)尿液中23種BPs的回收率(n=3)Fig.1 Recoveries of 23 BPs in urine samples with different extraction solvents(n=3)A：methyl tert-butyl ether;B：ethyl acetate；C.n-hexane

圖2 不同凈化方式下血清中23種BPs的回收率(n=3)Fig.2 Recoveries of 23 BPs in serum using different purification methods(n=3)A：Bond EMR-Lipid dSPE purification;B：PRiME HLB SPE purification;C：PRiME HLB cartridge eluted by 1 mL acetonitrile

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

23種BPs包括BPA、14種BPA類(lèi)似物及8種鹵代產(chǎn)物，它們結(jié)構(gòu)類(lèi)似，具有2個(gè)苯酚官能團(tuán)，因此均可與吡啶-3-磺酰氯發(fā)生磺酰化反應(yīng)。由于取代基的不同，這些BPs的極性范圍分布寬(logKow1.65～6.08)[20]。因此對(duì)于尿液樣品，比較了甲基叔丁基醚、乙酸乙酯和正己烷3種不同極性提取溶劑的效果(見(jiàn)圖1)。結(jié)果顯示，采用乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，除BPS的回收率為65.3%外，其他BPs的回收率為93.4%～110%。當(dāng)采用極性更強(qiáng)的甲基叔丁基醚時(shí)，BPS的回收率達(dá)96.8%，但其他化合物，尤其是疏水性較強(qiáng)的化合物回收率明顯下降。當(dāng)采用正己烷為提取溶劑時(shí)，疏水性較強(qiáng)的化合物(如BPC、BPM、BPP、DCBPA、TriCBPA、TCBPA、TBBPA)回收率較高，但親水性較強(qiáng)的化合物(如BPS、DHDPE、BPF和BPA)的回收率僅為0.09%～13.7%，遠(yuǎn)達(dá)不到檢測(cè)要求，因此選擇乙酸乙酯作為提取溶劑?？紤]到基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物離子化程度的影響，以目標(biāo)物在樣品基質(zhì)中的響應(yīng)與在純?nèi)軇┲许憫?yīng)的百分比為基質(zhì)效應(yīng)，進(jìn)一步對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。經(jīng)后續(xù)衍生化反應(yīng)后，所有化合物的基質(zhì)效應(yīng)為56.5%～128.2%，可以滿(mǎn)足分析要求。

對(duì)于血清樣品，脂肪和蛋白質(zhì)是最主要的干擾物質(zhì)。乙腈作為最常用的提取溶劑，可有效去除蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血清樣品經(jīng)乙腈去除蛋白后，目標(biāo)物仍有很強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)(3.30%～55.8%)，需進(jìn)一步凈化去除多余脂肪。比較了兩種去除脂肪的商品化材料PRiME HLB固相萃取柱和Bond EMR-Lipid分散固相萃取填料的凈化效果。具體操作分別為：乙腈提取液直接通過(guò)PRiME HLB固相萃取柱，流出液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊螅凑毡疚难苌椒ㄟM(jìn)行衍生；乙腈提取液中加入200 mg Bond EMR-Lipid填料(預(yù)先加入5 mL水活化)，渦旋混勻，離心后上清液用200 mg Bond EMR-Lipid反萃包進(jìn)行反萃取，上清液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，按照本文衍生方法進(jìn)行衍生。由圖2可知，采用Bond EMR-Lipid分散固相萃取時(shí)，方法的回收率為78.5%～121%。采用PRiME HLB固相萃取柱凈化時(shí)，回收率為51.0%～112%，其中疏水性較強(qiáng)的化合物(如BPM、BPP、BPBP、BPFL、TCBPA和TBBPA)回收率較低，僅有51.0%～88.9%，推測(cè)是由于這些化合物在固相萃取柱的保留較強(qiáng)所致。嘗試采用PRiME HLB固相萃取柱凈化后再用1 mL乙腈進(jìn)一步洗脫，23種化合物的回收率均提高到90%以上。采用Bond EMR-Lipid分散固相萃取柱和經(jīng)改善的PRiME HLB固相萃取柱凈化時(shí)，兩種方法的回收率無(wú)明顯差異?；|(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，采用經(jīng)改善的PRiME HLB固相萃取柱凈化后，除DHDPE外，其余BPs的基質(zhì)效應(yīng)均在84.7%～110.8%之間，明顯優(yōu)于Bond EMR-Lipid分散固相萃取柱(63.9%～106.0%)。此外，PRiME HLB固相萃取柱更易操作，因此最終選擇PRiME HLB固相萃取柱對(duì)血清樣品進(jìn)行凈化，并使用1 mL乙腈進(jìn)一步洗脫。圖3為尿液加標(biāo)樣品中23種BPs的MRM譜圖。

圖3 尿液加標(biāo)樣品(0.5 μg/L)中23種BPs的MRM譜圖Fig.3 MRM chromatograms of 23 BPs in urine sample spiked with 0.5 μg/L

2.2 方法確證

2.2.1 靈敏度以檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)表示方法靈敏度，在實(shí)際樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品，以定量離子信噪比(S/N)為3和10的質(zhì)量濃度分別確定方法的LOD和LOQ。結(jié)果顯示，方法的LOD為0.002～0.030 μg/L，LOQ為0.005～0.100 μg/L(表2)。

2.2.2 線性范圍對(duì)于有同位素內(nèi)標(biāo)的化合物(BPA、BPB、BPF、BPS、BPAF、TCBPA和TBBPA)，采用對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量；對(duì)于無(wú)同位素內(nèi)標(biāo)的化合物，采用化學(xué)結(jié)構(gòu)、回收率和基質(zhì)效應(yīng)均相近的化合物的同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，如BPC以BPB-13C12作為內(nèi)標(biāo)，BPE、DHDPE、MCBPF、DCBPF、TriCBPF和TCBPF以BPF-13C12作為內(nèi)標(biāo)，MCBPA和DCBPA以BPA-13C12作為內(nèi)標(biāo)，TriCBPA以TCBPA-13C12作為內(nèi)標(biāo)；對(duì)于化學(xué)結(jié)構(gòu)差異相對(duì)較大的化合物(如BPM/BPP、BPZ、BPAP、BPBP和BPFL)，由于其回收率和基質(zhì)效應(yīng)與BPA相似，以BPA-13C12作為內(nèi)標(biāo)。除了血清中DHDPE采用基質(zhì)匹配曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量，尿液和血清中其余化合物均采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。結(jié)果表明，23種待測(cè)物在0.005～100 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.99。

2.2.3 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差選擇空白尿液和血清樣品，分別在LOQ、2LOQ和10LOQ 3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平6個(gè)平行，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)作為日內(nèi)精密度。選擇2LOQ加標(biāo)水平進(jìn)行5 d日間精密度測(cè)定，回收率和RSD如表2所示。對(duì)于尿液樣品，方法的回收率為82.9%～122%，日內(nèi)RSD為0.60%～12%，日間RSD為0.90%～11%；對(duì)于血清樣品，方法的回收率為76.6%～118%，日內(nèi)RSD為0.60%～14%，日間RSD為1.4%～14%。

表2 23種BPs的檢出限、定量下限、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 LODs,LOQs,recoveries and RSDs of 23 BPs

*the method cannot distinguish BPM and BPP(本方法無(wú)法區(qū)分BPM和BPP)

2.3 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)北京市20名中小學(xué)生尿液以及20名孕婦血清樣品中的23種BPs進(jìn)行檢測(cè)。在尿液樣品中檢出BPA、BPB、BPE、BPF、BPS和MCBPA，其中BPA、BPF和BPS的檢出率均為100%，質(zhì)量濃度分別為0.450～7.199 μg/L、 0.046～1.483 μg/L和0.176～1.836 μg/L，平均值分別為2.115、0.268、0.708 μg/L，BPA是最主要的BPs。在血清樣品中，BPA的檢出率最高(為70%)，質(zhì)量濃度為0.050～0.399 μg/L;此外還檢出BPF、BPAF和TBBPA，檢出率均為10%，質(zhì)量濃度分別為0.010～0.015 μg/L、0.030～0.060 μg/L和0.193～0.198 μg/L。血清樣品中未檢出BPS，可能是由于BPS的極性較強(qiáng)，更易經(jīng)尿液排出體外。

3 結(jié) 論

本研究分別建立了尿液和血清中23種BPs的高通量檢測(cè)方法。尿液樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，血清樣品經(jīng)乙腈提取、PRiME HLB固相萃取柱凈化后，均經(jīng)吡啶-3-磺酰氯衍生后用UPLC-MS/MS測(cè)定。本方法樣品用量少、靈敏度高，可滿(mǎn)足尿液和血清中痕量BPs的檢測(cè)要求。