譚 萍，陳建樺，姚紹嫦，李良波，黃榮韶**

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004，2.玉林師范學(xué)院圖書館 ，廣西玉林 537000； 3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530200)

0 引言

牛大力是豆科雞血藤屬植物美麗雞血藤(Calleryaspeciosa)的俗稱，分布在我國廣西、廣東、海南等地。牛大力性甘、平，具有強(qiáng)筋活絡(luò)的功效，在臨床上已被證實(shí)對(duì)多種慢性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核、慢性支氣管炎、腰肌勞損等疾病有治療作用[1]。民間大量使用牛大力做藥膳，其在兩廣地區(qū)得到廣泛應(yīng)用[1]。近幾年，學(xué)者對(duì)牛大力的研究不斷，在藥理方面取得了很大的進(jìn)展。近年來，由于大面積的采挖，牛大力野生資源逐漸枯竭，人工栽培成為保護(hù)牛大力資源的主要手段。在自然條件下，牛大力種子發(fā)芽催苗十分緩慢，根系不發(fā)達(dá)，發(fā)芽不整齊[2]，導(dǎo)致牛大力種苗不能滿足人工栽培的需求。因此，了解牛大力種子的生命活動(dòng)規(guī)律，促進(jìn)牛大力種子萌發(fā)與生長，是豐產(chǎn)豐收的重要保障。目前關(guān)于牛大力種子萌發(fā)方面的研究甚少，本文通過研究牛大力種子萌發(fā)的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)性分析，以揭示牛大力種子萌發(fā)的生理適應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

牛大力種子購于廣西博白縣頓谷鎮(zhèn)牛大力種植基地，并選取籽粒飽滿、質(zhì)地均勻的供試種子。品種由當(dāng)?shù)匾吧鷥?yōu)良單株經(jīng)人工繁育篩選而來。田間管理按常規(guī)方法。

1.2 方法

選取50粒大小一致的種子，在大棚進(jìn)行沙床試驗(yàn)，設(shè)3組重復(fù)共150粒種子，定期噴灑自來水以保持濕潤(使沙床持水量保持在80%左右)。根據(jù)種子萌發(fā)過程的差異，確定采樣時(shí)間。在種子萌發(fā)初期各項(xiàng)生理指標(biāo)只有微小的變化，所以前期取樣時(shí)間間隔長；隨著種子萌發(fā)，生長速率加快，生理變化明顯，所以在后期縮短了取樣間隔時(shí)間。具體如下：分別在種子萌發(fā)后0，10，17，22，26，30，33，36，40 d收集萌發(fā)種子的子葉和胚根。

1.3 生理生化指標(biāo)測(cè)定

可溶性糖含量采用的苯酚法[3]測(cè)定(mg·g-1)。根據(jù)超氧化物歧化酶(SOD)抑制氮藍(lán)四唑(NBT)在光下的還原作用測(cè)定SOD活性[4]，以抑制NBT光化學(xué)反應(yīng)的50%為一個(gè)酶活性單位(U·g-1FW)。根據(jù)過氧化物酶(POD)氧化愈創(chuàng)木酚的生成物的量(吸光系數(shù)為26.6 mmol·L-1·cm-1)來測(cè)定POD活性[5]，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長470 nm處光密度值的變化，以0.01 △OD470/min為一個(gè)酶活單位(U·g-1FW)。過氧化氫酶(CAT)酶活性測(cè)定采用紫外分光光度法[6]，測(cè)定240 nm下的吸光值變化，以0.01 △OD240/min為一個(gè)酶活單位(U·g-1FW)。游離氨基酸含量采用茚三酮溶液顯色法[7]測(cè)定(mg/100 g)。蛋白酶活性的測(cè)定采用甲醛滴定法[8]，根據(jù)樣品(氨基氮)所消耗的NaOH量計(jì)算酶的活性，酶活性單位為mg·g-1·h-1。利用酚類物質(zhì)與三氯化鐵溶液反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色化合物的原理，測(cè)定提取液中總酚含量(μg·g-1)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel和SAS for Windows統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛大力種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量的變化

在牛大力種子萌發(fā)過程中，其可溶性糖含量隨著萌發(fā)的進(jìn)行呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，在第22 d時(shí)達(dá)到峰值0.430 mg·g-1，為0 d的1.79倍，與其他階段呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.05)(表1，圖1)。22 d后可溶性糖含量快速下降，第40 d達(dá)到最低值，只有最初(0 d)的29.3%。

表1 牛大力種子萌發(fā)過程中各生理指標(biāo)的變化

Table 1 Changes of physiological indexes during the germination ofC.speciosaseeds

萌發(fā)時(shí)間Germinate time (d)可溶性糖Soluble sugar(mg·g-1)超氧化物歧化酶SOD(U·g-1 FW)過氧化物酶POD(U·g-1 FW)過氧化氫酶CAT(U·g-1 FW)游離氨基酸Amino acid(mg/100 g)蛋白酶Endopeptidase(mg·g-1·h-1)總酚Total polyphenols(μg·g-1)00.23987.01120.00220.0061.6570.467 77.816*100.291109.89180.00380.0060.1870.53353.190170.395196.89 240.00*540.0060.4520.70044.52222 0.430* 300.28*220.00 810.00*67.978 1.101*19.357260.323281.92130.00560.0051.1910.93426.713300.190211.02125.00460.0048.1330.98413.550330.115246.33100.00280.0058.1290.86820.132360.146213.28155.00140.0055.8060.63414.712400.070248.59120.00160.00121.015*0.4013.431

注：*表示在P<0.05水平相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

Note:* indicates that the correlation is statistically significant at the level ofP<0.05

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Different lowercase letters show significant differences (P<0.05)

圖1 牛大力種子萌發(fā)過程中可溶性糖含量的變化

Fig.1 Changes of the content of soluble sugar during the germination ofC.speciosaseeds

2.2 牛大力種子萌發(fā)過程中抗氧化酶活性的變化

2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化

在牛大力種子萌發(fā)過程中，超氧化物歧化酶活性在0—22 d上升速率最快，第22 d時(shí)SOD活性最高，達(dá)到304.24 U·g-1FW，為0 d的3.45倍，與其他階段的酶活呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。22—30 d開始有明顯的下降，30—40 d則呈現(xiàn)上升后下降再上升的趨勢(shì)(表1，圖2)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Different lowercase letters show significant differences (P<0.05)

圖2 牛大力種子萌發(fā)過程中超氧化物酶活性的變化

Fig.2 Dynamic changes of the activities of SOD during the germination ofC.speciosaseeds

2.2.2 過氧化物酶(POD)活性的變化

隨著種子萌發(fā)過程的進(jìn)行，牛大力種子的POD活性總體呈先上升后下降的變化趨勢(shì)(表1，圖3)。第17 d時(shí)，POD活性達(dá)到頂峰，為240 U·g-1FW，與其他階段的酶活呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，而22 d后活性緩慢下降，在第33—40 d呈現(xiàn)出上升而后下降的態(tài)勢(shì)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Different lowercase letters show significant differences (P<0.05)

圖3 牛大力種子萌發(fā)過程中過氧化物酶活性的變化

Fig.3 Dynamic changes of the activities of POD during the germination ofC.speciosaseeds

2.2.3 過氧化氫酶(CAT)活性的變化

在牛大力種子整個(gè)萌發(fā)過程中，其CAT活性總體呈先上升后下降的變化特征(表1，圖4)。種子萌發(fā)0—22 d呈上升趨勢(shì)，第22 d達(dá)到最大值810 U·g-1FW，與其他階段的酶活呈現(xiàn)極顯著差異(P<0.05)。22 d后持續(xù)下降，到36 d又開始緩慢回升。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Different lowercase letters show significant differences (P<0.05)

圖4 牛大力種子萌發(fā)過程中過氧化氫酶活性的變化

Fig.4 Dynamic changes of the activities of CAT during the germination ofC.speciosaseeds

2.3 牛大力種子萌發(fā)過程中游離氨基酸含量的變化

牛大力種子萌發(fā)過程中，游離氨基酸的含量呈現(xiàn)先升后減再陡然上升的趨勢(shì)(表1，圖5)。36—40 d快速增加，40 d時(shí)達(dá)到最大值121.015 mg/100 g，與其他階段的酶活呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。

2.4 牛大力種子萌發(fā)過程中蛋白酶活性的變化

隨著種子萌發(fā)的推進(jìn)，蛋白酶的活性呈先上升后下降的變化趨勢(shì)(表1，圖6)。牛大力種子在0—22 d的吸漲階段，蛋白酶活性不斷升高；在胚根突破種皮(22 d)時(shí)，其活性達(dá)到最高值1.101 mg·g-1·h-1，與其他階段的酶活呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，22 d后蛋白酶活性開始持續(xù)下降。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Different lowercase letters show significant differences (P<0.05)

圖5 牛大力種子萌發(fā)過程中游離氨基酸含量的變化

Fig.5 Changes of the content of amino acid during the germination ofC.speciosaseeds

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Different lowercase letters show significant differences (P<0.05)

圖6 牛大力種子萌發(fā)過程中蛋白酶活性的變化

Fig.6 Dynamic changes of the activities of endopeptidase during the germination ofC.speciosaseeds

2.5 牛大力種子萌發(fā)過程中總酚含量的變化

由圖7可知,牛大力種子在萌發(fā)過程中總酚的含量整體上呈降低趨勢(shì)。種子萌發(fā)初期0—22 d總酚含量降幅非常明顯，從77.81 μg·g-1下降至19.36 μg·g-1，下降了75.12%。隨后變化趨勢(shì)沒有明顯的規(guī)律性，但在總體上呈下降趨勢(shì)。在40 d時(shí)，總酚含量下降到最低值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Different lowercase letters show significant differences (P<0.05)

圖7 牛大力種子萌發(fā)過程中總酚含量的變化

Fig.7 Changes of the total polyphenols content during the germination ofC.speciosaseeds

2.6 牛大力種子萌發(fā)過程中各生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

牛大力種子萌發(fā)過程中，種子的各生理指標(biāo)的相關(guān)性分析見表2?？扇苄蕴呛颗c過氧化物酶活性、過氧化氫酶活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，這表明牛大力種子萌發(fā)過程中物質(zhì)能量代謝與酶的作用有很大關(guān)系?？偡雍颗cSOD活性存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與CAT及蛋白酶活性也存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。一些酚類物質(zhì)能抑制種子的萌發(fā)，且主要原因是抑制種子萌發(fā)所需的關(guān)鍵酶類，說明牛大力種子中含有抑制萌發(fā)的酶類，但究竟是酚類物質(zhì)的哪些組分抑制萌發(fā)還有待進(jìn)一步研究[8-9]。

表2 牛大力種子萌發(fā)過程中各生理指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系

Table 2 Correlation coefficients among physiological indexes during the germination ofC.speciosaseeds

指標(biāo)Index總酚Total polyphenols游離氨基酸Amino acid超氧歧化物酶SOD過氧化物酶POD過氧化氫酶CAT蛋白酶Endopeptidase可溶性糖Soluble sugar0.384-0.3880.0640.800**0.858**0.436總酚Total polyphenols-0.322-0.811**0.162-0.032-0.375游離氨基酸Amino acid0.167-0.109-0.316-0.522超氧歧化物酶SOD0.0490.4440.652過氧化物酶POD0.6210.177過氧化氫酶CAT0.768*

注：*和**表示分別在P<0.05，P<0.01水平相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

Note:* and ** indicate that the correlation is statistically significant at the level ofP<0.05 andP<0.01

3 討論

3.1 可溶性糖的變化

種子萌發(fā)是蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程，各類酶參與調(diào)控[10]。其中，可溶性糖含量的動(dòng)態(tài)變化可說明植物體內(nèi)碳水化合物的運(yùn)轉(zhuǎn)與分配情況，是保障種子正常萌發(fā)的基礎(chǔ)[11]。牛大力種子萌發(fā)過程中，淀粉等高分子多糖降解為可溶性糖，以提供種子萌發(fā)的呼吸底物，可溶性糖含量的高低與呼吸的消耗速率有關(guān)[12]，其可溶性糖含量趨勢(shì)呈先高后低的變化，這是因?yàn)樵诜N子萌發(fā)后期的呼吸作用增強(qiáng)，導(dǎo)致了可溶性糖消耗增加[9]，這與李磊[13]對(duì)掌木葉種子發(fā)芽的研究結(jié)果相類似。牛大力種子萌發(fā)初期代謝活動(dòng)增強(qiáng)，淀粉分解成小分子糖，為種子萌發(fā)提供所需的營養(yǎng)，在第22 d時(shí)達(dá)到頂峰。在種子萌發(fā)后期，可溶性糖被更多用以合成或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，為幼苗生長提供能量，所以出現(xiàn)含量下降的趨勢(shì)。

3.2 抗氧化酶活性的變化

大量研究表明，SOD、POD、CAT酶在植物體內(nèi)起到保護(hù)植物細(xì)胞功能的作用，通過調(diào)節(jié)酶的活性，維持活性氧化代謝和植物的正常生長發(fā)育[9]。林瓊等[14]對(duì)刺槐種子研究表明，在種子萌發(fā)過程中，保護(hù)酶的活性逐漸升高，達(dá)到峰值后逐漸下降。柴家榮[15]對(duì)白肋煙種子萌發(fā)過程的研究發(fā)現(xiàn)，POD等保護(hù)酶的活性隨萌發(fā)進(jìn)程均呈上升趨勢(shì)，直到最高峰值開始下降。孫穎等[12]對(duì)北黃花菜種子萌發(fā)的研究發(fā)現(xiàn)，北黃花菜的SOD、POD、CAT酶活性在種子萌發(fā)期間均表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，并且在種子萌發(fā)初期酶活性變化更加明顯。本研究中，牛大力種子在萌發(fā)初期(0—22 d) SOD、POD、CAT酶活性均表現(xiàn)出顯著增加，這3種酶都參與了活性氧代謝，以及時(shí)有效地清除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)，因此都呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。當(dāng)胚芽開始伸長生長，3種酶活性呈降低趨勢(shì)，可能是因?yàn)榕４罅ΨN子在胚芽開始伸長生長時(shí)，細(xì)胞防御功能減弱。該結(jié)果與其他作物種子萌發(fā)初期的情況相似。

3.3 游離氨基酸的變化

相關(guān)性分析可知，游離氨基酸與蛋白酶呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這說明在萌發(fā)期間，蛋白酶不斷催化蛋白質(zhì)分解為氨基酸，導(dǎo)致氨基酸含量增加[15]。在種子萌發(fā)初期,由于蛋白質(zhì)分解強(qiáng)烈，致使氨基酸的含量增加；萌發(fā)后期，種子逐漸從異養(yǎng)過渡到自養(yǎng),而這時(shí)候蛋白質(zhì)的降解仍在進(jìn)行，一些合成的氨基酸積累在子葉中,所以發(fā)芽后期蛋白質(zhì)降解減緩但氨基酸含量仍然明顯增加[13]。在本研究中，游離氨基酸含量呈先上升后下降再迅速上升的趨勢(shì)，這與楊玉珍等[16]對(duì)銀杏種子萌發(fā)的研究結(jié)果相類似。

3.4 蛋白酶活性的變化

蛋白質(zhì)的降解，相關(guān)酶的分布，種子在萌發(fā)過程中酶的激活、合成及運(yùn)輸之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性[17]。在本實(shí)驗(yàn)中，牛大力種子萌發(fā)初期代謝活動(dòng)旺盛，蛋白酶活性增高，大量蛋白質(zhì)被降解為氨基酸參與代謝活動(dòng)；萌發(fā)中期時(shí)代謝活動(dòng)減弱，蛋白酶的活性同時(shí)也減弱，游離氨基酸含量因此出現(xiàn)下降趨勢(shì)；萌發(fā)后期幼芽開始生長，代謝活動(dòng)增強(qiáng)，參與各種代謝的酶類也增多，游離氨基酸含量又出現(xiàn)快速增加的現(xiàn)象。這是因?yàn)樽尤~中的大分子蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下被降解為蛋白質(zhì)片段或氨基酸,而代謝中釋放的能量用于細(xì)胞分裂、生長和分化，使種子順利萌發(fā)和形成幼苗[17]。

3.5 總酚的變化

在牛大力種子萌發(fā)過程中，總酚含量總體呈下降趨勢(shì)，總酚含量與SOD活性存在顯著負(fù)相關(guān)，與CAT及蛋白酶活性也存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明牛大力種子中含有抑制種子萌發(fā)的酶類。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以牛大力種子為供試材料，對(duì)牛大力種子萌發(fā)過程中的生理生化變化進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明：在牛大力種子萌發(fā)過程中，可溶性糖含量、SOD、POD、CAT和蛋白酶活性呈先升后降的變化，游離氨基酸呈先升后降再陡然上升趨勢(shì)，總酚含量整體上呈降低趨勢(shì)。

牛大力種苗的質(zhì)量與植株中后期生長強(qiáng)弱尤其是根系生長有較大聯(lián)系。本研究較系統(tǒng)地闡述了牛大力種子萌發(fā)過程中的生理生化變化特征，為進(jìn)一步開展牛大力種苗質(zhì)量研究提供了一定的理論支撐。由于萌發(fā)過程中代謝活動(dòng)的復(fù)雜性，在大田栽培牛大力時(shí)應(yīng)該要先培育壯苗，提高植株前中期生理活性，為提高牛大力栽培產(chǎn)量和質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。