鄭小惲 龔一富 李申睿 方清姝 王何瑜 唐道軍

(1寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315832；2寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315832)

巖藻黃素(fucoxanthin)是一種在藻類(lèi)中普遍存在的類(lèi)胡蘿卜素。 研究表明，巖藻黃素具有多種促進(jìn)健康的功能，如抗氧化[1]、抗肥胖[2]、抗糖尿病[3]、降血壓[4]和抗癌[5]等。 其中，巖藻黃素的抗氧化特性被認(rèn)為是發(fā)揮作用的主要原因[6]。 三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)屬于硅藻門(mén)(Bacillariophyta)，是研究硅藻的模式藻類(lèi)之一。 研究表明，三角褐指藻含有一定量的巖藻黃素，具有生長(zhǎng)繁殖速度快、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)[7]。 硅藻是光合自養(yǎng)型生物，它們每年通過(guò)光合作用可為地球制造約20%的原初生產(chǎn)力[8]，這與硅藻細(xì)胞內(nèi)含有的捕光復(fù)合物巖藻黃素與葉綠素a/c 結(jié)合蛋白(fucoxanthin Chl a/c binding proteins，F(xiàn)CPs)密不可分。 FCPs 能夠吸收藍(lán)綠區(qū)域中的光線，較好地進(jìn)行光吸收和光傳遞[9]，在光合作用通路中發(fā)揮重要作用。 巖藻黃素與光合作用色素葉綠素a 和葉綠素c 結(jié)合形成FCPs，這是否表明巖藻黃素含量與光合作用相關(guān)? 是否能明確光合作用的增減會(huì)影響巖藻黃素含量? 尚未明確。 因此，探明兩者之間的相關(guān)性更有利于探明巖藻黃素生物合成的調(diào)控機(jī)理。

二氯苯基二甲脲(DCMU)，又名敵草隆，是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的人工合成的光合作用抑制劑[10]。它可以結(jié)合到光系統(tǒng)Ⅱ(photosystemⅡ，PSⅡ)反應(yīng)中心QB的結(jié)合位點(diǎn)上，影響電子從QA傳遞到QB，從而阻斷質(zhì)體醌與PSⅡ之間的電子傳遞，使光合作用無(wú)法正常進(jìn)行[11]。 DCMU 作為除草劑在農(nóng)業(yè)上已有較為廣泛的運(yùn)用，但其會(huì)殘留在土壤中破壞植物的光合作用[12]，而且會(huì)流入水體造成危害[13]，浮游生物首受其害[14]。 但DCMU 是否抑制三角褐指藻的光合作用，進(jìn)而影響三角褐指藻巖藻黃素的含量，目前還鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究采用不同濃度DCMU 處理三角褐指藻，以探究外源DCMU 對(duì)三角褐指藻中巖藻黃素含量、葉綠素含量和葉綠素?zé)晒馓卣骷跋嚓P(guān)關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，探究三角褐指藻應(yīng)對(duì)光合作用條件變化調(diào)節(jié)自身巖藻黃素含量的機(jī)制，即巖藻黃素的生物合成與光合作用之間的關(guān)系。 以期通過(guò)改變光合作用效率來(lái)改變?nèi)呛种冈鍘r藻黃素含量，為通過(guò)調(diào)控光合作用效率來(lái)規(guī)?；a(chǎn)巖藻黃素奠定一定的理論基礎(chǔ)，也為探明三角褐指藻巖藻黃素積累的生理生化和分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 三角褐指藻藻種

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)由寧波大學(xué)教育部海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種室提供。

1.2 三角褐指藻的培養(yǎng)與DCMU 脅迫處理

試驗(yàn)藻用f/2 培養(yǎng)基培養(yǎng)于250 mL 三角瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[15]。 具體培養(yǎng)條件參考劉浩等[16]的方法。 在三角褐指藻培養(yǎng)第4 天時(shí)，分別用0(CK)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg·L-1DCMU 處理三角褐指藻。

1.3 三角褐指藻生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

三角褐指藻的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)曲線參考徐潤(rùn)潔等[15]的測(cè)定方法。 從脅迫處理試驗(yàn)初始，每天定時(shí)利用UV-5200 型紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)測(cè)定三角褐指藻藻液OD680值。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)曲線計(jì)算各處理組對(duì)應(yīng)的細(xì)胞密度，建立不同濃度DCMU 處理后三角褐指藻的生長(zhǎng)曲線。

1.4 三角褐指藻巖藻黃素含量的測(cè)定

在三角褐指藻進(jìn)入平臺(tái)期后利用有機(jī)溶液提取法提取巖藻黃素。 具體提取方法和巖藻黃素含量計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[17]。

1.5 三角褐指藻葉綠素含量的測(cè)定

取生長(zhǎng)至平臺(tái)期末的藻液，利用乙醇提取測(cè)定葉綠素含量。 取30 mL 藻液，5 000 r·min-1離心10 min，保留沉淀，即藻泥。 按藻泥∶95%乙醇=0.2 g ∶10 mL的比例在藻泥中加入95%乙醇，避光浸提24 h 至藻體發(fā)白，5 000 r·min-1離心10 min 后棄沉淀，利用UV-5200 型紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清液A645和A663吸光值。 按照公式計(jì)算三角褐指藻葉綠素含量(C):

1.6 三角褐指藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

取經(jīng)24、48 和72 h 處理的各組三角褐指藻藻液1 mL，暗適應(yīng)10 min 后測(cè)量誘導(dǎo)曲線。 在Water-PAM 葉綠素?zé)晒鈨x(德國(guó)WALZ 公司)上可讀出PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fm/Fv)、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子效率[Y (Ⅱ)]、光化學(xué)淬滅系數(shù)(photochemical quenching，qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(non-photochemical quenching，NPQ)、相對(duì)電子傳遞速率(relative electron transport rate，rETR)和快速光曲線初始斜率(α)。

1.7 三角褐指藻總RNA 的提取及巖藻黃素、光合作用相關(guān)合成通路的基因表達(dá)分析

三角褐指藻巖藻黃素合成通路關(guān)鍵基因番茄紅素β-環(huán)化酶基因(lcyb)和八氫番茄紅素脫氫酶基因(pds)及光合作用PSⅡ通路的關(guān)鍵基因D1 蛋白基因(psbA)、Rubisco 酶大亞基基因(rbcL) 采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物序列(表1)，內(nèi)參Actin的基因序列參考文獻(xiàn)[19]。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

取100 mL 三角褐指藻藻液(DCMU 處理24 h)，在5 000 r·min-1、4℃條件下離心10 min，收集底部沉淀后提取三角褐指藻總RNA，然后將RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。 用β-actin為內(nèi)參基因，目的基因和內(nèi)參基因反應(yīng)體系和程序相同。 熒光定量反應(yīng)體系參考徐潤(rùn)潔等[15]的反應(yīng)體系。 運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用Mircosoft Office Excel 2013 和SPSS 22.0 分別對(duì)三角褐指藻細(xì)胞密度、巖藻黃素含量、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)及關(guān)鍵基因的表達(dá)水平進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。 使用皮爾森(Pearson)相關(guān)系數(shù)來(lái)分析DCMU 處理后巖藻黃素含量與相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DCMU 濃度對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長(zhǎng)、巖藻黃素和葉綠素含量的影響

由圖1-A 可知，隨著DCMU 濃度的增加，三角褐指藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率較CK 明顯下降，且當(dāng)DCMU濃度為1. 0 mg·L-1時(shí)，DCMU 對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用最明顯。 試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)了藻體發(fā)白、大量死亡的現(xiàn)象。 表明DCMU 會(huì)抑制三角褐指藻的細(xì)胞生長(zhǎng)。

由圖1-B 可知，隨著DCMU 濃度的增加，三角褐指藻巖藻黃素含量總體呈下降趨勢(shì)，不同濃度DCMU處理均降低了三角褐指藻內(nèi)巖藻黃素含量，且當(dāng)DCMU 濃度超過(guò)0.4 mg·L-1后，其極顯著抑制了鹽藻黃素含量(P＜0.01)；當(dāng)DCMU 濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，巖藻黃素含量最低，較CK 降低了26.98%。 表明DCMU 可抑制三角褐指藻中巖藻黃素的生物合成及積累。

由圖1-C 可知，當(dāng)DCMU 濃度為0.1～0.8 mg·L-1時(shí)，不同濃度DCMU 均提高了三角褐指藻內(nèi)葉綠素含量，葉綠素含量增長(zhǎng)率在26.78%～47.95%之間。 當(dāng)DCMU 濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，葉綠素含量極顯著升高(P＜0.01)，較CK 增加了167.81%。 說(shuō)明，在一定濃度范圍內(nèi)，DCMU 可促進(jìn)三角褐指藻內(nèi)葉綠素含量的積累。

2.2 DCMU 濃度對(duì)三角褐指藻葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊?/h3>

由圖2 可知，隨著DCMU 濃度的增加，F(xiàn)v/Fm并未發(fā)生顯著變化，Y(Ⅱ)、rERT、NPQ、qP 和α 數(shù)值均呈下降趨勢(shì)。 其中，在DCMU 處理48 h 后NPQ 和Y(Ⅱ) 數(shù)值，DCMU 處理24 h 后rETR、qP 和α 數(shù)值，均在DCMU 濃度達(dá)到0.2 mg·L-1后顯著降低(P＜0.05)。 隨著DCMU 處理時(shí)間的增加，NPQ、qP 和rETR 都有小幅度的增加，但不顯著，而Y(Ⅱ)和α基本保持不變。

2.3 DCMU 濃度對(duì)巖藻黃素合成和光合作用相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖1 DCMU 濃度對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長(zhǎng)、藻巖藻黃素含量和葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of DCMU concentration on cell growth，fucoxanthin content and chlorophyll content ofPhaeodactylum tricornutum

由圖3 可知，DCMU 處理后巖藻黃素生物合成關(guān)鍵基因pds、lcyb及光合作用相關(guān)基因rbcL的表達(dá)量均極顯著低于CK，說(shuō)明DCMU 抑制巖藻黃素合成與巖藻黃素合成途徑以及光合作用相關(guān)通路基因的表達(dá)有關(guān)。 當(dāng)DCMU 濃度為0.1 ～0.4 mg·L-1時(shí)，psbA表達(dá)水平低于CK，且隨著DCMU 濃度的增加呈上升趨勢(shì)；當(dāng)DCMU 濃度為0.8 mg·L-1時(shí)，psbA表達(dá)水平較CK高，且當(dāng)DCMU 濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，psbA表達(dá)極顯著上調(diào)(P＜0.01)。

2.4 巖藻黃素含量與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的相關(guān)性分析

圖2 DCMU 濃度對(duì)三角褐指藻葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊慒ig.2 Effect of DCMU concentration on chlorophyll fluorescence characteristics of Phaeodactylum tricornutum

圖3 DCMU 濃度對(duì)三角褐指藻巖藻黃素、光合作用相關(guān)合成通路的基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of DCMU concentration on gene expression of fucoxanthin and photosynthesis-related synthetic pathways

對(duì)三角褐指藻巖藻黃素含量與葉綠素?zé)晒鈪?shù)中除Fv/Fm外其他有明顯變化的參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，當(dāng)DCMU 濃度為1 mg·L-1時(shí)藻體大量死亡，參考意義較小，故剔除對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)。 相關(guān)性分析結(jié)果表明(表2)，巖藻黃素含量與Y(Ⅱ)、qP 和α 數(shù)值之間存在顯著正相關(guān)性，與rERT 和NPQ 無(wú)顯著相關(guān)性。 上述結(jié)果表明，三角褐指藻巖藻黃素合成與光合作用相關(guān)，但不同的光合作用機(jī)理和生理狀況之間存在差異。

表2 巖藻黃素含量與葉綠素?zé)晒鈪?shù)之間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficient between fucoxanthin content and chlorophyll fluorescence parameters

3 討論

PSⅡ是類(lèi)囊體膜中進(jìn)行光吸收的葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合體，具有吸收光能和光傳遞的作用。 P680 是原初電子供體，位于D1 和D2 蛋白上，之后電子依次傳遞到去鎂葉綠素(Pheo)、QA和QB[20]。 而DCMU 的作用機(jī)理則是打斷QA到QB的電子傳遞，從而影響植物的光合作用，且是不可逆過(guò)程[21]。 李今等[22]研究發(fā)現(xiàn)，10 μmol·L-1DCMU 會(huì)抑制銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)的細(xì)胞生長(zhǎng)；張繼民等[23]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DCMU濃度達(dá)到 0.8 μmol·L-1時(shí)，眼點(diǎn)擬微球藻(Nannochloropsis oculata) 的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到80%。 本研究也發(fā)現(xiàn)，DCMU 脅迫下三角褐指藻的細(xì)胞濃度明顯低于對(duì)照組，當(dāng)DCMU 濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，出現(xiàn)了藻體死亡的現(xiàn)象，可能是因?yàn)槿呛种冈鍨楣夂献责B(yǎng)型生物，而DCMU 阻斷了藻細(xì)胞正常的光合作用，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法合成，導(dǎo)致生長(zhǎng)速率慢、死亡率增加。

巖藻黃素是天然類(lèi)胡蘿卜素中的一種，在硅藻中屬于次生代謝產(chǎn)物，能夠在光合作用中輔助吸收光能[24]。 Sivan 等[25]發(fā)現(xiàn)對(duì)照組紫球藻(Porphyridiumsp.UTEX 637)的色素含量低于DCMU 抗性株。 本研究結(jié)果表明，巖藻黃素含量隨著DCMU 濃度的增加而降低，當(dāng)DCMU 濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，巖藻黃素含量較對(duì)照組下降了26.98%，說(shuō)明添加DCMU 使次生代謝途徑中巖藻黃素的合成受阻，推測(cè)是由于光合作用被抑制，導(dǎo)致巖藻黃素前體物質(zhì)合成不足。

葉綠素是光吸收環(huán)節(jié)中的核心物質(zhì)，是光合作用中最重要的色素之一。 本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的DCMU均能有效提高三角褐指藻內(nèi)葉綠素含量，這與巖藻黃素含量變化相反。 可能是因?yàn)镈CMU 抑制了光合作用吸收光能之后的電子傳遞過(guò)程，使后續(xù)的反應(yīng)缺少能量無(wú)法進(jìn)行，植物體可能通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)來(lái)彌補(bǔ)這種不足，即試圖提高葉綠素含量從而吸收更多的光能進(jìn)行傳遞。 此外，DCMU 除了具有打斷光合作用電子傳遞的作用，還可抑制葉綠體活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[26]。 植物體內(nèi)的ROS 具有抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[27]，但過(guò)量的ROS 積累會(huì)使蛋白質(zhì)氧化活性降低。 孫錦等[28]發(fā)現(xiàn)海水脅迫下菠菜葉綠體內(nèi)的ROS 與葉綠體代謝密切相關(guān)，ROS 可使葉綠體降解；羅黃穎等[29]也發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫處理會(huì)使番茄幼苗內(nèi)的ROS 積累。 植物體內(nèi)的各種生理生化反應(yīng)是非常復(fù)雜的，原本植物體內(nèi)ROS 含量增加，對(duì)葉綠素有降解現(xiàn)象，但DCMU 在一定程度上抑制了ROS 的產(chǎn)生，從而出現(xiàn)葉綠素含量上升的現(xiàn)象。 DCMU 對(duì)不同藻類(lèi)的葉綠素含量的作用效果不盡相同，余利紅等[30]也發(fā)現(xiàn)DCMU 對(duì)魚(yú)腥藻(Anabaenasp.PCC7120)的葉綠素有顯著的抑制作用，而對(duì)集胞藻(Synechocystissp.PCC6803)的葉綠素?zé)o明顯影響。 當(dāng)DCMU 濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，葉綠素含量極顯著上升，較對(duì)照組增加167.81%，推測(cè)是由于藻體大量死亡，植物體內(nèi)葉綠素積累。

巖藻黃素與葉綠素a 和c 組成捕光復(fù)合物FCPs，在光合作用中起到重要的作用。 而本研究發(fā)現(xiàn)DCMU處理后，處理組鹽藻黃素含量總體較對(duì)照組降低，而葉綠素含量上升，這可能是因?yàn)椋m然它們共同組成捕光復(fù)合物，但葉綠素在其中起到更主要的作用，所以植物在逆境脅迫下，體內(nèi)更多的物質(zhì)和能量被用于合成葉綠素。 有關(guān)逆境脅迫下巖藻黃素和葉綠素合成的相關(guān)機(jī)制、它們?cè)贔CPs 中如何發(fā)揮作用以及在其中的地位還待有進(jìn)一步深入研究。

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)可以快速、靈敏地測(cè)定植物光合作用對(duì)逆境的應(yīng)答機(jī)制[31]。 劉晶等[32]發(fā)現(xiàn)用4 μmol·L-1DCMU 處理普通小球藻和銅綠微囊藻能獲得差異顯著的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線；Gaevsky 等[33]采用DCMU 誘導(dǎo)的熒光方法鑒定浮游植物藻類(lèi)的具有生態(tài)學(xué)意義的顯性?xún)?yōu)勢(shì)群。 DCMU 會(huì)抑制PSⅡ通路的電子傳遞效率，本研究中，隨著DCMU 濃度的增加，除Fv/Fm外各熒光參數(shù)均呈下降趨勢(shì)，電子傳遞速率降低，光保護(hù)能力減弱，甚至在DCMU 濃度為1 mg·L-1時(shí)出現(xiàn)電子完全阻斷現(xiàn)象；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，qP、NPQ 和rETR 有小幅度的增強(qiáng)，而三角褐指藻內(nèi)的實(shí)際光合效率基本不變。 推測(cè)加入DCMU 后PSⅡ的光合作用的能力可能并未發(fā)生巨大變化，但降低了實(shí)際光合作用強(qiáng)度，隨著處理時(shí)間的增加，DCMU 的作用功效減弱。

pds和lcyb是巖藻黃素合成通路中的關(guān)鍵基因，不同濃度DCMU 處理下，其表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明巖藻黃素含量的下降是基因表達(dá)的結(jié)果。 光合作用合成的相關(guān)基因psbA是光合作用PSⅡ反應(yīng)中心復(fù)合物(D1-D2-Cy599)的D1(32KD)蛋白的編碼基因[34]，rbcL是Rubisco 酶的大亞基基因[35]，D1 蛋白和Rubisco 酶在電子傳遞鏈中分別位于DCMU 電子打斷處的上、下游。PSbA與rbcL基因表達(dá)水平都呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)，推測(cè)是由于DCMU 打斷了電子鏈傳遞造成電子傳遞不暢，rbcL和psbA的表達(dá)在低濃度DCMU 處理時(shí)被抑制，而當(dāng)電子傳遞被抑制到一定程度時(shí)，出于自我保護(hù)機(jī)制，進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，基因表達(dá)水平有所上調(diào)。

本研究結(jié)果表明，三角褐指藻內(nèi)巖藻黃素的含量與實(shí)際光合效率、光化學(xué)淬滅和光器官光能利用率之間存在顯著正相關(guān)性(P＜0.05)，而與相對(duì)電子傳遞速率和非光化學(xué)淬滅系數(shù)并不顯著，說(shuō)明三角褐指藻內(nèi)巖藻黃素的生物合成與積累與光合作用有關(guān)，但不同生理狀況起到的作用不盡相同，其中光化學(xué)淬滅和光器官光能利用率與巖藻黃素合成的調(diào)控過(guò)程相關(guān)性更高。 臧正蓉等[36]研究也指出，7 200 lx 的光照強(qiáng)度可促進(jìn)三角褐藻內(nèi)巖藻黃素含量的積累，但并未對(duì)巖藻黃素及光合作用通路之間的相關(guān)性進(jìn)行探究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)外源DCMU 可抑制三角褐指藻的細(xì)胞生長(zhǎng)，并隨著DCMU 濃度的增加，其抑制效果增強(qiáng)。高濃度DCMU 處理，巖藻黃素含量極顯著降低，而葉綠素含量顯著上升。 三角褐指藻的熒光參數(shù)Y(Ⅱ)、rETR、qP 和α 隨著DCMU 濃度的增加而降低。 巖藻黃素合成關(guān)鍵酶基因pds、lcyb及光合作用相關(guān)基因rbcL的表達(dá)水平也與其含量變化趨勢(shì)相同。 三角褐指藻內(nèi)巖藻黃素含量與實(shí)際光合效率、光化學(xué)淬滅和光合器官光能利用率的相關(guān)性進(jìn)一步說(shuō)明巖藻黃素含量與光合作用有關(guān)。 本研究為進(jìn)一步探明三角褐指藻巖藻黃素生物合成機(jī)理，明確光合作用與巖藻黃素含量的相關(guān)性提供了理論依據(jù)，也為提高三角褐指藻內(nèi)巖藻黃素含量提供了一定的思路。