馬珍珍 何金興 趙 濤 趙曉磊

(齊魯工業(yè)大學(xué)〔山東省科學(xué)院〕食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353)

四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines，TCs)是一類臨床應(yīng)用較早的廣譜抗生素。由于TCs成本低且較易獲得，被廣泛應(yīng)用于防治動(dòng)物疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長[1]，不合理的濫用導(dǎo)致TCs在動(dòng)物源性食品中殘留嚴(yán)重，對(duì)人體健康和環(huán)境具有潛在危害，如過敏反應(yīng)[2]、抗藥性基因的出現(xiàn)和傳播[3]，增加患皮膚癌的風(fēng)險(xiǎn)[4]。GB 31650—2019中明確規(guī)定在禽蛋中TCs最大殘留限量為400 μg/kg，動(dòng)物肌肉組織中為200 μg/kg，肝臟中為600 μg/kg，牛奶中為100 μg/kg。目前，針對(duì)TCs的定量分析方法包括色譜法[5]、熒光分析法[6]、免疫分析法[7]、微生物抑制法[8]和傳感器分析技術(shù)[9]等。其中，色譜法是最常用的檢測技術(shù)，該方法的測量準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，但因食品基質(zhì)中干擾成分多且分析物豐度低，樣品前處理過程對(duì)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度有很大影響。

生物炭作為一種新興吸附材料，已被證實(shí)可用于去除環(huán)境中氯霉素和四環(huán)素(TC)污染[10-11]。生物炭來源廣泛、價(jià)格低廉、制備簡單，具備豐富的多孔結(jié)構(gòu)且易于修飾[12]，在食品樣品前處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。但實(shí)際應(yīng)用中，生物炭缺乏特異性的劣勢給食品中痕量目標(biāo)物的識(shí)別帶來了難度。分子印跡技術(shù)是模擬抗體—抗原的識(shí)別過程，制備高特異性的聚合物材料的方法，常規(guī)的分子印跡材料的制備方法包括本體聚合、原位聚合和表面印跡等[13]。皮克林乳液是以固定顆粒作為穩(wěn)定劑形成兩相或多相體系，由于固體顆粒在水相和在油相的親潤性不同，能夠穩(wěn)定吸附在兩相界面上阻止液滴的碰撞和合并[14-15]。利用皮克林乳液聚合法制備生物炭印跡聚合物，通過兩相界面上印跡方法，可以改善生物炭在常規(guī)溶劑中分散性差并解決常規(guī)方法合成過程中生物炭可能團(tuán)聚導(dǎo)致印跡位點(diǎn)分布不均的問題。

試驗(yàn)擬以生物炭作為皮克林乳液穩(wěn)定劑，制備新型水包油型皮克林乳液。以TC為模板分子、甲基丙烯酸為功能單體、二乙烯基苯為交聯(lián)劑、偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，四氧化三鐵(Fe3O4)與生物炭作為共穩(wěn)定劑，制備磁響應(yīng)四環(huán)素印跡生物炭微球(MMIPMs)。并以此聚合物為磁性固相萃取材料，與高效液相色譜儀(HPLC)離線聯(lián)用，建立適用于動(dòng)物源性食品中TCs痕量殘留檢測的方法。旨在為生物炭在食品中痕量污染物檢測方面的應(yīng)用提供一種新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

TC：98%，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；

鹽酸土霉素(OTC)、鹽酸強(qiáng)力霉素(DC)：98%，上海源葉生物科技有限公司；

磺胺二甲基嘧啶(SMZ，99%)、甲基丙烯酸：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

速滅威(TMC，99.2%)、偶氮二異丁腈：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

二乙烯基苯：80%，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；

生物炭：400～450 ℃熱解的稻殼生物炭，沈陽卡力瑪生物炭科技開發(fā)有限公司；

魚和雞肉樣品：市售，用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器設(shè)備

HPLC：1260 Infinity II型，美國Agilent Technologies公司；

掃描電子顯微鏡：EM-30plus型，韓國COXEM公司；

X射線衍射儀：D8-Advance型，德國Bruker公司；

熱重分析儀：TGA-1型，瑞士Mettler公司；

傅里葉紅外光譜儀：Nicolet 6700型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

紫外可見分光光度計(jì)：TU1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 二乙烯基苯純化 取200 mg的堿性氧化鋁裝填在固相萃取小柱中，取3 mL的二乙烯基苯混合物過柱，去除阻聚劑，將純化后的二乙烯基苯低溫避光儲(chǔ)存。

1.2.2 生物炭表面改性 首先研磨稻殼生物炭，過70目篩。取20.0 g生物炭溶于200 mL氫氧化鈉溶液(3 mol/L)中，在60 ℃下攪拌2 h。用G5砂芯漏斗分離得到的堿性處理的生物炭顆粒，用乙醇和蒸餾水洗滌，直到洗脫液呈中性。隨后將堿性處理后的生物炭在-0.1 MPa和60 ℃下真空干燥8 h，干燥避光保存。

1.2.3 四氧化三鐵的制備 將1.99 g FeCl2·4H2O和3.24 g FeCl3溶于100 mL蒸餾水中。配制50 mL 2 mol/L的NaOH溶液，80 ℃水浴加熱，之后在攪拌狀態(tài)下逐滴加入5 mL鐵離子溶液，繼續(xù)劇烈攪拌30 min。通過外加磁場分離收集產(chǎn)物，用蒸餾水洗滌至pH為中性，然后將制備的產(chǎn)物Fe3O4在真空中干燥。

1.2.4 皮克林乳液聚合法制備MMIPMs 以生物炭和Fe3O4作為皮克林乳液共穩(wěn)定劑，形成水包油型乳液體系，其中水相為蒸餾水，油相為甲苯。取90 mg生物炭和30 mg Fe3O4，將其分散在12 mL蒸餾水中，超聲處理10 min。取1 454 μL甲苯置于離心管中，加入200 μL 48 mg/mL的TC甲醇溶液、64 μL甲基丙烯酸、278 μL二乙烯基苯、30 mg偶氮二異丁腈，混勻作為油相。然后將油相與水相混合，手動(dòng)搖晃3 min，直至形成穩(wěn)定的皮克林乳液，60 ℃水浴下反應(yīng)5 h。聚合反應(yīng)結(jié)束后，將乳液倒入G5砂芯漏斗中抽濾，用甲醇洗滌3次，除去殘留的低聚物和單體。利用甲醇—乙酸(體積比9∶1)洗滌，去除模板分子TC，真空干燥得到最終的MMIPMs。

非印跡材料(MNIPMs)的合成除不加模板分子TC外與上述印跡材料合成方法一致。

1.2.5 材料的表征

(1) 掃描電鏡：將合成的材料粘在導(dǎo)電膠上噴金處理通過掃描電鏡觀察微球形貌。

(2) 紅外光譜：干燥的待測樣品與干燥的溴化鉀按1∶100的比例混合，于研缽中研磨壓片，用傅里葉變換紅外光譜進(jìn)行分析測試。

(3) X射線衍射：在2θ為10°～90°范圍內(nèi)對(duì)Fe3O4和MMIPMs的晶型結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

(4) 熱重分析：以10 ℃/min的加熱速率，在45～600 ℃范圍內(nèi)檢測材料的熱穩(wěn)定性。

1.2.6 材料的吸附性能

(1) 吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)：稱取10 mg MMIPMs/MNIPMs材料，分別加入5 mL 20 mg/L的TC甲醇溶液，分散于棕色容量瓶中。放置于搖床上振蕩，通過磁分離取振蕩不同時(shí)間后(5，10，20，40，60，120，240 min)的樣品上清液。通過紫外分光光度計(jì)測定上清液吸光度，并按式(1)計(jì)算吸附容量。

(1)

式中：

Q——吸附容量，mg/g；

Ci——溶液中模板分子吸附前的濃度，mg/L；

Cf——溶液中模板分子吸附后的濃度，mg/L；

V——樣品溶液的體積，L；

m——合成材料的質(zhì)量，g。

(2) 等溫吸附性能評(píng)價(jià)：稱取10 mg MMIPMs/MNIPMs置于棕色容量瓶中，分別加入5 mL不同濃度(5，10，20，40，60，80 mg/L)TC溶液。振蕩一段時(shí)間后，通過磁分離手段取上清液。通過紫外分光光度計(jì)測定上清液吸光度，并按式(1)計(jì)算吸附容量。

(3) 選擇吸附試驗(yàn)：TC和OTC作為結(jié)構(gòu)類似對(duì)照組，SMZ和TMC作為參比化合物對(duì)照組，進(jìn)行選擇性試驗(yàn)。首先，稱取10 mg MMIPMs和MNIPMs加入到棕色容量瓶中，配置濃度為40 mg/L不同物質(zhì)的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取5 mL上述溶液加入到容量瓶中。放置在搖床上，室溫下振蕩混合物一段時(shí)間后，用外加磁場分離混合物，上清液通過尼龍66膜(0.22 μm)過濾。用紫外分光光度計(jì)分別檢測4種分析物的濃度，按式(1)計(jì)算吸附容量，根據(jù)式(2)～(3)計(jì)算分配系數(shù)、選擇性系數(shù)和相對(duì)選擇性系數(shù)。

(2)

(3)

(4)

式中：

Kd——分配系數(shù)；

K——選擇性系數(shù)；

K’——相對(duì)選擇性系數(shù)。

1.2.7 固相萃取與HPLC聯(lián)用

(1) 樣品處理：5.0 g雞肉/魚肉樣品，加入5 mL Na2EDTA-MCIlvaine緩沖液，冰水浴中超聲處理20 min，然后8 000 r/min離心10 min，重復(fù)操作兩次，合并兩次上清液。水樣取5 mL。

(2) 磁性固相萃取程序：稱取20.0 g MMIPMs，加入上述樣品提取液，振蕩提取2 h，通過外加磁鐵分離，丟棄上清液。用3 mL超純水—甲酸(體積比80∶20)洗脫20 min，磁分離取上清液，過0.22 μm濾膜，然后用HPLC進(jìn)行測定。

(3) HPLC條件：色譜柱為Xterra C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm，5 μm)；流動(dòng)相為含30%甲醇的乙腈溶液—0.01 mol/L檸檬酸溶液(體積比21∶79)；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長357 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)表征

圖1(a)表明，通過皮克林乳液聚合法合成的MMIPMs為球形結(jié)構(gòu)，生物炭和Fe3O4分散附著在球體表面。通過對(duì)合成的MMIPMs和MNIPMs進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，驗(yàn)證磁性生物炭微球的成功制備。如圖1(b)所示，3 448 cm-1處為生物炭分子間氫鍵O—H的伸縮振動(dòng)，2 927 cm-1處為生物炭中脂肪烴或環(huán)烷烴中C—H的伸縮振動(dòng)，1 737 cm-1處為甲基丙烯酸的C═O吸收峰，1 603～1 447 cm-1的4個(gè)強(qiáng)度不等的峰為二乙烯基苯的苯環(huán)C═C骨架振動(dòng)，575 cm-1為Fe—O的吸收峰，上述結(jié)果表明成功合成了MMIPMs。通過X射線衍射儀進(jìn)一步分析所制備的Fe3O4和MMIPMs的磁特性，如圖1(c)所示，合成的Fe3O4在2θ(30.24°，35.59°，43.25°，57.29°，62.88°)處有衍射峰，分別為(220)、(311)、(400)、(511)和(440)面的特征衍射峰，與反尖晶石型的Fe3O4標(biāo)準(zhǔn)衍射譜的特征衍射圖吻合較好(JCPDS card, No. 19-0629)。此外，MMIPMs的衍射圖譜與Fe3O4的峰位相似，表明在MMIPMs合成過程中Fe3O4的結(jié)晶結(jié)構(gòu)得到了很好的保持，因此合成的MMIPMs具有Fe3O4超順磁性，可以應(yīng)用于磁分離。通過熱重分析儀對(duì)MMIPMs的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1(d)所示。在溫度達(dá)到380 ℃之前，材料基本無質(zhì)量損失；380～458 ℃有明顯的失重(60%)，在此階段主要是由于聚合物基本解體，主體骨架坍塌由MMIPMs的熱降解所致，剩余的組分為生物炭和Fe3O4粒子。以上結(jié)果表明，通過皮克林乳液聚合法，只需要簡單地將Fe3O4作為共穩(wěn)定劑，便成功制備了形狀規(guī)則的MMIPMs，而且合成的材料具有很好的熱穩(wěn)定性。

2.2 材料的吸附性能評(píng)價(jià)

2.2.1 吸附動(dòng)力學(xué) 吸附動(dòng)力學(xué)是評(píng)價(jià)印跡材料吸附效率的重要指標(biāo)。如圖2(a)所示，MMIPMs和MNIPMs對(duì)TC的吸附速率呈先增加后減小的趨勢，在吸附初始階段聚合物表面暴露足夠多的結(jié)合位點(diǎn)，而隨著吸附的進(jìn)行，大多數(shù)結(jié)合位點(diǎn)被TC占據(jù)，導(dǎo)致后續(xù)吸附過程中的空間阻力較大，吸附速率下降。另外，聚合物在吸附30 min內(nèi)就可達(dá)到最大吸附量的50%，吸附60 min后吸附量呈現(xiàn)極緩慢的增長，直至120 min后吸附達(dá)到平衡，吸附平衡時(shí)間短，是因?yàn)樯锾康亩嗫捉Y(jié)構(gòu)提高了傳質(zhì)速率。在實(shí)際應(yīng)用過程中，快的傳質(zhì)速率有利于增強(qiáng)前處理過程中的萃取效率。

2.2.2 等溫吸附曲線 如圖2(b)所示，MMIPMs和MNIPMs

圖1 聚合物的掃描電鏡、傅里葉紅外光譜、X射線衍射和熱重分析表征

Figure 1 Characterizations of polymers by scanning electron microscope, fourier transform infrared spectrometer,

X-ray diffractometer and thermogravimetric analysis

圖2 MMIPMs和MNIPMs的吸附動(dòng)力學(xué)曲線以及吸附等溫線

的吸附量隨初始濃度的增加而增加。與MNIPMs相比，MMIPMs明顯具有更高的吸附能力，當(dāng)非印跡材料達(dá)到吸附飽和時(shí)，印跡材料吸附量仍呈上升趨勢。當(dāng)溶液初始濃度為80 mg/L時(shí)，印跡材料和非印跡材料的吸附量分別為11.68，3.08 mg/g，印跡因子為3.79，說明MMIPMs具有較好的印跡效果。

2.2.3 選擇性試驗(yàn) 由表1可知，MMIPMs對(duì)TC的吸附量明顯高于對(duì)其他分析物(OTC、SMZ、TMC)的吸附量，且高于MNIPMs的吸附量。MMIPMs對(duì)TC的吸附量(11.1 mg/g)是對(duì)SMZ吸附量(0.353 mg/g)的31.4倍，表明制備的MMIPMs對(duì)模板分子TC表現(xiàn)出良好的選擇性。用選擇性系數(shù)K進(jìn)一步評(píng)價(jià)MMIPMs和MNIPMs的吸附選擇性。顯然，對(duì)于4種參比物質(zhì)，MMIPMs的選擇性系數(shù)均大于MNIPMs，且MMIPMs和MNIPMs的相對(duì)選擇性系數(shù)K’>1，進(jìn)一步證實(shí)了MMIPMs對(duì)TCs的良好特異性識(shí)別能力。

表1 MMIPMs和MNIPMs對(duì)4種分析物的選擇性

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

為了得到最佳的萃取效果，對(duì)試驗(yàn)過程中可能影響萃取效率的因素進(jìn)行優(yōu)化，包括洗脫溶劑的種類、洗脫劑體積和洗脫時(shí)間，結(jié)果見圖3。選用不同種類的洗脫液(10%～20%甲酸乙腈溶液、5%～20%甲酸水溶液)對(duì)吸附后的MMIPMs淋洗，如圖3(a)所示，當(dāng)洗脫液為20%的甲酸水溶液時(shí)，獲得的回收率最高(82.4%～85.8%)，因此選用20%的甲酸水溶液洗脫。選用不同體積(2～5 mL)的20%甲酸水溶液進(jìn)行洗脫，如圖3(b)顯示洗脫劑體積為3 mL時(shí)，3種TCs的回收率就能達(dá)到94.8%～104.0%。圖3(c)為不同洗脫時(shí)間(10～60 min)下的回收率情況，當(dāng)洗脫時(shí)間為20 min時(shí)，回收率為97.0%～100.0%)，隨著洗脫時(shí)間的增大，回收率沒有明顯的增長，因此選用20 min為洗脫時(shí)間。

根據(jù)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，用3 mL含20%甲酸的水溶液作為洗脫劑，洗脫20 min進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 實(shí)際樣品中的應(yīng)用

以合成的MMIPMs作為磁性固相萃取吸附材料，結(jié)合HPLC建立了一種適用于食品中TCs獸藥殘留的檢測方法。在最佳萃取條件下，當(dāng)TCs濃度為5～160 μg/L時(shí)，目標(biāo)物濃度與峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2>0.997 2)，選取信噪比(S/N)為3時(shí)的溶液濃度為TCs的最低檢測限，TC和OTC儀器檢測限分別為1.42，1.58 μg/L，方法檢出限分別為0.46，0.51 μg/L。

為進(jìn)一步證明所建方法的可行性，對(duì)魚肉、雞肉和水樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平加標(biāo)(5，10，20 μg/kg)，通過得到的加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)所建立方法的準(zhǔn)確度。由表2可知，加標(biāo)魚肉、雞肉、水樣中的回收率分別為91.2%～103.4%，90.6%～98.9%，92.0%～101.4%，RSD為1.23%～9.99%，該結(jié)果滿足GB/T 27404—2008定量分析檢測要求(被測組分含量<0.1 mg/kg，回收率范圍為60%～120%)，與其他方法(表3)比較，試驗(yàn)方法具有較高的回收率和較低的檢出限，說明該方法可用于食品中TCs殘留定量分析。

3 結(jié)論

以生物炭和四氧化三鐵作為皮克林乳液的共穩(wěn)定劑，結(jié)合分子印跡技術(shù)，合成了一種新型磁響應(yīng)四環(huán)素印跡生物炭微球。該方法制備過程簡單、成本低、合成的聚合物為具有磁響應(yīng)特性的規(guī)整球形結(jié)構(gòu)，可以簡化樣品前處理的提取和凈化環(huán)節(jié)。吸附性能研究表明得到的磁響應(yīng)四環(huán)素印跡生物炭微球傳質(zhì)速率較快(120 min基本達(dá)到吸附平衡)、吸附量較大(11.68 mg/g)、對(duì)目標(biāo)物具有良好的選擇性(印跡因子為3.79)。以高效液相色譜儀作為分析儀器，所建立的檢測方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)食品中四環(huán)素類抗生素的準(zhǔn)確分析(3種樣品的回收率為90.6%～103.4%，RSD為1.23%～9.99%)。為生物炭在食品樣品中污染物檢測方面的應(yīng)用提供了一條新的思路和方法。

圖3 不同萃取條件對(duì)回收率的影響

表2 不同樣品中3種TCs的加標(biāo)回收率及精密度

Table 2 The recoveries and RSDs of three TCs in different spiked samples (n=3)

TCs濃度/(μg·L-1)分析物 魚肉/% 雞肉/% 自來水/% 回收率RSD回收率RSD回收率RSD5OTC96.15.3598.24.94101.46.42TC103.43.8091.86.2892.01.2310OTC100.4 6.2598.95.88 95.71.56TC94.64.4392.53.7194.75.9920OTC91.21.3096.61.98 95.29.99TC97.11.7290.64.9593.65.51

表3 與其他文獻(xiàn)方法的比較?

? a 單位為μg/L；b 單位為μg/kg。