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益氣活血通絡(luò)方對(duì)急性腦梗死大鼠炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響?

2020-07-03 02:22閆振文鄭眉光
中國(guó)中醫(yī)急癥 2020年6期
關(guān)鍵詞:通絡(luò)腦組織西藥

閆振文 鄭眉光 李 梅

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院,廣東 廣州 510120)

急性腦梗死(ACI)系指腦缺血發(fā)生在6~12 h之內(nèi),缺血區(qū)腦組織會(huì)產(chǎn)生病理改變,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的缺血變化。腦細(xì)胞缺血缺氧后,腦組織將會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)等一系列病理反應(yīng),誘導(dǎo)產(chǎn)生大量氧自由基和炎性因子,使蛋白質(zhì)、氨基酸、脂質(zhì)等過(guò)氧化,產(chǎn)生細(xì)胞毒性并破壞血腦屏障,進(jìn)一步加重腦損傷,導(dǎo)致大腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞凋亡[1]。研究發(fā)現(xiàn),腦組織缺血后,自由基可通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路協(xié)同誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]。目前,臨床對(duì)ACI的治療主要以恢復(fù)血供、增加氧再灌注水平為原則,以減輕甚至避免因缺血缺氧導(dǎo)致的腦組織損傷,最大限度地保護(hù)腦組織。常規(guī)治療以溶栓、抗凝、抗血小板聚集等方法為主,尤其是靜脈溶栓,被醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為挽救缺血腦組織的重要方法,但均無(wú)法及時(shí)清除氧自由基等物質(zhì)[3]。

急性腦梗死在中醫(yī)學(xué)上屬“內(nèi)風(fēng)”范疇,為內(nèi)傷病證。中醫(yī)認(rèn)為誘發(fā)中風(fēng)的病因主要有機(jī)體腑臟失調(diào)、情志郁怒、飲食不節(jié)、勞累過(guò)度、氣候改變等,其病機(jī)多以氣血運(yùn)行不暢、瘀血阻脈、久瘀化熱最常見(jiàn),故治療時(shí)應(yīng)以活血化瘀、行氣通絡(luò)為主[4]。益氣活血通絡(luò)方以黃芪、黨參為君藥,以當(dāng)歸、丹參、川芎為臣藥,具有益氣固表、活血化瘀、行氣解毒通絡(luò)的功效,適用于中風(fēng)。本研究通過(guò)復(fù)制SD大鼠急性腦梗死模型,旨在探討益氣活血通絡(luò)方對(duì)急性腦梗死模型大鼠相關(guān)炎癥因子、氧化應(yīng)激指標(biāo)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只清潔級(jí)雄性SD大鼠,7~8周齡,平均體質(zhì)量(250±20)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK-(京)2010-0015,合格證號(hào):110011191100312。所有動(dòng)物室溫飼養(yǎng),自由飲水進(jìn)食,符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求。

1.2 藥物與試劑 益氣活血通絡(luò)方,組成:黃芪30 g,黨參30 g,川芎10 g,當(dāng)歸10 g,丹參10 g,赤芍10 g,紅花10 g,桃仁15 g,地龍10 g,甘草6 g。上述中藥飲片均由本院中藥房提供,藥材加水煎煮2次,合并藥液共200 mL,生藥含量0.7 g/mL。注射用尿激酶(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào)20190521,規(guī)格25萬(wàn)單位);阿司匹林腸溶片(拜阿司匹林,沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司,批號(hào)20190323,規(guī)格100 mg);硫酸氫氯吡格雷片(帥信樂(lè)普藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)20180715,規(guī)格75 mg);依達(dá)拉奉注射液(國(guó)藥集團(tuán)國(guó)瑞藥業(yè)有限公司,批號(hào)91130117,規(guī)格30 mg/20 mL);水合氯醛(分析純,天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);蘇木精-伊紅染色液(武漢華美生物工程有限公司);白細(xì)胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒、S100B蛋白試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 RM2235型病理切片機(jī),德國(guó)萊卡公司;BX60顯微鏡,日本Olympus Optical公司;LDZ-2型低速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司);AU5400全自動(dòng)生化分析儀,日本奧林巴斯有限公司;ELx800酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.4 模型制備 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10只、假手術(shù)組10只、手術(shù)組30只。參照Z(yǔ)ealand-Longa線栓法[5]復(fù)制大腦中動(dòng)脈缺血模型(MCAO)。將手術(shù)組30只大鼠用5%水合氯醛(400 mg/kg)行腹腔麻醉,將實(shí)驗(yàn)大鼠側(cè)臥固定于手術(shù)臺(tái)上,頸正中線切口,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈,分別結(jié)扎頸外動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈分叉下方開(kāi)一切口,將線栓從切口處插入頸內(nèi)動(dòng)脈,有明顯阻力感時(shí)停止插入,剪去線栓尾端部分,并在頸內(nèi)動(dòng)脈根部固定,逐層縫合皮下組織及皮膚。術(shù)后腹腔注射2萬(wàn)單位青霉素,大鼠保持側(cè)臥位,體溫維持在37℃左右,注意吸痰保持呼吸道通暢。動(dòng)物清醒后明顯有對(duì)側(cè)Horner征及偏癱體征,包括:1)身體向左傾倒或轉(zhuǎn)圈;2)左側(cè)軀體對(duì)疼痛刺激無(wú)反應(yīng);3)提尾懸空時(shí)左前肢前伸現(xiàn)象消失;顯示造模成功。神經(jīng)功能缺損評(píng)分1~3分為合格,不合格者剔除。假手術(shù)組10只大鼠將栓線由ECA斷端插入ICA,保留約1 min后將栓線拔出,結(jié)扎ECA斷端,其余步驟同模型組。

1.5 分組及給藥 成模大鼠分為模型組、西藥組、聯(lián)合組(西藥組+益氣活血通絡(luò)方),于建模后第10日開(kāi)始給藥。對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水灌胃,劑量為5 mL/kg。西藥組給予注射用尿激酶靜滴,劑量5萬(wàn)U/kg;阿司匹林腸溶片和氯吡格雷灌胃,劑量各1 mg/kg;依達(dá)拉奉靜滴,劑量0.15 mg/kg。聯(lián)合組在西藥組基礎(chǔ)上給予益氣活血通絡(luò)方灌胃,劑量5 mL/kg。各組均每天灌胃1次,連續(xù)治療10 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1)炎癥因子測(cè)定:于末次給藥后,心臟取血,離心,取上層血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定各組大鼠血清IL-8和TNF-α水平,嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。2)氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定:心臟取血,離心,取上層血清,采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定各組大鼠SOD水平,采用ELISA測(cè)定MDA水平,嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。3)神經(jīng)功能指標(biāo)測(cè)定:心臟取血,離心,取上層血清,采用放射免疫法檢測(cè)血清S100B蛋白、BDNF水平,嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。4)腦組織病理切片:末次給藥后處死各組大鼠,4℃下快速斷頭取腦,0.9%氯化鈉注射液清洗后,置于4%多聚甲醛中固定48 h,二甲苯脫脂,酒精梯度脫水,石蠟包埋,切片,每片厚約5 μm,蘇木精-伊紅染色,觀察各組大鼠的腦組織病理變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以(±s)表表示,組間或組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn);采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)數(shù)資料的比較,以n(%)表示計(jì)數(shù)資料。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織病理學(xué)比較 見(jiàn)圖1。各組大鼠腦組織病理學(xué)切片顯示:聯(lián)合組少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞死亡,細(xì)胞質(zhì)疏松及腫脹明顯減輕;西藥組細(xì)胞核少見(jiàn)固縮,腦組織水腫有減輕;模型組腦組織周圍神經(jīng)元腫脹并出現(xiàn)皺縮,細(xì)胞核固縮,梗死灶內(nèi)細(xì)胞和血管壞死,正常組織消失,結(jié)構(gòu)模糊、間質(zhì)水腫;對(duì)照組及假手術(shù)組細(xì)胞形態(tài)正常,分布均勻,未見(jiàn)皮質(zhì)部蒼白梗死。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)切片(HE染色,400倍)

2.2 各組炎癥因子水平比較 見(jiàn)表1。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的IL-8、TNF-α水平相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較,模型組IL-8、TNF-α水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,西藥組和聯(lián)合組IL-8、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05);與西藥組比較,聯(lián)合組IL-8、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。

表1 各組大鼠IL-8、TNF-α水平比較(ng/L,±s)

表1 各組大鼠IL-8、TNF-α水平比較(ng/L,±s)

與對(duì)照組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與西藥組比較,△P<0.05。下同

TNF-α組別n IL-8 6.14±0.86 6.82±1.04 22.31±1.58*11.59±1.25*#8.37±1.12#△對(duì)照組假手術(shù)組模型組西藥組聯(lián)合組10 10 10 10 10 18.40±3.91 19.12±4.03 43.52±15.48*30.36±12.35*#22.27±9.56#△?

2.3 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的SOD、MDA水平比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較,模型組SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,西藥組和聯(lián)合組SOD水平均顯著升高、MDA水平均顯著降低(P<0.05);與西藥組比較,聯(lián)合組SOD水平顯著升高、MDA水平明顯降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠SOD、MDA水平比較(±s)

表2 各組大鼠SOD、MDA水平比較(±s)

組別對(duì)照組假手術(shù)組模型組西藥組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10 SOD(U/L)138.41±8.03 137.36±8.17 74.52±5.28*100.86±6.42*#123.77±7.86#△MDA(μmol/L)6.14±0.87 6.79±0.94 21.64±1.36*11.32±1.23*#8.27±1.02#△

2.4 各組神經(jīng)功能指標(biāo)比較 見(jiàn)表3。對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠的S100B、BDNF水平比較無(wú)明顯差異(P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組BDNF水平顯著降低、S100B水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,西藥組和聯(lián)合組BDNF水平均顯著升高、S100B水平均明顯降低(P<0.05);與西藥組比較,聯(lián)合組血清BDNF水平明顯升高、S100B水平顯著降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠S100B、BDNF水平比較(ng/mL,±s)

表3 各組大鼠S100B、BDNF水平比較(ng/mL,±s)

組別對(duì)照組假手術(shù)組模型組西藥組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10 S100B 0.54±0.17 0.58±0.15 2.52±0.28*1.46±0.23*#0.83±0.19#△BDNF 6.82±0.31 6.75±0.34 2.73±0.46*4.32±0.38*#5.94±0.22#△

3 討 論

急性腦梗死具有發(fā)病急、致殘率和死亡率均較高而治愈率低等特點(diǎn)[6],嚴(yán)重威脅人類的生命健康。ACI發(fā)病后腦組織會(huì)發(fā)生不可逆損傷,嚴(yán)重者還可能出現(xiàn)腦組織缺血性壞死,易引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能性異常[7]。

研究發(fā)現(xiàn),腦缺血性損傷的發(fā)生發(fā)展與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)均密切相關(guān)[8]。氧化應(yīng)激系指機(jī)體受到刺激后,氧化和抗氧化能力失衡,傾向于氧化,導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn),蛋白酶分泌增加,進(jìn)而產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物,是自由基大量堆積所致的負(fù)作用,其和炎癥通常緊密相連、相伴而生[9]。研究證明,氧自由基的大量堆積是引發(fā)急性缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要原因之一[10],所以有效減少氧自由基,減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)并抑制炎性反應(yīng)是治療急性腦梗死的重要手段。SOD作為體內(nèi)重要的抗氧化酶,是氧自由基的自然天敵,是清除氧自由基的頭號(hào)物質(zhì),可對(duì)抗甚至逆轉(zhuǎn)氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害,修復(fù)自由基引起的細(xì)胞損傷。有研究表明,SOD能通過(guò)磷酸化AKT減弱缺血損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[11]。

當(dāng)生物體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基時(shí),會(huì)大量消耗SOD,使SOD水平降低;而MDA是由細(xì)胞膜中脂質(zhì)氧化后形成的,是氧化應(yīng)激反應(yīng)與氧自由基升高的重要標(biāo)志物,因此MDA水平的高低直接反映了生物體內(nèi)氧自由基的水平以及氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度,是評(píng)估氧自由基水平及氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)[12]。目前臨床已逐漸重視腦缺血早期對(duì)腦組織的炎性損傷,意識(shí)到IL-8和TNF-α等炎癥因子在誘發(fā)炎性反應(yīng)的過(guò)程中起著重要作用[13]。其中IL-8屬于趨化因子家族的一種細(xì)胞因子,利于趨化免疫效應(yīng)細(xì)胞,通過(guò)對(duì)中性粒細(xì)胞的細(xì)胞趨化作用而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié),并能促使多種生物活性物質(zhì)釋放[14]。TNF-α是一種單核因子,屬前炎細(xì)胞因子,主要由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬,誘導(dǎo)肝細(xì)胞急性期蛋白合成,是重要的炎癥因子,且IFN-γ對(duì)TNF-α的生成有刺激作用。當(dāng)腦組織缺氧缺血時(shí),TNF-α水平將會(huì)升高,并能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-8,引發(fā)炎性反應(yīng),進(jìn)而相互影響,共同作用造成細(xì)胞損害[15]。因此,有效降低IL-8和TNF-α等炎癥因子水平對(duì)減輕炎性反應(yīng)、控制炎性損傷有重要意義。

S100B蛋白是一種腦特異蛋白,主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞、垂體前葉細(xì)胞。當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí),S100B蛋白的釋放量會(huì)明顯增加,并進(jìn)一步刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子及NO,誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡而損傷神經(jīng)功能,因而S100B蛋白水平的高低與急性腦缺血損傷的程度密切相關(guān)[16]。BDNF是在腦內(nèi)合成的一種內(nèi)源性腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá),對(duì)神經(jīng)元的分化和生長(zhǎng)再生具有維持和促進(jìn)作用。ACI發(fā)病后,在神經(jīng)元損傷的早期,BDNF釋放量會(huì)顯著增加,以保護(hù)神經(jīng)功能[17];但后期,當(dāng)神經(jīng)元損傷因素持續(xù)大量存在時(shí),會(huì)過(guò)度消耗BDNF,同時(shí)還能使BDNF合成減少,導(dǎo)致生物體內(nèi)BDNF水平降低。故提高BDNF水平對(duì)減輕腦缺血損傷后期神經(jīng)元損傷,降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡有著重要作用。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為ACI屬于“中風(fēng)病”范疇,其病機(jī)主要為氣血不足、血瘀阻絡(luò),多因氣滯血行不暢或氣虛運(yùn)血無(wú)力,導(dǎo)致腦絡(luò)痹阻而引發(fā)該病,因此益氣活血、行氣祛瘀通絡(luò)是治療該病的基本原則[18]。益氣活血通絡(luò)方以黃芪、黨參為君藥,益氣固表、補(bǔ)氣升陽(yáng);配以當(dāng)歸、丹參、川芎,活血化瘀、行氣止痛、祛風(fēng)通絡(luò);加赤芍、紅花、桃仁、地龍,以破血逐瘀、清熱涼血、通經(jīng)活絡(luò);配甘草以補(bǔ)脾益氣、緩急解毒、調(diào)和諸藥,達(dá)到益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[19-20],丹參可改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),且具有抗炎作用,能減輕炎癥因子對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷,并促進(jìn)組織修復(fù)再生,從而恢復(fù)神經(jīng)功能;川芎能抑制血小板聚集,增強(qiáng)纖溶系統(tǒng)活性,產(chǎn)生抗血栓作用,還能擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抑制神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng),降低血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡,促使中樞神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá),保護(hù)缺血損傷的神經(jīng)細(xì)胞;當(dāng)歸、紅花能抗血小板聚集,并擴(kuò)血管改善微循環(huán),保護(hù)腦神經(jīng)元;赤芍能緩解腦缺血后引起的腦組織損傷;桃仁可抗血栓形成;地龍中含有纖維蛋白酶和纖維蛋白原激活酶,具有一定的溶栓作用。

本研究發(fā)現(xiàn),手術(shù)組和假手術(shù)組大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)相比較,無(wú)顯著差異。與對(duì)照組比較,模型組IL-8、TNF-α水平顯著升高;與模型組比較,西藥組和聯(lián)合組IL-8、TNF-α水平顯著降低;與西藥組對(duì)比,聯(lián)合組各指標(biāo)顯著降低。與對(duì)照組比較,模型組SOD水平顯著降低、MDA水平顯著升高;與模型組比較,西藥組和聯(lián)合組SOD水平均顯著升高、MDA水平均顯著降低;與西藥組比較,聯(lián)合組SOD水平顯著升高、MDA水平顯著降低。與對(duì)照組比較,模型組BDNF水平顯著降低、S100B水平顯著升高;與模型組比較,西藥組和聯(lián)合組BDNF水平均顯著升高、S100B水平均顯著降低;與西藥組比較,聯(lián)合組BDNF水平顯著升高、S100B水平顯著降低。結(jié)果表明益氣活血通絡(luò)方能有效減輕炎癥,降低氧化應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),保護(hù)腦組織。

綜上所述,益氣活血通絡(luò)方可降低急性腦梗死模型大鼠IL-8、TNF-α等炎癥因子水平,減輕炎性反應(yīng);能有效升高SOD水平并降低MDA水平,改善氧化應(yīng)激反應(yīng);能緩解神經(jīng)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),保護(hù)缺血損傷腦組織。

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